Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Mécanismes de résistance aux inhibiteurs de CCR5

Le travail décrit dans ce manuscrit vise à caractériser les voies de résistance aux inhibiteurs de CCR5. Lors d’une première étape, nous avons développé un test phénotypique clonal nous permettant d’une part d’identifier le tropisme viral et d’autre part de mesurer la résistance aux inhibiteurs des CCR5. Des virus à tropisme R5 ou X4 représentant aussi peu que 0,4% d’un mélange de populations virales sont détectables par ce test, démontrant ainsi sa sensibilité. De plus, grâce à son approche clonale, cette technique permet de différencier les virus à tropisme double de populations virales mixtes. Par la suite, nous avons étudié l’impact des mutations dans les régions variables de la protéine gp120 de l’enveloppe du virus VIH-1 sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5. Pour ce faire, nous avons généré des virus résistants par passage des isolats CC1/85 et BAL, en présence de concentrations sous-inhibitrices de maraviroc (MVC) et vicriviroc (VCV). Après quelques passages du virus CC1/85 en présence de MVC, certaines sont apparues dans differentes régions de la gp120. Par la suite, nous avons sélectionné trois mutations dans les domaines variables de la gp 120, V169M en V2, L317W en V3 et I408T en V4 pour construire des virus contenant des mutations simples, doubles et triples afin d’évaluer la contribution des mutations individuelles ou combinées au phénotype de résistance. Nous avons déterminé la sensibilité de chaque mutant à MVC et VCV, le pourcentage d’infectivité et le tropisme viral par rapport au phénotype sauvage. Tous les mutants ont conservé le tropisme R5 et ont montré une diminution d’infectivité par rapport au contrôle. Nos résultats ont montré que les mutants qui portent des mutations en V4 (I408T) ont eu le plus d'impact sur la susceptibilité au MVC. Finalement, nous avons voulu évaluer l’activité antivirale d’un nouvel inhibiteur de CCR5, VCH-286 avec d’autres inhibiteurs de CCR5 tels que MVC et VVC ainsi que ses interactions avec des médicaments représentatifs de différentes classes d’antirétroviraux ARV employés en clinique pour traiter le HIV/SIDA., afin d’évaluer si ces médicaments pourraient être utilisés dans un même régime thérapeutique. Nous avons tout d’abord évalué indépendamment l’activité antivirale des trois inhibiteurs de CCR5 : VCH-286, MVC et VVC. Par la suite nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec MVC et VVC. Finalement nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec d’autres médicaments antirétroviraux. Ces études ont montré que VCH-286 est un inhibiteur puissant de CCR5 avec une activité antivirale in vitro de l’ordre du nanomolaire et des interactions médicamenteuses favorables avec la majorité des ARV tels que les inhibiteurs de transcriptase inverse, de protéase, d’intégrase, et de fusion employés en clinique pour traiter le VIH/SIDA et des interactions allant de synergie à l'antagonisme avec les inhibiteurs de CCR5. Nos résultats montrent que la plasticité de l’enveloppe virale du VIH-1 a des répercussions sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5, le tropisme et la possible utilisation de ces molécules en combinaison avec d’autres molécules appartenant à la même classe.

Combinaison d’approches classiques et de génétique inverse en vue d'une meilleure compréhension du tropisme et de l'activité oncolytique du réovirus de mammifères.

Le réovirus de mammifères se multiplie et détruit préférentiellement les cellules cancéreuses. Il est d’ailleurs actuellement à l’étude pour traiter divers types de cancers chez l’humain. L’objectif de cette étude était de mieux comprendre les diverses composantes impliquées dans le cycle viral de réovirus qui pourraient potentiellement être importantes dans le contexte d’optimisation de son potentiel oncolytique, ceci en utilisant une combinaison d’approches classiques ainsi que de génétique inverse.L’approche par persistance virale est classiquement utilisée pour identifier de nouveaux mutants de réovirus. Celle-ci a surtout mené à la sélection de mutants de décapsidation chez les cellules L929. Ici, des virus adaptés furent récupérés de cellules Vero (VeroAV) et contrairement aux autres mutants de persistance, ce virus possède des substitutions d’acides aminés sur les protéines mu1 et sigma1. L’approche par génétique inverse a permis de démontrer que la fixation de VeroAV sur les acides sialiques des cellules Vero était favorisée. Les substitutions sur sigma1 seraient principalement responsables de ce phénotype quoique le contexte de la substitution de mu1 puisse affecter l’infectivité du virus. Dans un deuxième volet, il a été remarqué que le virus de type sauvage utilisé pour la génétique inverse (T3DK) était plus sensible à l’interféron comparativement au virus de type sauvage de notre laboratoire (T3DS). Après séquençage complet du virus T3DS nous avons reconstruit, par génétique inverse, le virus T3DS. Nous avons donc pu poursuivre nos études sur le virus P4L-12 précédemment isolé au laboratoire par mutagenèse chimique. Il a été préalablement démontré que P4L-12 possède une meilleure réplication chez les cellules transformées et un blocage plus complet chez les cellules parentales, phénotype relié à une sensibilité accrue à l’interféron. Dans cette étude, des substitutions d’acides aminés sur les protéines sigma3, mu1, muNS et lambda2 furent identifiés. Nous avons démontré, par génétique inverse, que la substitution sur la protéine lambda2 était principalement responsable du phénotype de sensibilité à l’interféron. Ces approches de persistance ou de sélection de mutants sensibles à l’interféron, suivies d’une caractérisation par génétique inverse seront certainement utiles à une meilleure compréhension de réovirus et pourraient contribuer à améliorer son potentiel oncolytique.

Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 in bacterial biofilms.

The aim of this pilot project was to investigate association of viruses with bacterial biofilms. Our preliminary data indicate that important viral pathogens of swine, namely, porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2, can associate with and persist within bacterial biofilms for several days.

The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada.

Since late 2004, the swine industry in the province of Quebec has experienced a significant increase in death rate related to postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). To explain this phenomenon, 2 hypotheses were formulated: 1) the presence of a 2nd pathogen could be exacerbating the porcine circovirus 2 (PCV-2) infection, or 2) a new and more virulent PCV-2 strain could be infecting swine. In 2005, 13 PMWS cases were submitted to the Quebec provincial diagnostic laboratory and PCV-2 was the only virus that could be found consistently by PCR in all 13 samples. The PCR detection results obtained for other viruses revealed the following: 61.5% were positive for porcine reproductive and respiratory syndrome virus, 30.8% for swine influenza virus, 15.4% for porcine parvovirus, 69.2% for swine torque teno virus (swTTV), 38.5% for swine hepatitis E virus (swHEV) and 84.6% for Mycoplasma hyorhinis; transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus (TGEV/PRCV) was not detected. Sequences of the entire genome revealed that these PCV-2 strains belonged to a genotype (named PCV-2b) that has never been reported in Canada. Further sequence analyses on 83 other Canadian PCV-2 positive cases submitted to the provincial diagnostic laboratory during years 2005 and 2006 showed that 79.5% of the viral sequences obtained clustered in the PCV-2b genotype. The appearance of the PCV-2b genotype in Canada may explain the death rate increase related to PMWS, but this relationship has to be confirmed.

Propidium monoazide (PMA) and ethidium bromide monoazide(EMA) improve DNA array and high-throughput sequencing ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus identification

Pan-viral DNA array (PVDA) and high-throughput sequencing (HTS) are useful tools to identify novel viruses of emerging diseases. However, both techniques have difficulties to identify viruses in clinical samples because of the host genomic nucleic acid content (hg/cont). Both propidium monoazide (PMA) and ethidium bromide monoazide (EMA) have the capacity to bind free DNA/RNA, but are cell membrane-impermeable. Thus, both are unable to bind protected nucleic acid such as viral genomes within intact virions. However, EMA/PMA modified genetic material cannot be amplified by enzymes. In order to assess the potential of EMA/PMA to lower the presence of amplifiable hg/cont in samples and improve virus detection, serum and lung tissue homogenates were spiked with porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) and were processed with EMA/PMA. In addition, PRRSV RT-qPCR positive clinical samples were also tested. EMA/PMA treatments significantly decreased amplifiable hg/cont and significantly increased the number of PVDA positive probes and their signal intensity compared to untreated spiked lung samples. EMA/PMA treatments also increased the sensitivity of HTS by increasing the number of specific PRRSV reads and the PRRSV percentage of coverage. Interestingly, EMA/PMA treatments significantly increased the sensitivity of PVDA and HTS in two out of three clinical tissue samples. Thus, EMA/PMA treatments offer a new approach to lower the amplifiable hg/cont in clinical samples and increase the success of PVDA and HTS to identify viruses.

Conception et évaluation d’un nouveau système de transfection ciblée, basé sur l’utilisation du système E/Kcoil

Actuellement le polyéthylènimine (PEI) est l’agent de transfection transitoire le plus utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par les cellules de mammifères. Il permet la condensation de l’ADN plasmidique (ADNp) en formant spontanément des nanoparticules positives appelées polyplexes, lui procurant la possibilité de s’attacher sur la membrane cellulaire afin d’être internalisé, ainsi qu’une protection face aux nucléases intracellulaires. Cependant, alors que les polyplexes s’attachent sur la quasi-totalité des cellules seulement 5 à 10 % de l’ADNp internalisé atteint leur noyau, ce qui indique que la majorité des polyplexes ne participent pas à l’expression du transgène. Ceci contraste avec l’efficacité des vecteurs viraux où une seule particule virale par cellule peut être suffisante. Les virus ont évolués afin d’exploiter les voies d’internalisation et de routage cellulaire pour exprimer efficacement leur matériel génétique. Nous avons donc supposé que l’exploitation des voies d’internalisation et de routage cellulaire d’un récepteur pourrait, de façon similaire à plusieurs virus, permettre d’optimiser le processus de transfection en réduisant les quantités d’ADNp et d’agent de transfection nécessaires. Une alternative au PEI pour transfecter les cellules de mammifèreest l’utilisation de protéines possédant un domaine de liaison à l’ADNp. Toutefois, leur utilisation reste marginale à cause de la grande quantité requise pour atteindre l’expression du transgène. Dans cette étude, nous avons utilisé le système E/Kcoil afin de cibler un récepteur membranaire dans le but de délivrer l’ADNp dans des cellules de mammifères. Le Ecoil et le Kcoil sont des heptapeptides répétés qui peuvent interagir ensemble avec une grande affinité et spécificité afin de former des structures coiled-coil. Nous avons fusionné le Ecoil avec des protéines capables d’interagir avec l’ADNp et le Kcoil avec un récepteur membranaire que nous avons surexprimé dans les cellules HEK293 de manière stable. Nous avons découvert que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire permettait l’attachement ciblé sur les cellules par l’intermédiaire du système E/Kcoil. Nous démontrons dans cette étude comment utiliser le système E/Kcoil et une protéine interagissant avec l’ADNp pour délivrer un transgène de manière ciblée. Cette nouvelle méthode de transfection permet de réduire les quantités de protéines nécessaires pour l’expression du transgène.

The nuclear pore complex and its transporters : from virus-host interactors to subverting the innate antiviral immunity

Les virus ont besoin d’interagir avec des facteurs cellulaires pour se répliquer et se propager dans les cellules d’hôtes. Une étude de l'interactome des protéines du virus d'hépatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'élucider de nouvelles interactions virus-hôte. L'étude a également démontré que la majorité des facteurs de l'hôte n'avaient pas d'effet sur la réplication du virus. Ces travaux suggèrent que la majorité des protéines ont un rôle dans d'autres processus cellulaires tel que la réponse innée antivirale et ciblées pas le virus dans des mécanismes d'évasion immune. Pour tester cette hypothèse, 132 interactant virus-hôtes ont été sélectionnés et évalués par silençage génique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observé que les réductions de l'expression de 53 interactants virus-hôte modulent la réponse antivirale innée. Une étude dans les termes de gène d'ontologie (GO) démontre un enrichissement de ces protéines au transport nucléocytoplasmique et au complexe du pore nucléaire. De plus, les gènes associés avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont été caractérisé comme des interactant de la protéine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des régulateurs positives de la réponse innée antivirale. Comme le VHC se réplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions à des protéines associées avec le noyau confèrent un avantage de réplication et bénéficient au virus en interférant avec des processus cellulaire tel que la réponse innée. Cette réponse innée antivirale requiert la translocation nucléaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-κB p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a été développé afin d'évaluer l’effet du silençage de 60 gènes exprimant des protéines associés au complexe du pore nucléaire et au transport nucléocytoplasmique sur la translocation d’IRF3 et NF-κB p65 par un criblage ARNi lors d’une cinétique d'infection virale. En conclusion, l’étude démontre qu’il y a plusieurs protéines qui sont impliqués dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 à différents niveaux de la réponse d'immunité antivirale. L'étude aussi suggère que l'effet de ces facteurs de transport sur la réponse innée est peut être un mécanisme d'évasion par des virus comme VHC.

Étude de l’évolution du tropisme et de la pression sélective exercée sur le gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 au cours de la grossesse et à l’échelle de la population.

Introduction. Le VIH-1 évolue en fonction de la réponse immunitaire spécifique de l’hôte. La pression sélective exercée par la réponse immunitaire VIH-spécifique de l’hôte entraine l’évolution des gènes viraux et à terme détermine l’évolution de la maladie. Cette évolution du virus à l’échelle d’un individu façonne également l’évolution du virus à l’échelle de la population et détermine le devenir de l’épidémie. Le VIH utilise les corécepteurs d’entrée CCR5 (virus R5) et CXCR4 (virus X4) afin d’infecter la cellule cible, et l’évolution du tropisme du virus de R5 vers X4, appelé switch du tropisme, est associé à la progression de la maladie. Les virus R5 sont rencontrés en début d’infection tandis que les virus X4 apparaissent en fin de maladie chez un certain de nombre de patients et sont considérés comme plus virulents. La pression sélective immunitaire exercée sur le gène de l’enveloppe (env) peut donc entrainer l’évolution du tropisme du VIH. La grossesse est un état immunitaire particulier considéré comme étant principalement caractérisé par un biais Th2 nécessaire à l’établissement de la tolérance materno-fétale. Le switch de tropisme de R5 vers X4 en grossesse n’a jamais été documenté, de même que l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Hypothèses. Les changements immunitaires associés à l’initiation et la progression de la grossesse engendrent des changements dans la pression immunitaire exercée sur l’enveloppe et peuvent favoriser le switch du tropisme. L’évolution du tropisme du VIH-1 peut être observé à l’échelle de la population au même titre que l’évolution de l’enveloppe virale. Objectifs. Analyser l’évolution du tropisme et décrire la pression sélective sur l’enveloppe des femmes enceintes infectées par le VIH-1. Analyser l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Méthodes. Nous avons dans un premier temps analysé l’évolution des déterminants du tropisme et déterminé le génotype et phénotype du VIH-1 chez 19 femmes enceintes issues de la cohorte du centre maternel et infantile sur le SIDA de l’hôpital Sainte-Justine (CMIS). Nous avons ensuite caractérisé et comparé la pression sélective exercée sur env, par une méthode bayésienne, chez 31 femmes enceinte et 29 femmes non-enceintes. Enfin, nous avons analysé et comparé des déterminants du tropisme entre des séquences d’enveloppe contemporaines et anciennes, issues des bases de données du NCBI. Résultats. Nos résultats montrent la présence de virus X4 chez la moitié de notre cohorte, et un switch de tropisme de R5 vers X4 chez 5/19 sujets. Les séquences des femmes enceintes présentaient des taux de substitutions plus élevées que celles des femmes non-enceintes. La pression sélective dans la région C2 était plus faible chez les femmes enceintes que chez les femmes non-enceintes, et différait dans 4 positions entre ces 2 groupes. Cette sélection diminuait au cours de la grossesse chez les patientes traitées. Enfin, une accumulation de mutations X4 a été observée dans les séquences R5 contemporaines par rapport aux séquences R5 anciennes. Conclusion. Les changements immunitaires associés à la grossesse semblent induire des modifications subtiles dans la pression sélective exercée sur env, suffisant à influencer l’évolution du tropisme de R5 vers X4. Un switch du tropisme à l’échelle de la population impliquerait une épidémie évoluant vers une plus grande virulence du virus. Nos résultats sont d’importance en ce qui concerne la prophylaxie antirétrovirale pour la santé de la mère et la prévention de la transmission mère-enfant du VIH-1. Ils sont aussi importants concernant l’avenir de la thérapie antirétrovirale dans le contexte d’une épidémie évoluant vers une plus grande virulence

Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect

Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral “oncolysis”, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.

La génétique inverse dans l'étude des réovirus: Progrès, obstacles et développements futurs

En génétique dite « classique », l’examen d’un phénotype conduit à l’étude des gènes impliqués dans son obtention. La génétique inverse est une méthode expérimentale très puissante dans laquelle, au contraire, le matériel génétique est modifié et utilisé pour reconstruire un organisme complet, afin de déterminer le résultat de ces modifications. Cette approche est spécialement bien adaptée à l'étude des virus, compte tenu de la relative simplicité et de la petite taille de leurs génomes; l’obstacle principal demeure de récupérer des virus infectieux à partir de génomes viraux clonés. Au cours des années, cet exploit a été accompli pour des représentants de presque toutes les familles de virus de mammifères. Jusqu’à récemment, les Reoviridae, virus à génome d'ARN bicaténaire segmenté, faisaient toutefois exception. Dans cette revue, les progrès réalisés vers la mise au point de la génétique inverse pour l'étude du réovirus seront discutés. La génétique inverse pourrait avoir un impact majeur dans l'optimisation de nouvelles souches de réovirus pour leur utilisation en thérapie comme agents oncolytiques et pour le développement de vaccins dans le cas des rotavirus et des orbivirus. Les travaux actuels font toutefois ressortir les limites de l'approche, la nécessité d’une analyse prudente des résultats obtenus, ainsi que le besoin de développer des systèmes plus efficaces et polyvalents.

Addition of exogenous polypeptides on the mammalian reovirus outer capsid using reverse genetics

Addition of exogenous peptide sequences on viral capsids is a powerful approach to study the process of viral infection or to retarget viruses toward defined cell types. Until recently, it was not possible to manipulate the genome of mammalian reovirus and this was an obstacle to the addition of exogenous sequence tags onto the capsid of a replicating virus. This obstacle has now been overcome by the advent of the plasmid-based reverse genetics system. In the present study, reverse genetics was used to introduce different exogenous peptides, up to 40 amino acids long, at the carboxyl-terminal end of the σ1 outer capsid protein. The tagged viruses obtained were infectious, produce plaques of similar size, and could be easily propagated at hight titers. However, attempts to introduce a 750 nucleotides-long sequence failed, even when it was added after the stop codon, suggesting a possible size limitation at the nucleic acid level.

Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.

Rôle des cellules endothéliales dans l’immunité innée précoce induite lors d’infections par des coronavirus murins

Les cellules endothéliales (EC) constituent une première barrière physique à la dissémination de virus pléiotropiques circulant par voie hématogène mais leur contribution à la défense innée anti-virale est peu connue. Des dysfonctions des EC de la barrière hémato-encéphalique (BMEC) et des sinusoïdes hépatiques (LSEC) ont été rapportées dans des neuropathologies et des hépatites aiguës ou chroniques d’origine virale, suggérant que des atteintes à leur intégrité contribuent à la pathogenèse. Les sérotypes de coronavirus de l’hépatite murine (MHV), se différenciant par leur capacité à induire des hépatites et des maladies neurologiques de sévérité variable et/ou leur tropisme pour les EC, représentent des modèles viraux privilégiés pour déterminer les conséquences de l’infection des EC sur la pathogenèse virale. Lors d’infection par voie hématogène, le sérotype MHV3, le plus virulent des MHV, induit une hépatite fulminante, caractérisée par une réponse inflammatoire sévère, et des lésions neurologiques secondaires alors que le sérotype moins virulent, MHV-A59, induit une hépatite modérée sans atteintes secondaires du système nerveux central (SNC). Par ailleurs, le sérotype MHV3, à la différence du MHV-A59, démontre une capacité à stimuler la production de cytokines par la voie TLR2. Les variants atténués du MHV3, les virus 51.6-MHV3 et YAC-MHV3, sont caractérisés par un faible tropisme pour les LSEC et induisent respectivement une hépatite modérée et subclinique. Compte tenu de l’importance des LSEC dans le maintien de la tolérance hépatique et de l’élimination des pathogènes circulants, il a été postulé que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire lors d’infections par les MHV est associée à la réplication virale et à l’altération des propriétés tolérogéniques et vasculaires des LSEC. Les désordres inflammatoires hépatiques pourraient résulter d’une activation différentielle du TLR2, plutôt que des autres TLR et des hélicases, selon les sérotypes. D’autre part, compte tenu du rôle des BMEC dans la prévention des infections du SNC, il a été postulé que l’invasion cérébrale secondaire par les coronavirus est reliée à l’infection des BMEC et le bris subséquent de la barrière hémato-encéphalique (BHE). À l’aide d’infections in vivo et in vitro par les différents sérotypes MHV, chez des souris ou des cultures de BMEC et de LSEC, nous avons démontré, d’une part, que l’infection in vitro des LSEC par le sétotype MHV3, à la différence des variants 51.6- et YAC-MHV3, altérait la production du facteur vasodilatant NO et renversait leur phénotype tolérogénique en favorisant la production de cytokines et de chimiokines inflammatoires. Ces dysfonctions se traduisaient in vivo par une réponse inflammatoire incontrôlée et une dérégulation du recrutement intrahépatique de leucocytes, favorisant la réplication virale et les dommages hépatiques. Nous avons aussi démontré, à l’aide de souris TLR2 KO et de LSEC dont l’expression du TLR2 a été abrogée par des siRNA, que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire induite par le sérotype MHV3, dépendait en partie de l’induction et de l’activation préférentielle du TLR2 par le virus dans le foie. D’autre part, la sévérité de la réplication virale au foie et des désordres dans le recrutement leucocytaire intrahépatique induits par le MHV3, et non par le MHV-A59 et le 51.6-MHV3, corrélaient avec une invasion virale subséquente du SNC, au niveau de la BHE. Nous avons démontré que l’invasion cérébrale du MHV3 était associée à une infection productive des BMEC et l’altération subséquente des protéines de jonctions serrées occludine, VE-cadhérine et ZO-1 se traduisant par une augmentation de la perméabilité de la BHE et l’entrée consécutive du virus dans le cerveau. Dans l’ensemble, les résultats de cette étude mettent en lumière l’importance du maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des LSEC et des BMEC lors d’infections virales aigües par des MHV afin de limiter les dommages hépatiques associés à l’induction d’une réponse inflammatoire exagérée et de prévenir le passage des virus au cerveau suite à une dissémination par voie hématogène. Ils révèlent en outre un nouveau rôle aggravant pour le TLR2 dans l’évolution de l’hépatite virale aigüe ouvrant la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques visant à moduler l’activité inflammatoire du TLR2.