Tipagem e estado físico de papilomavírus humano por hibridização in situ em lesões intra-epiteliais do colo uterino

OBJETIVO: realizar estudo molecular (hibridização in situ) de pacientes com lesões intra-epiteliais do colo uterino, visando investigar a freqüência e o estado físico do papilomavírus humano (HPV). MÉTODOS: cortes histológicos de biopsias do colo uterino de 84 pacientes foram avaliados pela hibridização in situ, com sonda de amplo espectro, que permite identificação dos HPVs dos tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45 e 56, e com sondas específicas para HPV dos tipos 6, 11, 16, 18, 31 e 33. Os padrões físicos de marcação do DNA dos HPV encontrados foram: epissomal, quando todo o núcleo ficou corado pela biotina (marrom); integrado, onde se visualizaram um ou dois pontos marrons no núcleo hibridizado, ou misto, com a associação dos dois padrões anteriores. Das 84 pacientes avaliadas, 31 (36,9%) tinham lesões intra-epiteliais de baixo grau (LIE-BG) e 53 (63,1%) tinham lesões intra-epiteliais de alto grau (LIE-AG) ao exame histológico. Para a análise estatística foi empregado o teste exato de Fisher. RESULTADOS: do total dos casos, 46 (54,7%) foram positivos para DNA de HPV pela sonda de amplo espectro. Na tipagem dos vírus, o HPV-16 foi mais freqüente nas LIE-AG, com 12 casos - 22,6% (p<0,05). As freqüências dos outros tipos de HPV não foram diferentes entre os casos com LIE-BG e LIE-AG. Na avaliação do estado físico do DNA de HPV, os percentuais de padrões epissomais (mais comum nas LIE-BG) e integrados não foram diferentes entre os dois grupos. Houve predomínio do tipo misto nas LIE-AG em relação às LIE-BG: 26,4% e 3,2%, respectivamente (p<0,01). O estado físico do DNA do HPV, integrado ao da célula hospedeira, foi mais freqüente nos casos mais graves. CONCLUSÕES: o HPV-16 foi o mais freqüente nas LIE-AG. As freqüências dos outros tipos de HPV não foram diferentes quando se compararam os casos com LIE-BG e LIE-AG. O estado físico do DNA do HPV, integrado ao da célula hospedeira, foi mais freqüente nos casos mais graves.

Avaliação de métodos alternativos à citologia no rastreamento de lesões cervicais: detecção de DNA-HPV e inspeção visual

OBJETIVO: avaliar o desempenho da citologia oncológica (CO), de captura híbrida II (CH II) e da inspeção visual com ácido acético na detecção de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas cervicais. MÉTODOS: 2281 mulheres foram submetidas a exame clínico além da coleta de material para citologia, para CH II para detecção de DNA-HPV. Foi feita a inspeção visual do colo após aplicação do ácido acético a 5% (IVA). As mulheres com pelo menos um exame positivo eram convocadas para colposcopia, que também foi realizada em 420 mulheres com todos os exames normais. O desempenho dos testes foi calculado utilizando como padrão ouro a colposcopia com ou sem biopsia. RESULTADOS: a CO foi anormal em 209 mulheres (9,2%); a CH II foi positiva em 399 (17,5%) e em 249 (10,9%) foram encontradas alterações na IVA. Entre as 2281 mulheres avaliadas, 671 (29,4%) apresentaram pelo menos um resultado de exame positivo, embora apenas 82 (3,6%) apresentassem doença confirmada histologicamente (50 NIC1, 20 NIC2, sete NIC3 e cinco carcinomas invasores). As sensibilidades da IVA e da CH II foram semelhantes e significativamente maiores que a da CO. A especificidade da CO foi maior que a da IVA e da CH II. Nos casos com resultado de CO negativo, a IVA apresentou melhor desempenho comparada à CH II. CONCLUSÃO: o desempenho da CO associada à IVA foi melhor que o da CO associada à CH II e do que o da CO isolada.

Pesquisa da prevalência do papilomavírus humano em amostras de tecido endometrial normal e com carcinoma pela técnica de PCR

OBJETIVO: comparar a prevalência da presença do DNA do papilomavírus humano (HPV) pela técnica de PCR em amostras de tecido endometrial normal e com carcinoma endometrial de mulheres submetidas a tratamento cirúrgico (histerectomia) ou carcinoma endometrial e doença benigna. MÉTODOS: trata-se de um estudo observacional do tipo caso-controle onde foram avaliadas 100 mulheres (50 com endométrio normal e 50 com carcinoma endometrial) quanto a presença do DNA do HPV em amostra tecidual conservada em blocos de parafina, pelo método de PCR. Foram excluídos os casos de carcinoma endometrial cujo sítio primário da lesão era duvidoso ou com história prévia ou atual de lesões pré-neoplásicas ou carcinoma do trato genital inferior. Variáveis como idade, tabagismo, trofismo endometrial, diferenciação escamosa e grau de diferenciação tumoral foram também avaliadas. RESULTADOS: o risco relativo estimado da presença do HPV foi o mesmo nas mulheres com e sem carcinoma endometrial. O HPV foi detectado em 8% dos casos de carcinoma e 10% no endométrio normal. Apesar de o HPV ter sido detectado 3,5 vezes mais em mulheres fumantes no grupo sem carcinoma, não houve diferença estatística. A presença do HPV também não esteve correlacionada com a idade das mulheres, trofismo endometrial, diferenciação escamosa e grau de diferenciação tumoral. Os HPV 16 e 18 (5 dos casos com o tipo 16 e 4 com o tipo 18) foram os vírus mais freqüentemente encontrados, tanto no tecido endometrial normal, quanto no carcinomatoso. Nenhum vírus de baixo risco oncogênico foi detectado nas amostras. CONCLUSÃO: o HPV está presente no tecido endometrial de mulheres com carcinoma endometrial na mesma proporção que nas com tecido endometrial normal, não se demonstrando a possível associação deste vírus no desenvolvimento do carcinoma endometrial.

Vaginose bacteriana e DNA de papilomavírus humano de alto risco oncogênico em mulheres submetidas a conização com alça diatérmica para tratamento de neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau

OBJETIVO: avaliar a associação entre vaginose bacteriana (VB), DNA de papilomavírus humano (HPV) de alto risco e anormalidades citopatológicas cervicais em mulheres submetidas a conização diatérmica devido a neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau (NIC 2 ou 3). MÉTODOS: estudo clínico descritivo, no qual foram incluídas 81 mulheres submetidas a conização diatérmica devido a NIC 2 ou 3. A citologia (CO) inicial foi colhida na época da realização da biópsia dos casos suspeitos e também foi utilizada para verificar a presença de VB. Antes da conização diatérmica foi coletado material para a detecção de DNA de HPV de alto risco, por meio da captura de híbridos II (CH II). Após a conização diatérmica foi agendado retorno em 4 meses, no qual eram realizadas novas coletas de CO e de CH II. Vinte e sete mulheres apresentaram VB e 54 não apresentaram esta alteração. A análise estatística foi realizada por meio do cálculo dos odds ratios (OR) para as relações entre a detecção do HPV e a presença de anormalidades citológicas com a presença de VB, antes e após a conização, considerando-se intervalos de confiança de 95% (IC 95%). RESULTADOS: a detecção de DNA de HPV de alto risco antes da conização foi semelhante nos dois grupos (89%). Após a conização, esta detecção foi igual a 26 e 18%, respectivamente, nos grupos com e sem VB (OR=1,5 IC 95% 0,5 a 4,6). Ainda após a conização, 41% das pacientes com VB e 20% das sem VB apresentaram anormalidades citológicas (OR=2,7; IC 95% 1,0 a 7,4). Analisando-se exclusivamente as 22 mulheres com anormalidades citológicas em seus exames realizados aproximadamente quatro meses após a conização diatérmica, 83% daquelas com VB também apresentaram testes positivos para DNA de HPV, comparadas a 50% daquelas sem VB (OR=5,0; IC 95% 0,5 a 52,9). CONCLUSÃO: mulheres com VB apresentaram maior proporção de anormalidades citopatológicas depois da conização em relação às mulheres sem VB, ainda que estatisticamente não significativa. Esta associação não foi relacionada à presença do DNA de HPV de alto risco.

Determinação precoce do sexo fetal pela análise do DNA no plasma materno

OBJETIVO: avaliar a possibilidade do diagnóstico precoce do sexo fetal no plasma materno pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) a partir da 5ª semana de gestação. MÉTODOS: nesse estudo prospectivo foi coletado sangue periférico de gestantes com feto único a partir da 5ª semana de gestação. Após centrifugação do sangue, 0,4 mL de plasma foi separado para extração de DNA fetal. O DNA foi analisado em duplicata por PCR em tempo real para duas regiões genômicas (uma do cromossomo Y e outra comum a ambos os sexos) pelo método de TaqMan®, o qual utiliza um par de primers e uma sonda fluorescente. Foram excluídos da amostragem os casos que evoluíram para aborto. Para o cálculo da sensibilidade e especificidade, usamos o método de comparação com padrão-ouro, que foi o sexo ao nascimento. RESULTADOS: foram realizados 79 exames de DNA fetal no plasma materno de 52 gestantes. O resultado dos exames foi comparado com o sexo da criança após o parto. O índice de acerto conforme a idade gestacional foi de 92,6% (25 de 27 casos) na 5ª semana, conferindo sensibilidade de 87% e 95,6% (22 de 23 casos) na 6ª semana, com sensibilidade de 92%. A partir da 7ª semana de gestação o acerto foi em 100% (29 de 29 casos). A especificidade foi de 100% independente da idade gestacional. CONCLUSÕES: a técnica de PCR em tempo real para detecção do sexo fetal a partir da 5ª semana no plasma materno possui boa sensibilidade e excelente especificidade. Houve concordância do resultado em 100% dos casos em que o diagnóstico foi masculino, independente da idade gestacional, e no caso de feminino, a partir da 7ª semana de gestação.

Desenvolvimento e avaliação de novas estratégias de imunização contra colibacilose suína

Colibacilose suína causada por Escherichia coli enterotoxigênica continua sendo um dos principais problemas sanitários na criação de suínos. A tecnologia do DNA recombinante proporciona a possibilidade de desenvolvimento de novas estratégias de imunização. Neste trabalho é descrito o desenvolvimento de uma vacina de subunidade através da produção e purificação da proteína FaeC da fímbria de E. coli K88. O gene que codifica este antígeno foi amplificado por PCR e clonado em um vetor de expressão em E. coli, fusionado a uma cauda de histidinas. A proteína recombinante expressa por esta bactéria foi purificada, e depois de quantificada foi utilizada para imunizar camundongos. Paralelamente a isso, o mesmo gene foi clonado no vetor de expressão em célula eucariótica, introduzindo a seqüência de Kozak para favorecer a tradução deste gene em células musculares. O plasmídio resultante, denominado pUP310, foi produzido em larga escala e também utilizado na imunização de camundongos. A resposta imune induzida por ambas formas de imunizações foi monitorada por ELISA, onde o antígeno utilizado foi a proteína FaeC purificada. Houve indução de resposta imune nos camundongos inoculados com pUP310 e FaeC purificada. Foi possível detectar anticorpos anti-FaeC 42 dias após a primeira inoculação e este título foi aumentando, sendo ainda detectável 7 meses após a primeira inoculação. Conclui-se que pUP310 e FaeC recombinante são candidatos potenciais para imunização de suínos contra E. coli K88.

Genotype characterization of Haematobia irritans from different Brazilian geographic regions based on randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis

Blood-sucking diptera are important parasites in bovine production systems, especially regarding confinement conditions. Haematobia irritans, the horn fly, is one of the most troublesome species within bovine production systems, due to the intense stress imposed to the animals. An important aspect while studying the variability within a species is the study of the geographic structure of its populations and, attempting to find out the genetic flow of Brazilian populations of horn fly, the RAPD technique, which is suited for this purpose, has been used. The use of molecular markers generated from RAPD made it possible to identify the geographic origin of samples from different Brazilian geographic regions, as well as to estimate the genotypic flow among the different Brazilian populations of the horn fly.

Meningoencefalite por herpesvírus bovino-5

A meningoencefalite por herpesvírus bovino-5 (BoHV-5) é uma doença infecto-contagiosa, aguda ou subaguda, geralmente fatal e que afeta principalmente bovinos jovens submetidos a situações de estresse. A doença tem sido freqüentemente diagnosticada em várias regiões do Brasil e em outras partes do mundo. BoHV-5 é um vírus da família Herpesviridae e subfamília Alphaherpesvirinae e possui como genoma uma molécula de DNA fita dupla. Esses vírus são caracterizados por rápida replicação em cultivo, que resulta em lise das células infectadas, e afetam várias espécies de hospedeiros, estabelecendo latência principalmente em neurônios de gânglios sensoriais. A transmissão de BoHV-5 ocorre principalmente por contato direto ou indireto entre bovinos. Após a replicação primária nas mucosas oral, nasal, ocular e orofaríngea, o vírus invade as terminações nervosas e é transportado até os neurônios de gânglios sensoriais, onde replica ativamente e estabelece latência. A invasão viral do encéfalo pode resultar em replicação viral massiva e produção de doença neurológica. A maioria dos bovinos que desenvolvem doença neurológica morre em decorrência de meningo-encefalite, porém alguns podem desenvolver infecção subclínica e, após recuperação, permanecerem portadores da infecção latente. A disseminação viral nos rebanhos é facilitada em situações de grande concentração de animais, introdução de bovinos e desmame de lotes de bezerros em idade que coincide com o decréscimo da imunidade passiva. Certas condições, naturais ou induzidas, podem reativar o vírus do estado latente e propiciar condições para sua transmissão e disseminação a outros indivíduos. A doença pode ocorrer na forma de surtos ou em casos isolados, com coeficientes de morbidade que podem variar de 0,05%-5%; a letalidade é quase sempre de 100%. Os sinais clínicos incluem depressão, descarga nasal e ocular, ranger de dentes, andar em círculos, cegueira, febre, movimentos de pedalagem, disfagia, dor abdominal, nistagmo, tremores, sialorréia, incoordenação, opistótono, pressão da cabeça contra objetos, quedas e convulsões. A evolução do quadro clínico pode variar de 1 a 15 dias. Achados de necropsia podem estar ausentes, mas normalmente se observa tumefação das porções rostrais do córtex telencefálico e achatamento das circunvoluções, com segmentos amarelados e amolecidos (malacia). Com a evolução da doença, essas áreas se tornam gelatinosas e acinzentadas, e em casos avançados ocorre o desaparecimento segmentar do córtex telencefálico frontal (lesão residual). Em muitos casos podem ser observados focos de malacia na substância cinzenta dos núcleos basais e do tálamo. Histologicamente observa-se meningoencefalite não-supurativa necrosante, principalmente no córtex telencefálico frontal, associada a inclusões intranucleares eosinofílicas em astrócitos e neurônios, embora a freqüência dessas inclusões seja irregular. O diagnóstico de meningoencefalite por BoHV-5 deve ser feito com base nos achados epidemiológicos, clínicos, de necropsia e histopatológicos, associados com o isolamento do vírus em cultivo celular células ou com detecção de antígenos virais em seções do encéfalo ou em células descamadas presentes nas secreções nasais. A identificação e caracterização de BoHV-5 pode ser realizada por meio de testes com anticorpos mono-clonais, reação em cadeia de polimerase (PCR) e por análise de restrição genômica. Não há tratamento específico para a meningoencefalite por BoHV-5. Como o BoHV-1 e o BoHV-5 são antigenicamente muito semelhantes, recomenda-se a vacinação com vacinas para BoHV-1 como forma de reduzir as perdas causadas por BoHV-5, principalmente durante surtos de doença neurológica. Adicionalmente, outras medidas podem ser adotadas para prevenir ou reduzir os prejuízos ocasionados pela enfermidade, como testar sorologicamente os bovinos a serem introduzidos nos rebanhos, minimizar situações de estresse, sobretudo no desmame, e isolamento dos bovinos afetados.

Febre catarral maligna em bovinos no Estado de Mato Grosso

Relatam-se a ocorrência em quatro propriedades rurais no Estado de Mato Grosso, de casos de febre catarral maligna (FCM) em bovinos criados em contato com ovinos. Todos os casos acompanhados tiveram evolução aguda e não se notou a recuperação dos bovinos. Dois casos ocorreram no município de Cuiabá. No primeiro, em janeiro de 2006, adoeceram e morreram 8 animais de um rebanho com 148 bovinos, no outro, morreu 1 de um rebanho com 30 animais em setembro de 2006. Um terceiro caso foi notado no município de Rondonópolis, onde morreram 3 de 160 bovinos em abril de 2007. O último caso relatado ocorreu no município de Cáceres no mês de setembro de 2007, morrendo 2 de 450 bovinos. O curso clínico variou de 4 a 7 dias. Os principais sinais clínicos foram hipertermia, lacrimejamento intenso, corrimento catarral nasal e oral, opacidade de córnea, sialorréia, diarréia, erosão da mucosa oral, nasal e genital, incoordenação motora, depressão e morte. Aumento do volume de linfonodos, erosões e úlceras na cavidade oral, nasal e esôfago foram achados constantes em quatro bovinos necropsiados. Arterite com degeneração fibrinóide em arteríolas e pequenas artérias, a necrose do epitélio de revestimento em vários órgãos e tecidos foram os principais achados histológicos. Através da técnica de reação em cadeia da polimerase "nested" (nPCR), o DNA do Herpesvírus Ovino tipo 2 foi detectado em tecido parafinado ou congelado em 3 de 4 bovinos deste estudo.

Clonal study of avian Escherichia coli strains by fliC conserved-DNA-sequence regions analysis

The clonal relationship among avian Escherichia coli strains and their genetic proximity with human pathogenic E. coli, Salmonela enterica, Yersinia enterocolitica and Proteus mirabilis, was determined by the DNA sequencing of the conserved 5' and 3'regions fliC gene (flagellin encoded gene). Among 30 commensal avian E. coli strains and 49 pathogenic avian E. coli strains (APEC), 24 commensal and 39 APEC strains harbored fliC gene with fragments size varying from 670bp to 1,900bp. The comparative analysis of these regions allowed the construction of a dendrogram of similarity possessing two main clusters: one compounded mainly by APEC strains and by H-antigens from human E. coli, and another one compounded by commensal avian E. coli strains, S. enterica, and by other H-antigens from human E. coli. Overall, this work demonstrated that fliC conserved regions may be associated with pathogenic clones of APEC strains, and also shows a great similarity among APEC and H-antigens of E. coli strains isolated from humans. These data, can add evidence that APEC strains can exhibit a zoonotic risk.

Development and evaluation of a recombinant DNA vaccine candidate expressing porcine circovirus 2 structural protein

Porcine circovirus 2 (PCV2) is generally associated with the porcine circovirosis syndrome, which is considered an important disease of swine and has potentially serious economic impact on the swine industry worldwide. This article describes the construction of a recombinant plasmid expressing the PCV2 structural protein and the evaluation of cellular and humoral immune responses produced by this recombinant vaccine in BALB/c mice. The vaccine candidate was obtained and analyzed in vivo, in an effort to determine the ability to induce a specific immune response in mice. DNA was extracted from a Brazilian PCV2 isolate and the gene coding for Cap protein was amplified by PCR and inserted into an expression plasmid. Groups of BALB/c mice were inoculated intra-muscularly and intradermally in a 15-day interval, with 100 µg and 50 µg of the vaccine construct, respectively. Another group was inoculated intramuscularly with 100 µg of empty plasmid, corresponding to the control group. Seroconversion and cellular response in BALB/c mice were compared and used for vaccine evaluation. Seroconversion was analyzed by ELISA. After a series of 3 immunizations the spleen cells of the immunized animals were used to perform lymphocyte proliferation assays. Seroconversion to PCV2 was detected by ELISA in the animals inoculated with the vaccine construct when compared with control groups. Lymphocyte proliferation assays showed a stronger cell proliferation in the inoculated animals compared with the control group. Thus, the vaccine candidate construct demonstrated to be able to induce both humoral and cellular responses in inoculated mice.

Nuclear and mitochondrial DNA markers in traceability of retail beef samples

Several characteristics are important in a traceability system of animal products, such as age at slaughter, breed composition, besides information of the productive chain. In general, the certification agent records information about the animals and the system which it came from, although cannot guarantee that the slaughtering, meat processing and distribution are error proof. Besides, there is a differential price, at least at the international market, based on sex and breed composition of the animals. Genetic markers allow identification of characteristics controlled in the beef cattle traceability program, as sex and breed composition, in order to correctly identify and appraise the final product for the consumer. The hypothesis of this study was that the majority beef samples retailed in the local market originate from female with a great participation of zebu breeds. Therefore, the objective of this work was to characterize retail beef samples with DNA markers that identify cattle sex and breed composition. Within 10 beef shops localized in Pirassununga, SP, Brazil, 61 samples were collected, all were genotyped as harboring Bos taurus mitochondrial DNA and 18 were positive for the Y chromosome amplification (male). For the marker sat1711b-Msp I the frequency of the allele A was 0.278 and for the marker Lhr-Hha I the frequency of the allele T was 0.417. The results of sat1711b-Msp I and Lhr-Hha I allelic frequencies are suggestive that the proportion of indicus genome compared with the taurine genome in the market meat is smaller than the observed in the Nellore breed. The procedure described in this study identified sex and subspecies characteristics of beef meat samples, with potential application in meat products certification in special as an auxiliary tool in beef cattle traceability programs.