Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción. In vitro Production of Transgenic Bovine Embryos using Intracitoplasmic Sperm Injection (ICSI) and Restriction Enzymes

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas. Genetic engineering and reprogrammed organisms represent the new biotechnological frontiers which will make possible to generate animals with precise genetic modifications for agricultural and biomedical applications. Current methods used to generate genetically modified large animals, lay behind those used in laboratory animals, specially the mouse. Therefore, we seek to develop and optimize protocols to produce transgenic bovine embryos through the use of a non-viral vector. The strategy involves the simultaneous presence inside the cell of a restriction enzyme (I-SceI) and a transgene (carrying cassettes for a fluorescent protein -ZsGreen1- and neomycin phosphotransferase) flanked by restriction sites for the endonuclease. We plan to develop an alternative approach to generate transgenic bovine embryos by coinjecting the transgene flanked by I-SceI restriction sites plus the enzyme I-SceI along with the spermatozoon during the technique known as intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Embryos will be cultured in vitro and inspected daily with a fluorescence microscope to characterize transgene expression. Embryos that reach the blastocyst stage and express the transgene will be surgically transfer to the uterus of a synchronized ewe. After 7 days, the embryos will be flushed out the ovine uterus and transported to the laboratory to determine the number of integration sites and transgene copies by Southern blot. We anticipate that results from this research will set the stage for the development of efficient strategies to achieve precise genetic modifications in large domestic animals for future biotechnological applications.

Caracterización de moléculas de rizobacterias y de leguminosas con alto impacto productivo y tecnológico en la provincia de Córdoba. Characterization of rhizobacteria and legumes molecules with high production and technological impact in the province of Córdoba.

La provincia de Córdoba cuenta con alto desarrollo agrícola a base de cereales y leguminosas, como por ejemplo el maní. Pero este cultivo con los años ha trasladado su zona de siembra original y se ha extendido hacia otras áreas de mayor riesgo ambiental a raíz de la implantación de la soja. Diversas son las consecuencias de estas dos acciones y que se extienden desde lo agroecológico hasta lo científico-técnico. Este previo estado del arte y las referencias bibliográficas que apuntan a la necesitad de aumentar el valor agregado de los cultivos, nos ha llevado a formular una hipótesis de trabajo y es que las plantas de maní y soja así como las rizobacterias que se asocian con ellas, son productoras de diversas moléculas con potencial uso biológico en la productividad del cultivo y en aplicaciones tecnológicas, biológicas e industriales. Sumado a lo anterior y a las ideas gubernamentales de la necesidad de obtener conocimiento y capitalizarlo como riqueza, y la imperiosa urgencia de responder a demandas regionales, se presenta este proyecto cuyo objetivo general apunta a estudiar la producción de diversas moléculas de rizobacterias y leguminosas con el fin de mejorar la productividad de los cultivos y desarrollar nuevas aplicaciones tecnológicas en la provincia de Córdoba. Para cumplir dentro de los dos años de trabajo solicitados con lo expuesto anteriormente, la investigación será dividida en objetivos específicos y que consisten en investigar la producción de moléculas de raíces de maní y soja, analizar la respuesta microbiana a las rizodeposiciones de ambas leguminosas y evaluar el posible papel biológico y aplicación tecnológica de moléculas de ambos tipos de organismos. Nuestro grupo es de caracter multidisciplinar y ahondará en la diversidad molecular producida por raíces de maní y soja en direfentes días y la respuesta de las rizobacterias que se asocian ellas utilizando técnicas químicas (HPLC, GC, GC-masa) y herramientas microbiológicas y bioquímicas clásicas. Con fines de aplicación tecnológica se determinará la posible acción antioxidante de los extractos vegetales sobre sistemas modelos de ensayo así como la búsqueda de enzimas y hormonas microbianas aplicables en otros campos de la ciencia. De esta forma se pretende atender algunas demandas de diferentes sectores del centro sur de Córdoba y del país pero fundamentalmente posibilitar nuevas aplicaciones de las leguminosas y de las rizobacterias además de permitir la formación académicas de alumnos de grado y posgrado de la UNRC. The province of Cordoba has high agricultural development based on cereals and legumes such as peanuts. But the crop over the years has transferred his original planting area and has spread to other areas of greatest environmental risk following the introduction of soybeans. The previous state and regional art references that point to the necessity of increasing the value-added crops, has led us to formulate a working hypothesis is that the peanut and soybean plants and rhizobacteria associated with they are products of various biological molecules with potential use in crop productivity and biological technology and industrial applications. The general objective is aimed at studying the production of various molecules and legumes rhizobacteria to improve crop productivity and develop new technological applications in the Cordoba province. This form is intended to meet some demands of different sectors of the center south of Cordoba and the country but enabling new applications of legumes and rhizobacteria in addition to allowing the academic training of undergraduates and graduate of the UNRC.

Producción de factores de virulencia por fitopatógenos bacterianos de soja. Utilización de productos naturales como biocontrol. Production of virulence factors by soybean bacterial phytopathogens. The use of natural products as biocontrolers.

En Argentina el cultivo de soja ocupa el primer lugar en superficie sembrada. El 90% de la producción se obtiene en la zona central del pais. La siembra directa favorece la multiplicación y supervivencia de fitopatógenos causantes de tizón y pústula bacterianos. El tizón es producido por Pseudomonas syringae pv. glycinea observándose manchas marrones en las hojas. Produce gran variedad de toxinas: coronatina, faseolotoxina, siringomicina, tabtoxina, proteínas “nucleation ice”, entre otras, las cuales contribuyen a la clorosis y necrosis. En la infección, además, están involucrados exopolisacáridos (levano y alginato). La celulosa ha sido relacionada en la adhesión bacteriana y en la formación de biofilm. La pústula es causada por Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Produce manchas pequeñas con una pequeña pústula de color claro. Libera enzimas como α-amilasa, proteasa, endo β-mannanasa, actividad peptolítica, que degradan componentes vegetales. Xantan, producido por X. axonopodis es uno de los componentes necesarios para la formación de biofilm. Este último es considerado un importante factor de virulencia porque proporciona una estrategia de colonización que otorga mayor resistencia a ambientes desfavorables, tolerancia a antimicrobianos, producción de metabolitos y exoenzimas, etc. Actualmente el control de bacterias fitopatógenas se realiza mediante pesticidas con alta toxicidad para los consumidores y el ambiente. Para evitar las bacteriosis en la práctica se sugiere la rotación de cultivos y utilizar semillas certificadas. Se están probando compuestos naturales derivados de plantas medicinales como pesticidas; estos se pueden dividir en varias categorías fitoquímicas. Varios estudios confirman la actividad antibacteriana, antifúngica y antiviral de estos productos. Extractos vegetales con alto contenido de flavonoides y aceite esenciales poseen una importante actividad antibacteriana. Además, algunos aceites esenciales podrían estar incidiendo en la liberación y/o producción de biofilm, exopolisacáridos y exoproteínas. La gran incidencia de las infecciones por fitopatógenos y las pérdidas económicas que estas acarrean hacen que su control presente grandes dificultades para la agricultura sustentable en soja de nuestro país. En este trabajo se propone estudiar los diferentes factores de virulencia de cepas bacterianas fitopatógenas y evaluar el rol que cumplen en el proceso de la enfermedad en cultivos de soja y desarrollar estrategias para el control de bacteriosis vegetales aplicando productos naturales aislados de plantas aromáticas. La correcta utilización de productos antimicrobianos de origen natural aplicados sobre el cultivo y/o sobre las semillas evitaría la dispersión de la enfermedad y la eliminación al medio ambiente de productos contaminantes no deseados. In Argentina, soybean cultivation occupies the first place; 90% of this cereal is produced in the central region of the country. Intensive tillage practices favour multiplication and survival of bacterial phytopathogens causing blight and pustule diseases. Pseudomonas syringae pv. glycinea produce several toxins like coronatine, faseolotoxine, siringomicine, tabtoxine and proteins of nucleation ice that contribute to the develop of chlorosis and necrosis, characteristic of bacterial blight. It also produces levan and alginate, cellulose and biofilm. Pustule disease is caused by Xanthomonas axonopodis pv glycines, which produce enzymes like α-amilase, protease, endo β-mannanase, peptolitic activity, xanthan and biofilm. Nowadays the control of phytopathogenic bacteria consists in the application of pesticides that are toxic for the environment and man. Natural products from medicinal plants are a new alternative for the treatment of phytopathogens. Researches made with phytochemical compounds (flavonoids, phenols, quinones, cummarines, essential oils, terpenes) support the antimicrobial activity of these natural products. What is more, these substances could suppress the biofilm, exoproteins and exopolisaccharides formation and release of them. The infections caused by phytopathogens provoke economical loses and its control presents big difficulties in our country. The proposal of this work is the characterization of phytopatoghenic strains, its virulence factors and the role they play in the disease process. The development of a new alternative for the control of vegetable bacteriosis using natural products obtained from aromatic plants and the correct application of them on sown fields or on seeds is also an objective in this work.

Text-book of embryology, edited by Walter Heape.

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Text-book of comparative anatomy, by Arnold Lang with preface to the English translation by Ernst Haeckel, tr. into English by Henry M. Bernard and Matilda Bernard.

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Text-book of comparative anatomy, by Arnold Lang with preface to the English translation by Ernst Haeckel, tr. into English by Henry M. Bernard and Matilda Bernard.

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