Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du développement des circuits d’interneurones GABAergiques dans le néocortex : rôle de la molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM)

Les interneurones GABAergiques constituent une population mineure de cellules par rapport aux neurones glutamatergiques dans le néocortex. Cependant ils contrôlent fortement l'excitabilité neuronale, la dynamique des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique. L'importance des circuits GABAergiques dans le processus fonctionnel et la plasticité des réseaux corticaux est soulignée par des résultats récents qui montrent que des modifications très précises et fiables des circuits GABAergiques sont associées à divers troubles du développement neurologique et à des défauts dans les fonctions cérébrales. De ce fait, la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliquant le développement des circuits GABAergiques est la première étape vers une meilleure compréhension de la façon dont les anomalies de ces processus peuvent se produire. La molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM) appartient à la super-famille des immunoglobulines de reconnaissance cellulaire et est impliquée dans des interactions homophiliques et hétérophiliques avec d’autres molécules. Même si plusieurs rôles de NCAM ont été démontrés dans la croissance neuronale, la fasciculation axonale, la formation et la maturation de synapses, de même que dans la plasticité cellulaire de plusieurs systèmes, le rôle de NCAM dans la formation des synapses GABAergiques reste inconnu. Ce projet visait donc à déterminer le rôle précis de NCAM dans le processus de maturation des synapses GABAergiques dans le néocortex, en modulant son expression à différentes étapes du développement. L’approche choisie a été de supprimer NCAM dans des cellules GABAergiques à paniers avant la maturation des synapses (EP12-18), pendant la maturation (EP16-24), ou durant le maintien de celles-ci (EP24-32). Les méthodes utilisées ont été le clonage moléculaire, l’imagerie confocale, la culture de coupes organotypiques et des techniques morphométriques de quantification de l’innervation GABAergique. Nos résultats montrent que l’inactivation de NCAM durant la phase de maturation des synapses périsomatiques (EP16-24) cause une réduction du nombre de synapses GABAergiques périsomatiques et du branchement de ces axones. En revanche, durant la phase de maintien (EP26-32), l’inactivation de NCAM n’a pas affecté ces paramètres des synapses GABAergiques. Or, il existe trois isoformes de NCAM (NCAM120, 140 et 180) qui pourraient jouer des rôles différents dans les divers types cellulaires ou à des stades développementaux différents. Nos données montrent que NCAM120 et 140 sont nécessaires à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Cependant, NCAM180, qui est l’isoforme la plus étudiée et caractérisée, ne semble pas être impliquée dans ce processus. De plus, l’inactivation de NCAM n’a pas affecté la densité des épines dendritiques ou leur longueur. Elle est donc spécifique aux synapses périsomatiques GABAeriques. Finalement, nos résultats suggèrent que le domaine conservé C-terminal KENESKA est essentiel à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Des expériences futures nous aiderons à mieux comprendre la mécanistique et les différentes voies de signalisation impliquées.

Rôle des facteurs physico-chimiques du micro-environnement intestinal et des boucles inter-hélicales du Domaine I dans l’activité de la toxine insecticide Cry9Ca du bacille de Thuringe

Une fois ingérées par un insecte sensible, les toxines insecticides du bacille de Thuringe doivent être activées par les protéases intestinales de cet insecte. Leur premier domaine, un ensemble de sept hélices-α amphipathiques, est responsable de leur insertion dans la membrane luminale de certaines cellules de l’intestin médian, ce qui crée des pores peu sélectifs. La toxicité et la capacité à former des pores d’une telle toxine, la Cry9Ca, de ses mutants simples R164A et R164K et d’un fragment de 55 kDa résultant d’un clivage protéolytique au niveau de son résidu 164 ont été étudiées à l’aide d’une combinaison de modélisation par homologie, de bioessais, d’expériences de gonflement osmotique avec des vésicules de membrane en bordure en brosse de larves de sphinx du tabac et de mesures électrophysiologiques sur des intestins isolés. Ni les mutations simples ni le clivage protéolytique n’ont altéré la toxicité de la Cry9Ca. Dans une solution à faible force ionique, toutefois, la formation des pores dépend fortement du pH : une augmentation de celui-ci de 6,5 à 10,5 a entraîné une baisse irrégulière et par étapes successives de la perméabilité membranaire. Les quatre préparations de toxine ont néanmoins dépolarisé la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés baignant dans une solution contenant 122 mM de KCl à pH 10,5. L’activité de la Cry9Ca, et des mutants R164A et R164K, a été grandement stimulée lorsque les expériences ont été effectuées en présence de suc intestinal, de lipides extraits d’un volume équivalent de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases solubles dans l’eau. De plus, le rôle des boucles inter-hélicales du Domaine I lors de l’insertion dans la membrane a été étudié avec des mutants doubles de la Cry9Ca dont les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique. À l’exception de trois d’entres eux, tous ces mutants ont conservé une toxicité et une capacité à former des pores comparables à celles de la toxine parentale. L’ensemble de ces résultats suggère que le micro-environnement de l’intestin médian contribue à minimiser l’influence des charges de surface portées par les résidus des boucles inter-hélicales du Domaine I sur la capacité des toxines du bacille de Thuringe à former des pores. Il indique aussi que, d’une part, selon le site de clivage et les conditions expérimentales utilisées, des protéolyses supplémentaires de la toxine Cry9Ca activée peuvent soit stimuler, soit nuire à son activité et que, d’autre part, le suc intestinal du sphinx du tabac contient probablement un inhibiteur de protéases qui pourrait jouer un rôle important dans l’activité des toxines du bacille de Thuringe.

Étude ultrastructurale et développementale du récepteur EphA4 dans l’hippocampe du rat

Afin de mieux comprendre l’évolution des fonctions du récepteur EphA4 pendant le développement du système nerveux central (SNC), nous avons étudié sa localisation cellulaire et subcellulaire dans l’hippocampe du rat, d’abord chez l’adulte, puis pendant le développement postnatal, ainsi que ses rôles potentiels dans la genèse, la migration ou la maturation des cellules granulaires dans l’hippocampe adulte. Pour ce faire, nous avons utilisé la méthode d’immunocytochimie en microscopie photonique, électronique et confocale. En microscopie photonique, une forte immunoréactivité (peroxydase/DAB) pour EphA4 est observée aux jours 1 et 7 suivant la naissance (P1 et P7) dans les couches de corps cellulaires, avec un marquage notamment associé à la surface des corps cellulaires des cellules granulaires et pyramidales, ainsi que dans les couches de neuropile du gyrus dentelé et des secteurs CA3 et CA1. L’intensité du marquage diminue progressivement dans les couches de corps cellulaires, entre P7 et P14, pour devenir faible à P21 et chez l’adulte, tandis qu’elle persiste dans les couches de neuropile, sauf celles qui reçoivent des afférences du cortex entorhinal. En microscopie électronique, après marquage à la peroxydase/DAB, EphA4 décore toute la surface des cellules pyramidales et granulaires, du corps cellulaire jusqu’aux extrémités distales, entre P1 et P14, pour devenir confiné aux extrémités synaptiques, c’est-à-dire les terminaisons axonales et les épines dendritiques, à P21 et chez l’adulte. À la membrane plasmique des astrocytes, EphA4 est redistribué comme dans les neurones, marquant le corps cellulaire et ses prolongements proximaux à distaux, à P1 et P7, pour devenir restreint aux prolongements périsynaptiques distaux, à partir de P14. D’autre part, des axones en cours de myélinisation présentent souvent une forte immunoréactivité punctiforme à leur membrane plasmique, à P14 et P21. En outre, dans les neurones et les astrocytes, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi et les vésicules de transport, organelles impliquées dans la synthèse, la modification posttraductionnelle et le transport des protéines glycosylées, sont aussi marqués, et plus intensément chez les jeunes animaux. Enfin, EphA4 est aussi localisé dans le corps cellulaire et les dendrites des cellules granulaires générées chez l’adulte, au stade de maturation où elles expriment la doublecortine (DCX). De plus, des souris adultes knockouts pour EphA4 présentent des cellules granulaires DCX-positives ectopiques, c’est-à-dire positionnées en dehors de la zone sous-granulaire, ce qui suggère un rôle d’EphA4 dans la régulation de leur migration. Ces travaux révèlent ainsi une redistribution d’EphA4 dans les cellules neuronales et gliales en maturation, suivant les sites cellulaires où un remodelage morphologique s’effectue : les corps cellulaires lorsqu’ils s’organisent en couches, les prolongements dendritiques et axonaux pendant leur croissance, guidage et maturation, puis les épines dendritiques, les terminaisons axonales et les prolongements astrocytaires distaux associés aux synapses excitatrices, jusque chez l’adulte, où la formation de nouvelles synapses et le renforcement des connexions synaptiques existantes sont exercés. Ces localisations pourraient ainsi correspondre à différents rôles d’EphA4, par lesquels il contribuerait à la régulation des capacités plastiques du SNC, selon le stade développemental, la région, l’état de santé, ou l’expérience comportementale de l’animal.

Transport d’iode par le transporteur de sodium/acide monocarboxylique SMCT1

Le transporteur de Na+/ acide monocarboxylique sensible à l’ibuprofène (SMCT1) est exprimé dans la membrane apicale de plusieurs épithélia. Son rôle physiologique dans la glande thyroïde reste cependant obscur mais on présume qu’il pourrait agir comme un transporteur apical d’iode nécessaire pour la synthèse des hormones thyroïdiennes. Récemment, on a montré que SMCT1 possède un courant de fuite anionique sensible à [Na+]e qui permettrait de transporter l’iode de façon électrogénique. Cependant, un efflux d’iode sensible à l’ibuprofène, mais indépendant de la [Na+]e a été aussi observé sur des cultures primaires des thyrocytes porcins, suggérant un autre mécanisme de transport d’iode par SMCT1. Ce travail vise à comprendre les caractéristiques de ce genre de transport en utilisant comme modèle d’expression les ovocytes de Xenopus laevis. Les résultats obtenus des essais de captation d’iode radioactif montrent que SMCT1 présente un transport d’iode sensible à l’ibuprofène de l’ordre de 30nmol/ovocyte/h. Si ce transport est non saturable en iode (0-100 mM), il nécessite du Na+ dans la solution externe. En effet, le remplacement du Na+ extracellulaire par le NMDG inhibe complètement le transport. En outre, on s’est intéressé à exclure la possibilité de différents artefacts. En ayant trouvé que la grande majorité de l’iode radioactif se trouve dans la partie soluble de l’ovocyte, on exclut une liaison non spécifique de l’iode à la membrane cellulaire. Cependant, une bonne proportion de l’iode transporté pourrait être liée à des protéines à l’intérieur de l`ovocyte. En effet, on observe une réduction du transport d’iode dans les ovocytes exprimant SMCT1 de 81,6 ± 2 % en présence de 2 % BSA dans la solution extracellulaire. Également, on écarte la possibilité que le transport d’iode soit le résultat de la surexpression de protéines de transport endogènes dont les canaux chlore. Le transport d’iode semble spécifique à l’expression de SMCT1 et de manière intéressante à l’expression d’un autre transporteur de monocarboxylates, MCT1. L’analyse de l’ensemble des essais, y compris le fait que l’amplitude du transport observé est 20 fois plus grande que celle du courant de fuite nous mène à proposer que SMCT1 puisse transporter l’iode de façon électroneutre. Cependant, le mécanisme par lequel ceci est accompli n’est pas évident à identifier. L’utilisation d’un autre modèle cellulaire serait surement utile pour répondre à cette question.

Expression des cotransporteurs cation-chlorure KCC2 et NKCC1 au cours du développement de la moelle épinière de l’opossum Monodelphis domestica

L’inhibition est nécessaire à la génération d’outputs coordonnés entre muscles antagonistes lors de la locomotion. Une baisse de la concentration neuronale en ions chlorure au cours du développement des mammifères conduit à l’émergence de l’inhibition. Cette baisse repose sur l’équilibre entre deux cotransporteurs cation-chlorure, KCC2 et NKCC1. KCC2 expulse Cl- de la cellule alors que NKCC1 pompe Cl- dans la cellule. L’opossum Monodelphis domestica naît dans un état très immature. Le seul comportement locomoteur qu’il présente à la naissance consiste en des mouvements rythmiques et alternés des membres antérieurs pour grimper le long du ventre de la mère vers une tétine. Les membres postérieurs sont des bourgeons immobiles dont le développement est en grande partie postnatal. Pour cette raison, cette espèce constitue un modèle idéal pour l’étude du développement locomoteur. Afin d’étudier les mécanismes conduisant à l’émergence de l’inhibition durant le développement moteur, nous avons décrit l’expression développementale de KCC2 et NKCC1 chez l’opossum postnatal par immunohistochimie au niveau des renflements spinaux. Les motoneurones et afférences primaires ont été identifiés en utilisant un marquage rétrograde au TRDA. Le marquage pour KCC2 et NKCC1 est détecté dans la moelle épinière ventrale dans la matière grise et blanche présomptive dès la naissance, ce qui suggère que l’inhibition serait déjà mise en place avant la naissance, permettant subséquemment l’alternance des membres antérieurs observée chez les nouveau-nés. L’expression développementale de KCC2 et NKCC1 suit des gradients ventrodorsal et médiolatéral, tels qu’observés chez les rongeurs (rats et souris). Le patron mature d’expression de ces cotransporteurs est observé aux alentours de la 5ème semaine postnatale lorsque la locomotion de l’opossum est mature. Enfin, entre la naissance et P5, les dendrites exprimant KCC2 au niveau de la corne dorsale sont retrouvées en apposition aux afférences primaires ce qui suggère un rôle de KCC2 dans la formation des circuits sensori-moteurs.

Rôles des protéines Staufen 1 et 2 dans la plasticité synaptique des cellules pyramidales hippocampiques

La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes qui demeurent encore incertains quant aux origines cellulaire et moléculaire. Il est maintenant connu que des changements au niveau des synapses, comme la plasticité synaptique, pourraient déterminer la base cellulaire de la formation de la mémoire. Alors que la potentialisation à long-terme (LTP) représente un renforcement de l’efficacité de transmission synaptique, la dépression à long-terme (LTD) constitue une diminution de l’efficacité des connexions synaptiques. Des études ont mis à jour certains mécanismes qui participent à ce phénomène de plasticité synaptique, notamment, les mécanismes d’induction et d’expression, ainsi que les changements morphologiques des épines dendritiques. La grande majorité des synapses excitatrices glutamatergiques se situe au niveau des épines dendritiques et la présence de la machinerie traductionnelle près de ces protubérances suggère fortement l’existence d’une traduction locale d’ARNm. Ces ARNm seraient d’ailleurs acheminés dans les dendrites par des protéines pouvant lier les ARNm et assurer leur transport jusqu’aux synapses activées. Le rôle des protéines Staufen (Stau1 et Stau2) dans le transport, la localisation et dans la régulation de la traduction de certains ARNm est bien établi. Toutefois, leur rôle précis dans la plasticité synaptique demeure encore inconnu. Ainsi, cette thèse de doctorat évalue l’importance des protéines Staufen pour le transport et la régulation d’ARNm dans la plasticité synaptique. Nous avons identifié des fonctions spécifiques à chaque isoforme; Stau1 et Stau2 étant respectivement impliquées dans la late-LTP et la LTD dépendante des récepteurs mGluR. Cette spécificité s’applique également au rôle que chaque isoforme joue dans la morphogenèse des épines dendritiques, puisque Stau1 semble nécessaire au maintien des épines dendritiques matures, alors que Stau2 serait davantage impliquée dans le développement des épines. D’autre part, nos travaux ont permis de déterminer que la morphogenèse des épines dendritiques dépendante de Stau1 était régulée par une plasticité synaptique endogène dépendante des récepteurs NMDA. Finalement, nous avons précisé les mécanismes de régulation de l’ARNm de la Map1b par Stau2 et démontré l’importance de Stau2 pour la production et l’assemblage des granules contenant les transcrits de la Map1b nécessaires pour la LTD dépendante des mGluR. Les travaux de cette thèse démontrent les rôles spécifiques des protéines Stau1 et Stau2 dans la régulation de la plasticité synaptique par les protéines Stau1 et Stau2. Nos travaux ont permis d’approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes de régulation des ARNm par les protéines Staufen dans la plasticité synaptique. MOTS-CLÉS EN FRANÇAIS: Staufen, hippocampe, plasticité synaptique, granules d’ARN, traduction, épines dendritiques.

Caractérisation des complexes ribonucléoprotéiques de Staufen1 et Staufen2

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.

Récepteur EphA7 : expression régionale dans le cerveau et localisation ultrastructurale dans l’hippocampe chez le rat et la souris adultes

Bourse de maîtrise du Groupe de recherche sur le système nerveux central GRSNC, (2009,2010) Bourse d’études supérieures du Canada Frederick Banting et Charles Best, IRSC Instituts de recherche en santé du Canada, (2011)

Cell wall composition regulates cell shape and growth behaviour in pollen tubes

L’une des particularités fondamentales caractérisant les cellules végétales des cellules animales est la présence de la paroi cellulaire entourant le protoplaste. La paroi cellulaire joue un rôle primordial dans (1) la protection du protoplaste, (2) est impliquée dans les mécanismes de filtration et (3) est le lieu de maintes réactions biochimiques nécessaires à la régulation du métabolisme et des propriétés mécaniques de la cellule. Les propriétés locales d’élasticité, d’extensibilité, de plasticité et de dureté des composants pariétaux déterminent la géométrie et la forme des cellules lors des processus de différentiation et de morphogenèse. Le but de ma thèse est de comprendre les rôles que jouent les différents composants pariétaux dans le modelage de la géométrie et le contrôle de la croissance des cellules végétales. Pour atteindre cet objectif, le modèle cellulaire sur lequel je me suis basé est le tube pollinique ou gamétophyte mâle. Le tube pollinique est une protubérance cellulaire qui se forme à partir du grain de pollen à la suite de son contact avec le stigmate. Sa fonction est la livraison des cellules spermatiques à l’ovaire pour effectuer la double fécondation. Le tube pollinique est une cellule à croissance apicale, caractérisée par la simple composition de sa paroi et par sa vitesse de croissance qui est la plus rapide du règne végétal. Ces propriétés uniques font du tube pollinique le modèle idéal pour l’étude des effets à courts termes du stress sur la croissance et le métabolisme cellulaire ainsi que sur les propriétés mécaniques de la paroi. La paroi du tube pollinique est composée de trois composantes polysaccharidiques : pectines, cellulose et callose et d’une multitude de protéines. Pour comprendre les effets que jouent ces différents composants dans la régulation de la croissance du tube pollinique, j’ai étudié les effets de mutations, de traitements enzymatiques, de l’hyper-gravité et de la gravité omni-directionnelle sur la paroi du tube pollinique. En utilisant des méthodes de modélisation mathématiques combinées à de la biologie moléculaire et de la microscopie à fluorescence et électronique à haute résolution, j’ai montré que (1) la régulation de la chimie des pectines est primordiale pour le contrôle du taux de croissance et de la forme du tube et que (2) la cellulose détermine le diamètre du tube pollinique en partie sub-apicale. De plus, j’ai examiné le rôle d’un groupe d’enzymes digestives de pectines exprimées durant le développement du tube pollinique : les pectate lyases. J’ai montré que ces enzymes sont requises lors de l’initiation de la germination du pollen. J’ai notamment directement prouvé que les pectate lyases sont sécrétées par le tube pollinique dans le but de faciliter sa pénétration au travers du style.

Rôle du récepteur aux cannabinoïdes CB2 sur la synaptogenèse

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer.

Rôle du récepteur EphA4 dans la plasticité structurale neurono-gliale du noyau supraoptique à la suite d’un régime à l’eau salée

Les noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV) de l’hypothalamus montrent un phénomène réversible de plasticité structurale neurono-gliale dans diverses conditions physiologiques telles que la parturition, l’allaitement ou lors d’une surcharge en sel. En effet, les feuillets astrocytaires qui enveloppent normalement les somas et dendrites des neurones à ocytocine (OT) ou à vasopressine (AVP) se rétractent alors, autour des neurones à OT, laissant place à la formation de nouvelles synapses, surtout GABAergiques. Nous avons émis l’hypothèse voulant que ces mouvements cellulaires soient régulés par des molécules connues pour leurs rôles dans l’adhérence et la motilité cellulaires, notamment les récepteurs Eph et les éphrines (Efn). Nous avons étudié le rôle de l’un de ces récepteurs, EphA4, un récepteur à tyrosine kinase reconnaissant l’ensemble des Efn, A ou B, puis tenté d’identifier les Efn partenaires dans le NSO, à la suite d’une surcharge en sel. Pour démontrer la présence d’EphA4 dans le NSO et déterminer l’effet d’une surcharge en sel sur son expression et sa localisation, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie en microscopie électronique, sur des coupes de cerveaux de souris ou rats traités ou non à l’eau salée pendant 1-7 j, avec des ribosondes ou des anticorps spécifiques pour EphA4. Ces travaux ont démontré une augmentation de l’expression d’EphA4 dans le NSO, notamment dans des dendrites, après le régime salé. La distribution de cette expression correspondait à celle des neurones OT et était absente de la glia limitans. Nous avons ensuite déterminé l’effet d’une absence d’EphA4 sur les mouvements astrocytaires et la synaptogènese autour des dendrites à OT et AVP, en utilisant des souris EphA4 knockouts et des souris de type sauvage des mêmes portées. Nous avons ainsi mesuré la couverture astrocytaire des dendrites OT ou AVP, identifiées par immunocytochimie anti-OT ou anti-AVP, en microscopie électronique. Ces mesures ont confirmé la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse autour des dendrites OT, mais pas autour des dendrites AVP, chez les souris de type sauvage, et démontré que la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse sur les dendrites OT ne se produisait pas chez les souris knockouts soumises à la surcharge en sel. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle d’EphA4 dans cette plasticité structurale neurono-gliale. Afin d’identifier l’Efn partenaire d’EphA4 dans cette fonction, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les EfnB3 et -A3. L’hybridation in situ n’a pas démontré d’expression de l’EfnB3 dans le NSO, tandis que les résultats pour l’EfnA3 restent à quantifier. Cependant, l’immunohistochimie anti-EfnA3 montre un marquage d’astrocytes dans le NSO et la glia limitans, marquage qui semble augmenter après surcharge en sel, mais il reste à démontrer que l’anticorps anti-EfnA3 est bien spécifique et à quantifier les éventuels changements sur un plus grand nombre d’animaux. L’ensemble de ces observations démontre un rôle du récepteur EphA4 dans les mécanismes à la base des changements structuraux neurono-gliaux du NSO et pointe vers l’EfnA3 comme partenaire d’EphA4 dans ce modèle.

Intestin et défauts métaboliques dans la résistance à l'insuline

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2.

Prédiction de l'évolution de la scoliose idiopathique de l'adolescent à l'aide des paramètres tridimensionnels du rachis

La scoliose idiopathique de l’adolescent est une déformation 3D du rachis. La littérature comporte une multitude d’études sur la prédiction de l’évolution et l’identification de facteurs de risque de progression. Pour l’instant les facteurs de risque établis sont l’amplitude de la déformation, la maturité squelettique et le type de courbure. Plusieurs autres champs ont été explorés comme les aspects génétiques, biochimiques, mécaniques, posturaux et topographiques, sans vraiment apporter beaucoup de précision à la prédiction de l’évolution. L’avancement de la technologie permet maintenant de générer des reconstructions 3D du rachis à l’aide des radiographies standard et d’obtenir des mesures de paramètres 3D. L’intégration de ces paramètres 3D dans un modèle prédictif représente une avenue encore inexplorée qui est tout à fait logique dans le contexte de cette déformation 3D du rachis. L’objectif général de cette thèse est de développer un modèle de prédiction de l’angle de Cobb à maturité squelettique à partir de l’information disponible au moment de la première visite, soit l’angle de Cobb initial, le type de courbure, l’âge osseux et des paramètres 3D du rachis. Dans une première étude, un indice d’âge osseux a été développé basé sur l’ossification de l’apophyse iliaque et sur le statut du cartilage triradié. Cet indice comporte 3 stades et le second stade, qui est défini par un cartilage triradié fermé avec maximum 1/3 d’ossification de l’apophyse iliaque, représente le moment pendant lequel la progression de la scoliose idiopathique de l’adolescent est la plus rapide. Une seconde étude rétrospective a permis de mettre en évidence le potentiel des paramètres 3D pour améliorer la prédiction de l’évolution. Il a été démontré qu’à la première visite il existe des différences pour 5 paramètres 3D du rachis entre un groupe de patients qui sera éventuellement opéré et un groupe qui ne progressera pas. Ces paramètres sont : la moyenne da la cunéiformisation 3D des disques apicaux, la rotation intervertébrale à la jonction inférieure de la courbure, la torsion, le ratio hauteur/largeur du corps vertébral de T6 et de la colonne complète. Les deux dernières études sont basées sur une cohorte prospective de 133 patients avec une scoliose idiopathique de l’adolescent suivi dès leur première visite à l’hôpital jusqu’à maturité squelettique. Une première étude a permis de mettre en évidence les différences morphologiques à la première visite entre les patients ayant progresser de plus ou moins de 6°. Des différences ont été mise en évidence pour la cyphose, l’angle de plan de déformation maximal, la rotation ntervertébrale l’apex, la torsion et plusieurs paramètres de «slenderness». Ensuite une seconde étude a permis de développer un modèle prédictif basé sur un modèle linéaire général en incluant l’indice d’âge osseux développé dans la première étude, le type de courbure, l’amplitude de l’angle de Cobb à la première visite, l’angle de déformation du plan maximale, la cunéiformisation 3D des disques T3-T4, T8-­T9, T11-­T12 et la somme des cunéiformisation 3D de tous les disques thoraciques et lombaires. Le coefficient de détermination multiple pour cette modélisation est de 0.715. Le modèle prédictif développé renforce l’importance de considérer la scoliose idiopathique dans les trois dimensions et il permettra d’optimiser la prédiction de l’évolution au moment de la première visite.

Studying the cytomechanic aspects of pollen tube growth behavior using Lab-On-Chip technology

L'élongation cellulaire de cellules cultivant bout comme hyphae fongueux, inculquez hairs, des tubes de pollen et des neurones, est limité au bout de la cellule, qui permet à ces cellules d'envahir l'encerclement substrate et atteindre une cible. Les cellules cultivant bout d'équipement sont entourées par le mur polysaccharide rigide qui régule la croissance et l'élongation de ces cellules, un mécanisme qui est radicalement différent des cellules non-walled. La compréhension du règlement du mur de cellule les propriétés mécaniques dans le contrôle de la croissance et du fonctionnement cellulaire du tube de pollen, une cellule rapidement grandissante d'équipement, est le but de ce projet. Le tube de pollen porte des spermatozoïdes du grain de pollen à l'ovule pour la fertilisation et sur sa voie du stigmate vers l'ovaire le tube de pollen envahit physiquement le stylar le tissu émettant de la fleur. Pour atteindre sa cible il doit aussi changer sa direction de croissance les temps multiples. Pour évaluer la conduite de tubes de pollen grandissants, un dans le système expérimental vitro basé sur la technologie de laboratoire-sur-fragment (LOC) et MEMS (les systèmes micro-électromécaniques) ont été conçus. En utilisant ces artifices nous avons mesuré une variété de propriétés physiques caractérisant le tube de pollen de Camélia, comme la croissance la croissance accélérée, envahissante et dilatant la force. Dans une des organisations expérimentales les tubes ont été exposés aux ouvertures en forme de fente faites de l'élastique PDMS (polydimethylsiloxane) la matière nous permettant de mesurer la force qu'un tube de pollen exerce pour dilater la croissance substrate. Cette capacité d'invasion est essentielle pour les tubes de pollen de leur permettre d'entrer dans les espaces intercellulaires étroits dans les tissus pistillar. Dans d'autres essais nous avons utilisé l'organisation microfluidic pour évaluer si les tubes de pollen peuvent s'allonger dans l'air et s'ils ont une mémoire directionnelle. Une des applications auxquelles le laboratoire s'intéresse est l'enquête de processus intracellulaires comme le mouvement d'organelles fluorescemment étiqueté ou les macromolécules pendant que les tubes de pollen grandissent dans les artifices LOC. Pour prouver que les artifices sont compatibles avec la microscopie optique à haute résolution et la microscopie de fluorescence, j'ai utilisé le colorant de styryl FM1-43 pour étiqueter le système endomembrane de tubes de pollen de cognassier du Japon de Camélia. L'observation du cône de vésicule, une agrégation d'endocytic et les vésicules exocytic dans le cytoplasme apical du bout de tube de pollen, n'a pas posé de problèmes des tubes de pollen trouvés dans le LOC. Pourtant, le colorant particulier en question a adhéré au sidewalls du LOC microfluidic le réseau, en faisant l'observation de tubes de pollen près du difficile sidewalls à cause du signal extrêmement fluorescent du mur. Cette propriété du colorant pourrait être utile de refléter la géométrie de réseau en faisant marcher dans le mode de fluorescence.

Caractérisation biochimique et fonctionnelle du mutant T179N de l’aquaporine-2 humaine

L’aquaporine-2 (AQP2) est le canal responsable de la réabsorption finale d’eau au niveau du tubule collecteur du rein. À la base, contenue dans des vésicules internes, l’AQP2 est acheminée à la membrane apicale des cellules principales du tubule collecteur suite à une stimulation par l’hormone antidiurétique (ADH). L’incapacité à accomplir cette fonction entraîne le diabète insipide néphrogénique (DIN), une maladie caractérisée par l’inhabileté du rein à concentrer l’urine, entraînant une production de volumes urinaires élevés. Alors que les mutations récessives génèrent des protéines mal structurées et incapables de former des tétramères, les mutations dominantes sont capables de s’associer à leurs homologues sauvages, engendrant ainsi un DIN même chez les patients hétérozygotes. Ce mémoire présente l’analyse biochimique et fonctionnelle d’une nouvelle mutation naturelle de l’AQP2, la mutation T179N, aussi responsable du DIN. Cette dernière est particulièrement intéressante de par son génotype qui implique un caractère dominant, et sa position extracellulaire habituellement réservée aux mutations récessives. Les études comparatives de T179N à deux modèles de mutation récessive et dominante démontrent, tant en ovocytes de Xenopus laevis qu’en lignée cellulaire mpkCCDc14, le caractère récessif de cette nouvelle mutation. Les tests d’immunobuvardage de lysats d’ovocytes en membranes totales et membranes plasmiques purifiées ont révélé que seule la forme sauvage atteint la membrane plasmique alors que le mutant T179N est séquestré dans la cellule. En accord avec ce résultat, les analyses de perméabilité fonctionnelle démontrent aussi une absence d’activité pour T179N. En cellule mpkCCDc14, le mutant T179N exprimé seul n’atteint pas la membrane plasmique suite à l’action de la forskoline, contrairement à la forme sauvage. Cependant, ce mutant peut s’associer à son homologue sauvage en coexpression tant dans les ovocytes qu’en lignée mpkCCDc14 sans toutefois engendrer l’effet typique de dominance négative. En fait, dans ce contexte de coexpression, on remarque une augmentation de la Pf de 83±7 % et une récupération d’adressage à la membrane plasmique en cellule (immunofluorescence). En conclusion, T179N serait un mutant récessif fonctionnellement récupérable lorsqu’en présence de l’AQP2 sauvage.