Charakterisierung des Ubiquitin-ähnlichen Proteins Urm1 in Saccharomyces cerevisiae

Das ursprünglich in S. cerevisiae identifizierte Urm1 stellt aufgrund seiner dualen Funktionsweise ein besonderes UBL dar. In einem Prozess, der als Urmylierung bezeichnet wird, kann es ähnlich dem Ubiquitin kovalent mit anderen Proteinen verknüpft werden. Zusätzlich fungiert es aber auch als Schwefelträger, der an der Thiolierung des wobble-Uridins bestimmter cytoplasmatischer tRNAs beteiligt ist. Während neuere Untersuchungen zeigen, dass die Urm1-abhängige tRNA-Thiolierung zu einer effizienten Translation in Eukaryoten beiträgt, ist die Bedeutung der Urmylierung immer noch unklar. Um die Funktion der Urm1-vermittelten Proteinmodifikation weiter aufzuklären, wurde die Urmylierung des Peroxiredoxins Ahp1 im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Es konnte demonstriert werden, dass Ahp1 nicht nur als Monomer, sondern auch als Dimer urmyliert vorliegt. Dies deutet darauf hin, dass die Urmylierung mit dem peroxidatischen Zyklus von Ahp1 verknüpft ist. Diese Annahme konnte durch die Untersuchung der Modifikation verschiedener ahp1-Punktmutanten bestätigt werden. Hierbei ließ sich ebenfalls zeigen, dass das Peroxiredoxin wahrscheinlich auch an alternativen Lysinresten urmyliert werden kann. Trotzdem bleibt unklar, inwiefern die Funktionalität von Ahp1 durch die Urm1-Konjugation beeinträchtigt wird. So konnte ein Einfluss der Urmylierung auf die Ahp1-vermittelte Entgiftung des Alkylhydroperoxids t-BOOH nicht festgestellt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung einer möglichen mechanistischen Verknüpfung beider Urm1-Funktionen. Es ließ sich zeigen, dass nicht nur Schwefelmangel, sondern auch ein Verlust der Schwefeltransferase Tum1 zu einer drastischen Reduktion der Urm1-Konjugation führt. Demnach wird die Urmylierung wahrscheinlich über denselben Schwefeltransferweg vermittelt, der ebenfalls zur tRNA-Thiolierung beiträgt. Trotzdem ist der Schwefeltransfer, der zur Urm1-Aktivierung führt, womöglich komplexer als bisher angenommen. Wurden die vermuteten katalytischen Cysteine des Urm1-Aktivatorproteins Uba4 mutiert oder dessen C-terminale RHD entfernt, waren eine gehemmte Urmylierung und tRNA-Thiolierung weiterhin nachweisbar. Somit scheint ein Schwefeltransfer auf Urm1 auch ohne direkte Beteiligung von Uba4 möglich zu sein. In dieser Arbeit ließ sich außerdem zeigen, dass Urm1 in Hefe durch sein humanes Homolog funktional ersetzt werden kann. Dies ist ein Hinweis dafür, dass der Urm1-Weg in allen Eukaryoten gleich funktioniert und konserviert ist. Darüber hinaus scheint für die Urmylierung auch eine Konservierung der Substratspezifität gegeben zu sein. Der Nachweis einer Uba4-Urmylierung in Hefe könnte durchaus darauf hindeuten.

Defects in Self Assembled Colloidal Crystals

Colloidal self assembly is an efficient method for making 3-D ordered nanostructures suitable for materials such as photonic crystals and macroscopic solids for catalysis and sensor applications. Colloidal crystals grown by convective methods exhibit defects on two different scales. Macro defects such as cracks and void bands originate from the dynamics of meniscus motion during colloidal crystal growth while micro defects like vacancies, dislocation and stacking faults are indigenous to the colloidal crystalline structure. This paper analyses the crystallography and energetics of the microscopic defects from the point of view of classical thermodynamics and discusses the strategy for the control of the macroscopic defects through optimization of the liquid-vapor interface.

Low genetic diversity and functional constraint in loci encoding Plasmodium vivax P12 and P38 proteins in the Colombian population

Background Plasmodium vivax is one of the five species causing malaria in human beings, affecting around 391 million people annually. The development of an anti-malarial vaccine has been proposed as an alternative for controlling this disease. However, its development has been hampered by allele-specific responses produced by the high genetic diversity shown by some parasite antigens. Evaluating these antigens’ genetic diversity is thus essential when designing a completely effective vaccine. Methods The gene sequences of Plasmodium vivax p12 (pv12) and p38 (pv38), obtained from field isolates in Colombia, were used for evaluating haplotype polymorphism and distribution by population genetics analysis. The evolutionary forces generating the variation pattern so observed were also determined. Results Both pv12 and pv38 were shown to have low genetic diversity. The neutral model for pv12 could not be discarded, whilst polymorphism in pv38 was maintained by balanced selection restricted to the gene’s 5′ region. Both encoded proteins seemed to have functional/structural constraints due to the presence of s48/45 domains, which were seen to be highly conserved.

Identification of plasmodium vivax proteins with potential role in invasion using sequence redundancy reduction and profile hidden markov models

Background: This study describes a bioinformatics approach designed to identify Plasmodium vivax proteins potentially involved in reticulocyte invasion. Specifically, different protein training sets were built and tuned based on different biological parameters, such as experimental evidence of secretion and/or involvement in invasion-related processes. A profile-based sequence method supported by hidden Markov models (HMMs) was then used to build classifiers to search for biologically-related proteins. The transcriptional profile of the P. vivax intra-erythrocyte developmental cycle was then screened using these classifiers. Results: A bioinformatics methodology for identifying potentially secreted P. vivax proteins was designed using sequence redundancy reduction and probabilistic profiles. This methodology led to identifying a set of 45 proteins that are potentially secreted during the P. vivax intra-erythrocyte development cycle and could be involved in cell invasion. Thirteen of the 45 proteins have already been described as vaccine candidates; there is experimental evidence of protein expression for 7 of the 32 remaining ones, while no previous studies of expression, function or immunology have been carried out for the additional 25. Conclusions: The results support the idea that probabilistic techniques like profile HMMs improve similarity searches. Also, different adjustments such as sequence redundancy reduction using Pisces or Cd-Hit allowed data clustering based on rational reproducible measurements. This kind of approach for selecting proteins with specific functions is highly important for supporting large-scale analyses that could aid in the identification of genes encoding potential new target antigens for vaccine development and drug design. The present study has led to targeting 32 proteins for further testing regarding their ability to induce protective immune responses against P. vivax malaria.

A "Trojan horse" strategy to reverse drug-resistance in brain tumors

Los gliomas malignos representan una de las formas más agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificación de los tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patología subyacente. Es así como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplásico (grado III) así como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos últimos los más agresivos con el peor pronóstico (1). El manejo terapéutico de los tumores del SNC se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las características del tumor, el estadio clínico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estándar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opción en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metástasis múltiple, pero el pronóstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiogénicas (4); o terapias génicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares específicos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetración de muchas drogas anticáncer a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interacción de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las células endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las células tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es característico de varios tumores sólidos. Este fenotipo también está presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigación (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a través de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas moléculas pequeñas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoproteína P (Pgp: P-gycoprotein), así como también de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la proteína relacionada con cáncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un fármaco utilizado en la terapia anti cáncer, el cual es muy eficaz para atacar las células del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clínico limitado por la poca entrega a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las células de BBB y las células del tumor cerebral tienen también proteínas superficiales, como el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), que podría utilizarse como blanco terapéutico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generación de estrategias terapéuticas que promuevan el paso de las drogas a través de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresión de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos terapéuticos.Este estudio demostró que el uso de una nueva estrategia basada en el “Caballo de Troya”, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las células del tumor. La construcción del liposoma permitió utilizar el receptor LDLR de las células asegurando la entrada a través de la BBB y hacia las células tumorales a través de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresión de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitración de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulación denominada ApolipoDOXO más el uso de estatinas favorece la administración de fármacos a través de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Además esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque terapéutico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes fármacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipóxico,característico de las células cancerosas, donde la expresión del transportador Pgp se vió aumentada. Teniendo en cuenta la relación entre algunas vías de señalización reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino también otra propuesta terapéutica relacionada con el uso de Temozolomide más DOXOrubicina. Esta estrategia demostró que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de señalización de la Wnt/GSK3/β-catenina, la cual modula la expresión del transportador Pgp. Se demostró que el TMZ disminuye la proteína y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hipótesis de que la droga al disminuir la transcripción del gen Wnt3 en células de BBB, incrementa la activación de la vía fosforilando la β-catenina y conduciendo a disminuir la β-catenina nuclear y por tanto su unión al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permitió el reconocimiento de tres mecanismos básicos relacionados con la expresión de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitración de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripción NFκB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de señalización de la la β-catenina, disminuyendo la expresión del transportador Pgp. El tercero consistió en la determinación de la relación entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no canónica) GSK3/β-catenina. Se demostró que la proteína quinasa RhoA promovió la activación de la proteína PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilación de la β-catenina, lo cual dio lugar a su destrucción por el proteosoma, evitando su unión al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresión. En conclusión las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las células tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoencefálica, sino también de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del “Caballo de Troya” podría ser útil para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresión de los transportadores ABC podría constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticáncer.

Glycan alterations of serum proteins as tumour markers. Prostate-specific antigen in prostate cancer and acute-phase proteins in pancreatic cancer

Els pacients amb càncer presenten una taxa de supervivència superior si es diagnostiquen a estadis inicials, per la qual cosa és indispensable disposar de marcadors tumorals adequats. Glicoformes de proteïnes específiques es podrian utilizar com marcadors tumorals. S’han investigat les subformes i glicosilació de l’Antígen Prostàtic Específic (PSA) per millorar la seva capacitat de diagnosis de pacients amb càncer de pròstata vs aquells amb hiperplàsia benigna prostàtica. També s’han avaluat glicoproteïnes sèriques amb alteracions glucídiques en pacients de càncer de pàncrees, comparat amb pacients amb pancreatitis crònica i controls. S’ha observat una disminució de la fucosilació core i sialilació del PSA en càncer de pròstata i un augment de la fucosilació core i Sialyl-Lewis X en algunes Proteïnes de fase Aguda en càncer de pàncrees. Aquest canvis s’haurien d’avaluar en un cohort de pacients més gran per determinar el seu paper en el cribratge, diagnòstic o monitorització dels cancers estudiats.

Role of synuclein proteins in auditory function

The recent discovery of synuclein proteins in peripheral auditory tissues has prompted a closer examination of the role of these proteins in hearing. In the present study, auditory brainstem response thresholds of synuclein knockout mice are compared to wild type mice.

Interactions of alpha and beta synuclein proteins in auditory functioning

Alpha-synuclein is found in synaptic terminals at the base of both inner and outer hair cells, while the beta isoform is prominently localized to spiral ganglion neuron cell bodies. The present study assessed the role of beta-synuclein in auditory function, and potential interactions between isoforms.

Electronic structure of point defects in controlled self-doping of the TiO2 (110) surface: Combined photoemission spectroscopy and density functional theory study

Point defects in metal oxides such as TiO2 are key to their applications in numerous technologies. The investigation of thermally induced nonstoichiometry in TiO2 is complicated by the difficulties in preparing and determining a desired degree of nonstoichiometry. We study controlled self-doping of TiO2 by adsorption of 1/8 and 1/16 monolayer Ti at the (110) surface using a combination of experimental and computational approaches to unravel the details of the adsorption process and the oxidation state of Ti. Upon adsorption of Ti, x-ray and ultraviolet photoemission spectroscopy (XPS and UPS) show formation of reduced Ti. Comparison of pure density functional theory (DFT) with experiment shows that pure DFT provides an inconsistent description of the electronic structure. To surmount this difficulty, we apply DFT corrected for on-site Coulomb interaction (DFT+U) to describe reduced Ti ions. The optimal value of U is 3 eV, determined from comparison of the computed Ti 3d electronic density of states with the UPS data. DFT+U and UPS show the appearance of a Ti 3d adsorbate-induced state at 1.3 eV above the valence band and 1.0 eV below the conduction band. The computations show that the adsorbed Ti atom is oxidized to Ti2+ and a fivefold coordinated surface Ti atom is reduced to Ti3+, while the remaining electron is distributed among other surface Ti atoms. The UPS data are best fitted with reduced Ti2+ and Ti3+ ions. These results demonstrate that the complexity of doped metal oxides is best understood with a combination of experiment and appropriate computations.

Aberrant mRNA Transcripts and the Nonsense-Mediated Decay Proteins UPF2 and UPF3 Are Enriched in the Arabidopsis Nucleolus

The eukaryotic nucleolus is multifunctional and involved in the metabolism and assembly of many different RNAs and ribonucleoprotein particles as well as in cellular functions, such as cell division and transcriptional silencing in plants. We previously showed that Arabidopsis thaliana exon junction complex proteins associate with the nucleolus, suggesting a role for the nucleolus in mRNA production. Here, we report that the plant nucleolus contains mRNAs, including fully spliced, aberrantly spliced, and single exon gene transcripts. Aberrant mRNAs are much more abundant in nucleolar fractions, while fully spliced products are more abundant in nucleoplasmic fractions. The majority of the aberrant transcripts contain premature termination codons and have characteristics of nonsense-mediated decay (NMD) substrates. A direct link between NMD and the nucleolus is shown by increased levels of the same aberrant transcripts in both the nucleolus and in Up-frameshift (upf) mutants impaired in NMD. In addition, the NMD factors UPF3 and UPF2 localize to the nucleolus, suggesting that the Arabidopsis nucleolus is therefore involved in identifying aberrant mRNAs and NMD.

Interactions of tea tannins and condensed tannins with proteins

Binding parameters for the interactions of four types of tannins: tea catechins, grape seed proanthocyanidins, mimosa 5-deoxy proanthocyanidins,and sorghum procyanidins (mDP=17), with gelatin and bovine serum albumin (BSA) have been determined from isothermal titration calorimetry data. Equilibrium binding constants determined for the interaction with gelatin were in the range 10(4) to 10(6) M-1 and in the order: sorghum procyanidins > grape seed proanthocyanidins > mimosa 5-deoxy proanthocyanidins > tea catechins. Interaction with BSA was generally weaker, with equilibrium binding constants of <= 10(3) M-1 for grape seed proanthocyanidins, mimosa 5-deoxy proanthocyanidins and tea catechins, and 10(4) M-1 for the sorghum procyanidins. In all cases the interactions with proteins were exothermic and involved multiple binding sites on the protein. The data are discussed in relation to the structures and the known nutritional effects of the condensed tannins.