STRATEGIES FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION

Hepatitis C virus (HCV) is the causative agent of Hepatitis C, a serious global health problem which results in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Currently there is no effective treatment or vaccine against the virus. Therefore, development of a therapeutic vaccine is of paramount importance. In this project, three alternative approaches were used to control HCV including a DNA vaccine, a recombinant viral vaccine and RNA interference. The first approach was to test the effect of different promoters on the efficacy of a DNA vaccine against HCV. Plasmids encoding HCV-NS3 and E1 antigens were designed under three different promoters, adenoviral E1A, MLP, and CMV ie. The promoter effect on the antigen expression in 293 cells, as well as on the antibody level in immunized BALB/c mice, was evaluated. The results showed that the antigens were successfully expressed from all vectors. The CMV ie promoter induced the highest antigen expression and the highest antibody level. Second, the efficiency of a recombinant adenovirus vaccine encoding HCV-NS3 was compared to that of a HCV-NS3 plasmid vaccine. The results showed that the recombinant adenovirus vaccine induced higher antibody levels as compared to the plasmid vaccine. The relationship between the immune response and miRNA was also evaluated. The levels of mir-181, mir-155, mir-21 and mir-296 were quantified in the sera of immunized animals. mir-181 and mir-21 were found to be upregulated in animals injected with adenoviral vectors. Third, two recombinant adenoviruses encoding siRNAs targeting both the helicase and protease parts of the NS3 region were tested for their ability to inhibit NS3 expression. The results showed that the siRNA against protease was more effective in silencing the HCV-NS3 gene in a HCV replicon cell line. This result confirmed the efficiency of adenovirus for siRNA delivery. These results confirmed that CMV ie is optimum promoter for immune response induction. Adenovirus was shown to be an effective delivery vector for antigens or siRNAs. In addition, miRNAs were proved to be involved in the regulation of immune response.

Heuristics for the Critical Node Detection Problem in Large Complex Networks

Complex networks have recently attracted a significant amount of research attention due to their ability to model real world phenomena. One important problem often encountered is to limit diffusive processes spread over the network, for example mitigating pandemic disease or computer virus spread. A number of problem formulations have been proposed that aim to solve such problems based on desired network characteristics, such as maintaining the largest network component after node removal. The recently formulated critical node detection problem aims to remove a small subset of vertices from the network such that the residual network has minimum pairwise connectivity. Unfortunately, the problem is NP-hard and also the number of constraints is cubic in number of vertices, making very large scale problems impossible to solve with traditional mathematical programming techniques. Even many approximation algorithm strategies such as dynamic programming, evolutionary algorithms, etc. all are unusable for networks that contain thousands to millions of vertices. A computationally efficient and simple approach is required in such circumstances, but none currently exist. In this thesis, such an algorithm is proposed. The methodology is based on a depth-first search traversal of the network, and a specially designed ranking function that considers information local to each vertex. Due to the variety of network structures, a number of characteristics must be taken into consideration and combined into a single rank that measures the utility of removing each vertex. Since removing a vertex in sequential fashion impacts the network structure, an efficient post-processing algorithm is also proposed to quickly re-rank vertices. Experiments on a range of common complex network models with varying number of vertices are considered, in addition to real world networks. The proposed algorithm, DFSH, is shown to be highly competitive and often outperforms existing strategies such as Google PageRank for minimizing pairwise connectivity.

HG 244.40-244.50-A Thin Section

Dark brown sediment with sub-angular to sub-rounded clasts. Rotation structures and lineations are common. Clasts ranging from small to large in size. Many large grains are fractured. Minor amounts of grain stacking and crushing can be seen. A few clay and organic rich domains can be seen.

HG 244.40-244.55-B Thin Section

Coarse grained sample with sub-angular to sub-rounded clasts ranging from small-large in size. Rotation structures, grain crushing and lineations were seen throughout the sample.

STRUCTURAL ANALYSIS, LAYER THICKNESS MEASUREMENTS AND MINERALOGICAL INVESTIGATION OF THE LARGE INTERIOR LAYERED DEPOSIT WITHIN GANGES CHASMA, VALLES MARINERIS, MARS

The interior layered deposit (ILD) in Ganges Chasma, Valles Marineris, is a 4.25 km high mound that extends approximately 110 km from west to east. The deposition, deformation, and erosion history of the Ganges ILD records aids in identifying the processes that formed and shaped the Chasma. To interpret structural and geomorphic processes acting on the ILD, multiple layer attitudes and layer thickness transects were conducted on the Ganges ILD. Mineralogical data was analyzed to determine correlations between materials and landforms. Layer thickness measurements indicate that the majority of layers are between 0.5 m and 4 m throughout the ILD. Three major benches dominate the Ganges ILD. Layer thicknesses increase at the ILD benches, suggesting that the benches are formed from the gradual thickening of layers. This indicates that the benches are depositional features draping over basement topography. Layer attitudes indicate overall shallow dips generally confined to a North-South direction that locally appear to follow bench topography. Layering is disrupted on a scale of 40 m to 150 m in 12 separate locations throughout the ILD. In all locations, underlying layering is disturbed by overlying folded layers in a trough-like geometry. These features are interpreted to have formed as submarine channels in a lacustrine setting, subsequently infilled by sediments. Subsequently, the channels were eroded to the present topography, resulting in the thin, curved layering observed. Data cannot conclusively support one ILD formation hypothesis, but does indicate that the Ganges ILD postdates Chasma formation. The presence of water altered minerals, consistently thin layering, and layer orientations provide strong evidence that the ILD formed in a lacustrine setting.

HG 268.40-268.55 Thin Section

This is a coarse grained sample with some very fine grained domains throughout the sample. The clast shape and size range from small to large, as well as angular to sub-rounded. Grain crushing is the most prevalent in this sample. It also contains some rotation structures and minor necking structures. Lineations and grain stacking can also be seen.

HG 291.40-291.55 Thin Section

Coarse grained sample with inclusions of finer grained sediment. Clasts are small to large in size and angular to sub-rounded in shape. Grain crushing is abundant in this sample, and lineations and minor grain stacks can also be seen.

HG 320.30-320.40

Dark brown sediment with small to large sized clasts. The clasts are sub-angular to sub-rounded in shape. Lineations are the most abundant. Minor amounts of rotation structures and comet structures can also be seen. Grain crushing is also present throughout the sample.

HG 46.40-46.50

Brown sediment with areas of clay rich material (darker brown). Clasts range from small to large in size. Clast shape ranges from angular to rounded. Rotation structures and necking structures were abundant in this sample. Some lineations and grain stacking can also be seen throughout the sample.

HG 70.40-70.50

Dark brown sediment with clasts ranging from small to large in size. Clast shape ranges from angular to sub-rounded. Lineations and comet structures can commonly be seen throughout the sample. Some rotation structures and grain crushing can also be seen in varying amounts.

HG 120.30-120.40

Brown sediment with clasts ranging from small to large in size. The clast shape ranges from sub-angular to sub-rounded. Lineations are common throughout this sample. Comet structures and minor amounts of rotation structures can also be seen.

New pandemics: HIV and AIDS, HCV and chronic hepatitis, Influenza virus and flu.

New pandemics are a serious threat to the health of the entire world. They are essentially of viral origin and spread at large speed. A meeting on this topic was held in Lyon, France, within the XIXth Jacques Cartier Symposia, a series of France-Québec meetings held every year. New findings on HIV and AIDS, on HCV and chronic hepatitis, and an update on influenza virus and flu were covered during this meeting on December 4 and 5, 2006. Aspects of viral structure, virus-host interactions, antiviral defenses, drugs and vaccinations, and epidemiological aspects were discussed for HIV and HCV. Old and recent data on the flu epidemics ended this meeting.

Mécanismes de défense immunitaire innée impliqués dans l’hépatite aiguë induite par le virus de l’hépatite murine de type 3

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.