DNA损伤检验点蛋白表达对肿瘤细胞辐射敏感性的影响

本论文应用X射线和12C6+离子对不同肿瘤细胞：HL-60、K562、SMMC-7721和HepG2进行辐照，用克隆形成率和四唑盐比色法(MTT)测定四种细胞的辐射敏感性；通过流式细胞术测定细胞周期分布、细胞凋亡、ATM和SMC1蛋白的表达变化。应用免疫细胞化学法与流式检测相结合研究了γ-H2AX蛋白表达的时间效应与剂量效应之间的关系。实验结果表明，四种细胞的辐射敏感性由强到弱依次为HL-60>K562>SMMC-7721>HepG2。即ATM表达量越低的细胞对辐射越敏感，周期阻滞水平越低，细胞凋亡越明显，但辐照后ATM蛋白的表达无显著增加，说明ATM的表达量和功能状态与细胞辐射敏感性有关，但其表达水平不能完全反映ATM蛋白激酶的活性。对ATM表达量差异最显著的HepG2和HL-60细胞来说,辐照前SMC1的表达水平与细胞S期的含量没有直接关系，辐照后SMC1蛋白的上调表达在S期阻滞修复中发挥明显的作用。辐照后1h,HL-60和HepG2细胞的H2AX磷酸化水平随吸收剂量的增加呈线性正相关,但曲线斜率与细胞辐射抗性的差异没有直接的联系。γ-H2AX的消失率与存活分数存在良好的相关性，HepG2细胞抗辐射能力强，这一时间短，HL-60细胞抗辐射能力弱，这一时间长。可以用γ-H2AX的消失速率来评估细胞的辐射敏感性。 以SMMC-7721细胞为同步化细胞模型发现，与其它同步化方法相比，步进电机旋转同步化培养法对细胞损伤最小，同步化效率最高，达到M期＞90%，GO/G1期＞80%，S期＞60%，G2/M>50%。同种射线辐照，GO/G1期SMMC-7721细胞的存活相对G2/M期来说较高。12C6+离子辐照明显减小了二者敏感度的差异性

12C6+束和Mitomycin C 诱导的DNA损伤效应

本文旨在分别研究重离子束及MMC在诱导细胞的DNA损伤效应中一些具体的分子机制，为治疗的进行以及相关辅助药物的开发提供理论依据。本文探索的重点有两个，第一个是重离子束辐射诱导的DNA损伤效应及p53在其中的激活，第二个是MMC诱导的DNA损伤效应及p53和BRCA1、H2AX等分子在其中的角色。 1. 12C6+离子束诱导HeLa细胞DNA损伤效应为了研究HeLa细胞经过12C6+ 束辐照之后的DNA损伤效应，及这个过程中p53激活的分子机制。我们运用中性单细胞电泳技术，检测了HeLa细胞经过4Gy 12C6+ 束辐照0h、3h、6h和12h之后DNA的损伤情况，以及0.5Gy、1Gy、2Gy和4Gy 12C6+ 束辐照0h后的DNA损伤情况。同时运用细胞生长实时监测仪监测了HeLa细胞在经过0Gy、0.5Gy和1Gy 12C6+ 束辐照之后的生长变化，并运用AO/EB双染检测了辐照24小时后的凋亡情况。另外，利用8mmol/L的caffeine（抑制ATM和ATR）和20μmol/L的wortmannin（抑制ATM和DNA-PK）处理HeLa细胞后再进行1Gy 12C6+ 束辐照，通过western blot检测p53的表达。结果显示，12C6+ 束辐照可造成HeLa细胞的DNA损伤，损伤随剂量升高而升高但随时间降低；并诱导HeLa细胞发生凋亡；而且辐照后p53表达升高，但经过caffeine或者wortmannin预先处理的细胞p53均没有显著升高。我们的结论是：12C6+ 束辐照可造成HeLa细胞的DNA损伤并诱导损伤修复及凋亡等效应，损伤效应相关的分子p53被激活，并且激活依赖于ATM。 2. MMC诱导的DNA损伤效应在这一部分研究中，首先，我们利用与上面相同的研究方法，探讨了p53在MMC诱导的DNA损伤效应中的激活情况，结果显示，MMC诱导的DNA损伤效应并不依赖于p53。另外，我们还探讨了， BRCA1在FANCD2的γ-H2AX依赖性转移中的作用。MMC可造成DNA的ICL（interstrand cross-link）损伤，ICL可通过FA(Fanconi Anemia)通路进行修复。FANCD2是FA通路的核心分子，在DNA产生ICL时被各种分子修饰然后转移到损伤部分，这个过程的涉及到ATR、γ-H2AX及BRCA1等，本文试图探讨BRCA1在其中的作用方式。研究中，我们监测了不同处理（包括对照、caffeine（可抑制ATR）、MMC及MMC ＋caffeine）的HCC1937(BRCA1缺陷型)和MCF7（BRCA1野生型）细胞的生长；并用Western blot检测MMC处理之后HCC1937细胞γ-H2AX的表达情况。结果表明，MMC和caffeine均可以抑制HCC1937的生长，但caffeine和MMC+caffeine的抑制效果是一样的；MMC和caffeine均可以抑制MCF7的生长，且MMC+caffeine处理比仅进行caffeine处理的抑制作用强；MMC处理之后，HCC1937的γ-H2AX表达显著升高。我们的结论是，在FANCD2的γ-H2AX依赖性转移中，H2AX的磷酸化并不依赖于BRCA1，不过，BRCA1和ATR应该参与一个相同的分子事件，可能是FANCD2的磷酸化。这个有待进一步的实验验证

重离子照射后肿瘤细胞辐射敏感性和DNA双链断裂及修复的研究

本论文的实验内容立足于我所重离子治癌研究的基础之上，本着进行基础研究的目的，研究了肿瘤细胞对于重离子的辐射敏感性和重离子引起肿瘤细胞DNA双链断裂(DSB)及修复的情况，这可为我所开展重离子治癌提供有效的基础数据和理论参考，对于治疗计划的制定也具有重要的意义。实验从四个方面开展，首先考察了不同肿瘤细胞对低LETγ射线的辐射敏感性差异及其与修复可能存在的联系，其次考察了重离子在放射治疗中的优势及重离子用于肿瘤放射治疗的优越性，第三为了进一步寻求重离子对肿瘤细胞强杀伤能力的原因所在，对重离子引起的肿瘤细胞DSB及修复水平进行了研究，最后通过分次照射实验，考察细胞存活与细胞DSB修复水平之间可能存在的相关性。实验取得了一系列有意义的结果和结论： 1． 低LET电离辐射作用后，不同组织来源的肿瘤细胞的辐射敏感性有较大差 异，其各自的修复功能也有相应的差异，且肿瘤细胞的辐射敏感性与其修复能力呈负相关。 2．重离子具有的独特物理特性及其高LET下对肿瘤细胞的强杀伤作用，使得重离子成为肿瘤治疗的热点。与此同时，重离子还显示出其它值得关注的优势，它可以同样有效的杀伤不同肿瘤细胞，减弱了细胞间的敏感性差异，这对于治疗计划的制定和治疗对常规辐射抗性较高的肿瘤来说，具有重大的意义。对于临床的分次照射，重离子治疗时，细胞的亚致死修复明显降低，可以采取较少的照射次数就达到杀伤肿瘤的目的，这样大大提高了肿瘤治疗效率，同时减轻了病人的痛苦。 3．在两种高LET重离子引起细胞DSB及其修复实验中，初始DSB量均与剂量呈线性关系。 DSB的片段分布检测结果显示两种重离子辐照后DSB的分布呈明显的非随机分布，剂量增大时，大片段的DSB和小片段的DSB变化趋势不同：剂量超过一定数值后，小片段的DSB随剂量增大而呈现出高的增加速度，而大片段的DSB则呈现微弱增加甚至减少。同时LET变化对于这一现象存在影响。除了离子种类和LET之外，剂量也影响了DSB分布形式。修复实验结果显示4h后，残余的DSB相差不大。由于氩离子引起的初始DSB高于碳离子，在相同时间内，高LET的氩离子完成了对DSB更多的修复，这似乎提示，LET升高引起了更强的修复，但是这里值得考虑的有两点，一是慢修复的DSB所占的比例，二是错修复的问题，即使高LET的氩离子照射后DSB得到了更多的修复，但是其修复的忠实性并未得到证明，更多的工作还需要进行。 4．分次照射实验发现高LET的碳离子辐照后的剂量存活曲线不再存在明显肩区，分次照射细胞的存活也没有明显上升，这与光子辐照情况不同，应证了随着LET升高，分次效应降低的结论。同时检测DSB的引入情况，发现分次照射和单次照射时，DSB的引入并未发生明显变化，这显示在分次照射的间隙中，重离子引入的DSB并未得到明显的修复。提示细胞对高LET照射更为敏感与其对高LET辐照引起的DSB修复能力降低之间的相关性

Effect of DNA flanking sequence on charge transport in short DNA duplexes

Several factors can influence charge transport (CT)-mediated DNA, such as sequence, distance, base stacking, base pair mismatch, conformation, tether length, etc. However, the DNA context effect or how flanking sequences influence redox active drugs in the DNA CT reaction and later in DNA enzymatic repair and synthesis is still not well understood. The set of seven DNA molecules in this study have been characterized well for the study of flanking sequence effects. These DNA duplexes are formed from self-complementary strands and contain the common central four-base sequence 5'-A-G-C-T-3', flanked on both sides by either (AT)(n) or (AA)(n) (n = 2, 3, or 4) or AA(AT)(2). UV-vis, fluorescence, UV melting, circular dichroism, and cyclic voltammetry experiments were used to study the flanking sequence effect on CT-mediated DNA by using daunomycin or adriamycin cross-linked with these seven DNA molecules. Our results showed that charge transport was related to the flanking sequence, DNA melting free energy, and ionic strength. For (AA)(n) or (AT)(n) species of the same length, (AA)(n) series were more stable and more efficient CT was observed through the (AA)(n) series. The same trend was observed for (AA)(n) and (AT)(n) series at different ionic strengths, further supporting the idea that flanking sequence can result in different base stacking and modulate charge transport through these seven DNA molecules.