Molecular interactions: metal ions and protein chaperones in the urease system from Helicobacter pylori

Although nickel is a toxic metal for living organisms in its soluble form, its importance in many biological processes recently emerged. In this view, the investigation of the nickel-dependent enzymes urease and [NiFe]-hydrogenase, especially the mechanism of nickel insertion into their active sites, represent two intriguing case studies to understand other analogous systems and therefore to lead to a comprehension of the nickel trafficking inside the cell. Moreover, these two enzymes have been demonstrated to ensure survival and colonization of the human pathogen H. pylori, the only known microorganism able to proliferate in the gastric niche. The right nickel delivering into the urease active site requires the presence of at least four accessory proteins, UreD, UreE, UreF and UreG. Similarly, analogous process is principally mediated by HypA and HypB proteins in the [NiFe]-hydrogenase system. Indeed, HpHypA and HpHypB also have been proposed to act in the activation of the urease enzyme from H. pylori, probably mobilizing nickel ions from HpHypA to the HpUreE-HpUreG complex. A complete comprehension of the interaction mechanism between the accessory proteins and the crosstalk between urease and hydrogenase accessory systems requires the determination of the role of each protein chaperone that strictly depends on their structural and biochemical properties. The availability of HpUreE, HpUreG and HpHypA proteins in a pure form is a pre-requisite to perform all the subsequent protein characterizations, thus their purification was the first aim of this work. Subsequently, the structural and biochemical properties of HpUreE were investigated using multi-angle and quasi-elastic light scattering, as well as NMR and circular dichroism spectroscopy. The thermodynamic parameters of Ni2+ and Zn2+ binding to HpUreE were principally established using isothermal titration calorimetry and the importance of key histidine residues in the process of binding metal ions was studied using site-directed mutagenesis. The molecular details of the HpUreE-HpUreG and HpUreE-HpHypA protein-protein assemblies were also elucidated. The interaction between HpUreE and HpUreG was investigated using ITC and NMR spectroscopy, and the influence of Ni2+ and Zn2+ metal ions on the stabilization of this association was established using native gel electrophoresis, light scattering and thermal denaturation scanning followed by CD spectroscopy. Preliminary HpUreE-HpHypA interaction studies were conducted using ITC. Finally, the possible structural architectures of the two protein-protein assemblies were rationalized using homology modeling and docking computational approaches. All the obtained data were interpreted in order to achieve a more exhaustive picture of the urease activation process, and the correlation with the accessory system of the hydrogenase enzyme, considering the specific role and activity of the involved protein players. A possible function for Zn2+ in the chaperone network involved in Ni2+ trafficking and urease activation is also envisaged.

Isolierung, Reinigung und Expression zentraler Enzyme der Biosynthese des pflanzlichen Antiarrhythmikums Ajmalin

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden im Zuge derAjmalinbiosynthese in Rauvolfia serpentina die NADPH2abhängigen Reduktionsschritte des Alkaloids Vomilenin zu 17O Acetylnorajmalin genauer untersucht.Dabei konnte erstmals die exakte Reaktionsreihenfolgeaufgedeckt und die daran beteiligten Enzyme ausPflanzenzellsuspensionskulturen isoliert und aufgereinigtwerden. Die ausgearbeiteten, optimierten Reinigungsprotokolleführten in wenigen Stufen gezielt zu den voneinandergetrennten Reduktase Fraktionen. Durch die Trennung derReduktase Aktivitäten war der Grundstein gelegt, dasZwischenprodukt der Reaktion anzureichern und mitverschiedenen analytischen Verfahren als 2?-(R)-1.2Dihydrovomilenin zu identifizieren. Die daraufhin vergebenenBezeichnungen Vomilenin Reduktase (EC.1.5.1.32) und 1.2Dihydrovomilenin Reduktase (EC.1.3.1.73) zielen auf dasumzusetzende Substrat ab.Für die Vomilenin Reduktase konnte eine 4 stufige Reinigungüber (NH4)2SO4 Fällung, Anionen-austauschchromatographie mitSOURCE 30Q, Hydrophobe Interaktionschromatographie an SOURCE15Phe und Affinitätschromatographie mit 2’,5’ ADP Sepharoseausgearbeitet werden. Hierbei konnte die 1.2Dihydrovomilenin Reduktase schon nach dem erstensäulenchromatogra-phischen Schritt (S 30Q) abgetrenntwerden. Das am Ende der Proteinreinigung angefertigte SDSGel zeigte nur noch 3 Banden, von denen die beiden bei ca.40 und 43 kDa gelegenen Banden mit dem Aktivitätsverlaufder Vomilenin Reduktase korrelierten. Diese wurden einempartiellen Verdau mit der Endoproteinase LysC unterworfen,wobei jeweils 2 Spaltpeptide erhalten werden konnten.Die 1.2 Dihydrovomilenin Reduktase Reinigung umfaßte 6Reinigungsschritte mit (NH4)2SO4-Fällung, SOURCE 30QAnionenaustauschchromatographie, HydroxylapatitChromatographie, 2’,5’ ADP Sepharose-Chromatographie,Anionenaustausch an DEAE Sepharose und abschließen-denAnionenaustausch über MonoQ. Die resultierendeProteinfraktion wies eine ca. 200 fache Anreicherung an 1.2Dihydrovomilenin Reduktase auf. Auch hierbei wurde die nachSDS Gelelek-trophorese als 1.2 Dihydrovomilenin Reduktasebestimmte Proteinbande (bei ca. 48 kDa) sequen-ziert. Eskonnten vier Peptidfragmente erhalten werden, die ebenso wiedie sequenzierten Peptidstücke der 40 und 43 kDa Bande einehohe Homologie zu Oxidoreduktasen, im einzelnen zuCinnamoylalcohol- und Mannitol Dehydrogenasen, aufwiesen.Um die Identität der sequenzierten Proteinbanden zubestätigen, wurde über „reverse genetics“ die jeweilscodierende cDNA eruiert. Dafür wurden - ausgehend von denPeptidstücken der Mikro-sequenzierung - degenerierte Primerentwickelt und über PCR Teilbereiche der cDNA amplifiziert.Diese konnten für eine radioaktive Durchmusterung einerRauvolfia cDNA Bank herangezogen werden. Alternativ botallein die Kenntnis der spezifischen Nukleotidabfolge dieMöglichkeit der Gewinnung von 5’ und 3’ Ende derVollängenklone durch RACE PCR.Nach Abschluß dieser Arbeiten konnten für die 40 und 48 kDaBande je ein Vollängenklon und für die 43 kDa Bande 2Vollängenklone (Isoformen) gefunden werden. SämtlicheVollängenklone besitzen einen offenen Leserahmen, der durchnicht zu translatierende Bereiche am 5’ und 3‘ Endeeingefaßt wird. Um die entsprechenden Proteine produzierenzu können, mußten die dafür codierenden cDNA Bereiche dereinzelnen Klone in ein geeignetes Vektor Wirt-System(Expressionssystem) eingebracht werden.Nach erfolgreicher Umklonierung wurde die Expression durchIPTG Zugabe kontrolliert und Proteinrohextrakte aus denBakterienstämmen isoliert. Als Substrate wurden Vomilenin,das strukturisomere Alkaloid Perakin und aufgrund derHomologien zu Cinnamoylalcohol und Mannitol Dehydrogenasen Zimtaldehyd, Dihydrozimtaldehyd und D(-)Fructose getestet. In allen E. coli Stämmen konnte ein unspezifischesReduktionspotential nachgewiesen werden, ohne daß jedochVomilenin reduziert wurde. Die Testung der 1.2Dihydrovomilenin Reduktase Klone mußte wegen Substratmangelentfallen.Die weitere Charakterisierung der pflanzlichen Enzymeerbrachte eine enorm hohe Substratspezifität mit einer sichauf Rauvolfia beschränkenden taxonomischen Verbreitung.Die Molekulargewichtsbestimmung für die Vomilenin Reduktaseergab nach Größenausschluß-chromatographie an Superdex 75ein Gewicht von etwa 43 kDa. Das ebenfalls über Superdex 75ermittelte Molekulargewicht für die 1.2 DihydrovomileninReduktase lag bei ca. 49.8 kDa. Weiterhin wurde eine Metallionenabhängigkeit für dieVomilenin Reduktase aufgezeigt und die Cofaktorspezifitätsowie die pH und Temperatur Optima für beide Reduktasenbestimmt.

An evolutionary approach to the design of experiments for combinatorial optimization with an application to enzyme engineering

In a large number of problems the high dimensionality of the search space, the vast number of variables and the economical constrains limit the ability of classical techniques to reach the optimum of a function, known or unknown. In this thesis we investigate the possibility to combine approaches from advanced statistics and optimization algorithms in such a way to better explore the combinatorial search space and to increase the performance of the approaches. To this purpose we propose two methods: (i) Model Based Ant Colony Design and (ii) Naïve Bayes Ant Colony Optimization. We test the performance of the two proposed solutions on a simulation study and we apply the novel techniques on an appplication in the field of Enzyme Engineering and Design.

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Kristallisation und der strukturellen Auswertung der Arbutin-Synthase (AS) und der Strictosidin Glukosidase (SG). Beide Enzyme stammen aus der Medizinalpflanze Rauvolfia serpentina. Für die Kristallisation der Arbutin-Synthase wurden ca. 2500 verschiedene Beding-ungen experimentell untersucht. Für einige dieser Experimente wurde das Enzym molekularbiologisch und chemisch verändert. Trotzdem konnten keine Kristalle erhalten werden. Die bei diesen Veränderungen erhaltenen Ergebnisse wurden anhand von Vergleichen mit Strukturen anderer Glykosyltransferasen der gleichen Familie analysiert. Bei der Reinigung der AS konnte mit verschiedenen Trennsystemen nie eine homogene Lösung produziert werden. Der wahrscheinliche Grund für diese schlechte Isolierbarkeit, und damit der wahrscheinliche Grund für die schwierige Kris-tallisation, liegt in der überdurchschnittlich hohen Anzahl an Cysteinen in der Proteinsequenz. Mit den Aminosäuren Cys171, Cys253 und Cys461 wurden drei Cysteine gefunden, die einem Strukturvergleich nach an der Proteinoberfläche liegen und möglicherweise durch Quervernetzungen mit anderen Proteinmolekülen ein heterogenes Gemisch bilden, das nicht geordnet kristallisieren kann. Durch gezielte Mutationen dieser drei Aminosäuren könnte die Kristallisation zukünftig ermöglicht werden. Für die SG waren bereits Bedingungen bekannt bei denen nicht vermessbare Enzymkristalle (Nadeln) wuchsen. In weit gefächerten Versuchen konnten diese Kristalle jedoch nicht zu 3D-Wachstum angeregt werden. Es wurden mit einem HTS-Screening neue Bedingungen zur Kristallisation gefunden. Anschließend konnten die native Struktur und der Strictosidin/Enzym-Komplex vermessen und aufgeklärt werden. Die SG gehört zur Familie 1 der Glukosidasen (GH-1) und besitzt die in dieser Familie konservierte (beta/alpha)8-Barrel-Faltung. Im Vergleich mit 16 bekannten Glykosidasen der Familie GH-1 wurde die Substratbindung untersucht. Dabei wurde die in der Familie konservierte Zuckerbindung vorgefunden, jedoch große Unterschiede in der Aglykonbindung entdeckt. Es wurden Bedingungen für die Konformationsänderung des Trp388 erkannt. Diese Konformationsänderung dirigiert den Aglykonteil des Substrates auf verschiedene Seiten der Substratbindungstasche und teilt so die Familie GH-1 in zwei Gruppen.

Eine neue Form der Pyruvatkinase in Säugerspermien

Nach Homogenisation ejakulierter Eberspermien und Zentrifugation des Homogenates blieben mehr als 60% der Aktivität des glykolytischen Enzyms Pyruvatkinase (PK) an Zellfragmenten im Sediment gebunden. Diese strukturgebundene PK wurde als PK-S bezeichnet. Das Detergenz Triton X-100 führte nicht zur Ablösung der PK-S; mit Trypsin konnten jedoch rund 80% der PK-S ohne Verlust an Aktivität von den Strukturen gelöst und durch kombinierte Kationenaustausch- und Hydrophobizitätschromatographie gereinigt werden (spezifische Aktivität: 116,7 U/mg Protein). Die lösliche PK aus Eberspermien konnte ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren angereichert werden. Im Gel (SDS-PAGE) zeigten die Untereinheiten der PK-S mit 64.400 eine geringfügig größere relative Molekülmasse als die der PK-M1 aus Kaninchenmuskel (62.000). Die kinetischen Eigenschaften der abgelösten PK-S als auch der noch an Spermienstrukturen gebundenen PK-S und der löslichen PK aus Eberspermien waren sehr ähnlich und entsprachen der M1-Isoform der PK. Antikörper gegen Kaninchenmuskel-PK (Anti-PK-M1) reagierten auch mit der löslichen PK und der PK-S aus Eberspermien. Edman-Abbau der ersten 19 Aminosäuren zeigte, dass die tryptisch abgelöste PK-S am N-Terminus um 5 Aminosäuren gegenüber nativer PK-M1 verlängert ist, während der C-Terminus der erhaltenen PK-S-Sequenz mit einem meist nahe dem N-Terminus gelegenen Sequenzabschnitt der PK-M1 und -M2 übereinstimmt. Die N-terminale Verlängerung der nativen PK-S enthält sicherlich mehr als die nach tryptischer Lyse nachgewiesenen 5 Aminosäuren. Vergleiche der Aminosäure- und übersetzten Nukleotidsequenzen sowie die kinetischen Eigenschaften lassen vermuten, dass die PK-S, wie die PK-M1 und PK-M2, vom PKM-Gen codiert wird. Gegen die gereinigte PK-S wurden Antikörper in Kaninchen produziert. Da das Antiserum nicht ausreichend spezifisch für PK-S war, wurden aus ihm affinitätschromatographisch Antikörper (Anti-PK-S) isoliert, die hohe Affinität zu einem synthetisierten PK-S-Peptid (13 N-terminale Aminosäuren der tryptisch abgelösten PK-S) hatten. Dieses Anti-PK-S-Präparat war spezifisch für PK-S; es reagierte weder mit Kaninchenmuskel-PK noch mit löslicher PK oder anderen Proteinen aus Eberspermien. Anti-PK-S und Anti-PK-M1 wurden zur Lokalisierung von PK-S und löslicher PK in Spermien von Eber, Bulle und Mensch sowie in Schnitten von Eberhoden eingesetzt. Mit Anti-PK-S wurden der Bereich des Akrosoms und das lange flagellare Hauptstück sowie der Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück von Eberspermien fluoreszenzmarkiert, wogegen das kurze, die Mitochondrien enthaltende Mittelstück des Flagellums und der postakrosomale Kopfbereich nur mit Anti-PK-M1 markiert wurden. Immunogoldmarkierung in elektronenmikroskopischen Bildern bestätigte die Lokalisierung von PK-S im Akrosombereich. Im Hauptstück banden Anti-PK-M1 und Anti-PK-S an die fibröse Scheide. Glyzerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) konnte von mir ebenfalls im Akrosombereich, im Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück und an der fibrösen Scheide detektiert werden. Auch an Bullen- und Humanspermien konnte über Immunogoldmarkierung PK und vermutlich GAPDH an der fibrösen Scheide gezeigt werden. Im Akrosombereich dieser Spermien waren die Nachweise von PK und GAPDH jedoch nicht sicher. In Eberhodenschnitten war die PK-S erstmals, oder zumindest vermehrt, in den elongierenden Spermatiden über Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, während andere, vermutlich somatische PK vermehrt in den früheren Stadien (Spermatogonien, aber auch in den Spermatozyten und runden Spermatiden) auftrat. Für die GAPDH zeigte sich ein ähnlicher Entwicklungsverlauf. Die Ergebnisse zeigen, dass in Eberspermien zwei Isoformen der PK auftreten: eine N-terminal verlängerte, strukturgebundene Form, die PK-S, und eine lösliche Form, die beide der PK-M1 ähneln. Der ungewöhnliche N-Terminus der PK-S dient vermutlich der spezifischen räumlichen Anordnung der PK-S im Akrosombereich und an der fibrösen Scheide, nicht aber der Modulation kinetischer Eigenschaften. Meine Untersuchungen stützen die Hypothese, dass in bestimmten Kompartimenten von Säugerspermien die Glykolyse durch Verankerung einiger ihrer Enzyme strukturell hochgeordnet ist. Dadurch wird vermutlich die Versorgung der Mitochondrien-freien Regionen mit ATP sichergestellt. Man kann diese Organisation als Anpassung des Stoffwechsels von Spermien deuten, bei denen die Mitochondrien in einem kleinen Bereich (Mittelstück) hinter dem Spermienkopf kompartimentiert sind. Im Hauptstück des Flagellums könnte die Glykolyse ATP für die Spermienmotilität liefern, im Akrosombereich für die Verhinderung einer vorzeitigen Akrosomreaktion. Somit käme der strukturierten Glykolyse eine essentielle Bedeutung für die Befruchtungsfähigkeit von Säugerspermien zu.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Expression profiling und rationale Expressionsoptimierung am Beispiel eines prokaryontischen Wirt-,Vektor-Systems

Durch globale Expressionsprofil-Analysen auf Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Ebene können biotechnologische Produktionsprozesse besser verstanden und die Erkenntnisse für die zielgerichtete, rationale Optimierung von Expressionssystemen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überexpression einer Glukose-Dehydrogenase (EC 1.1.5.2), die von der Roche Diagnostics GmbH für die diagnostische Anwendung optimiert worden war, in Escherichia coli untersucht. Die Enzymvariante unterscheidet sich in sieben ihrer 455 Aminosäuren vom Wildtyp-Enzym und wird im sonst isogenen Wirt-/Vektor-System in signifikant geringeren Mengen (Faktor 5) gebildet. Das prokaryontische Expressionssystem wurde auf Proteom-Ebene charakterisiert. Die 2-dimensionale differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) wurde zuvor unter statistischen Aspekten untersucht. Unter Berücksichtigung von technischen und biologischen Variationen, falsch-positiven (α-) und falsch-negativen (β-) Fehlern sowie einem daraus abgeleiteten Versuchsdesign konnten Expressionsunterschiede als signifikant quantifiziert werden, wenn sie um den Faktor ≥ 1,4 differierten. Durch eine Hauptkomponenten-Analyse wurde gezeigt, dass die DIGE-Technologie für die Expressionsprofil-Analyse des Modellsystems geeignet ist. Der Expressionsstamm für die Enzymvariante zeichnete sich durch eine höhere Variabilität an Enzymen für den Zuckerabbau und die Nukleinsäure-Synthese aus. Im Expressionssystem für das Wildtyp-Enzym wurde eine unerwartet erhöhte Plasmidkopienzahl nachgewiesen. Als potenzieller Engpass in der Expression der rekombinanten Glukose-Dehydrogenase wurde die Löslichkeitsvermittlung identifiziert. Im Expressionsstamm für das Wildtyp-Enzym wurden viele Proteine für die Biogenese der äußeren Membran verstärkt exprimiert. Als Folge dessen wurde ein sog. envelope stress ausgelöst und die Zellen gingen in die stationäre Wuchsphase über. Die Ergebnisse der Proteomanalyse wurden weiterführend dazu genutzt, die Produktionsleistung für die Enzymvariante zu verbessern. Durch den Austausch des Replikationsursprungs im Expressionsvektor wurde die Plasmidkopienzahl erhöht und die zelluläre Expressionsleistung für die diagnostisch interessantere Enzymvariante um Faktor 7 - 9 gesteigert. Um die Löslichkeitsvermittlung während der Expression zu verbessern, wurde die Plasmidkopienzahl gesenkt und die Coexpression von Chaperonen initiiert. Die Ausbeuten aktiver Glukose-Dehydrogenase wurden durch die Renaturierung inaktiven Produkts aus dem optimierten Expressionssystem insgesamt um einen Faktor von 4,5 erhöht. Somit führte im Rahmen dieser Arbeit eine proteombasierte Expressionsprofil-Analyse zur zielgerichteten, rationalen Expressionsoptimierung eines prokaryontischen Modellsystems.

Hyperverzweigte Lacton-Copolymere: enzymatische Synthese, Charakterisierung und Darstellung strukturierter Polymernetzwerke = (Hyperbranched lactone copolymers by enzyme catalysis: synthesis, characterization and preparation of structured polymer networks)

Hyperverzweigte Polymere erfuhren in den letzten Jahren immer mehr Beachtung, da sie im Vergleich zu ihren linearen Analoga besondere Eigenschaften besitzen. Im Jahre 2002 wurde die erste enzymkatalysierte Darstellung hyperverzweigter Poly(epsilon-caprolacton)e (hb-PCL) beschrieben. Hier ermöglichte das Konzept der konkurrierenden ringöffnenden Polymerisation und Polykondensation die Kontrolle der Eigenschaften des dargestellten Polymers. Detaillierte Untersuchungen in Hinblick auf Grenzen und Möglichkeiten, aber auch die Synthese im Technikumsmaßstab sind wesentliche Aspekte dieser Arbeit. Außerdem wird ein neues Konzept eingeführt, das Reknitting genannt wurde. Ziel desselben ist das Recycling kommerziellen, linearen PCLs mittels Umesterung zu hb-PCL durch Enzymkatalyse. Diese hb-PCLs zeigen vergleichbare Eigenschaften zu den aus den Comonomeren dargestellten. Ausgehend von hb-PCL sollte eine geeignete Route zu methacrylierten Vernetzerverbindungen entwickelt werden. Aus Mischungen derselben mit 2-Hydroxyethylmethacrylat wurden komplexe Netzwerkarchitekturen durch Copolymerisation erhalten. Diese Netzwerke wurden in Hinblick auf ihre mechanisch physikalischen Eigenschaften untersucht. Zuletzt wurden Screeningexperimente an anderen zyklischen Estern durchgeführt, da ein Transfer des oben vorgestellten Konzepts angestrebt wurde. Zwei neue hyperverzweigte Polymerklassen, hb-Poly(delta-valerolacton) und hb-Polytrimethylencarbonat wurden detaillierter untersucht und in Ihren Eigenschaften mit hb-PCL verglichen.

The relevance of the silica metabolizing enzyme silicatein-alpha to biomineralization and the formation of biogenic silica in siliceous sponges

Die technische Silikatproduktion erfordert in der Regel hohe Temperaturen und extreme pH-Werte. In der Natur hingegen haben insbesondere Kieselschwämme die außergewöhnliche Fähigkeit, ihr Silikatskelett, das aus einzelnen sogenannten Spiculae besteht, enzymatisch mittels des Proteins Silicatein zu synthetisieren. rnIm Inneren der Spiculae, im zentralen Kanal, befindet sich das Axialfilament, welches hauptsächlich aus Silicatein-α aufgebaut ist. Mittels Antikörperfärbungen und Elektronenmikroskopischen Analysen konnte festgestellt werden, dass Silicatein in mit Kieselsäure-gefüllten Zellorganellen (silicasomes) nachzuweisen ist. Mittels dieser Vakuolen kann das Enzym und die Kieselsäure aus der Zelle zu den Spiculae im extrazellulären Raum befördert werden, wo diese ihre endgültige Länge und Dicke erreichen. Zum ersten Mal konnte nachgewiesen werden, dass rekombinant hergestelltes Silicatein-α sowohl als Siliciumdioxid-Polymerase als auch Siliciumdioxid-Esterase wirkt. Mittels Massenspektroskopie konnte die enzymatische Polymerisation von Kieselsäure nachverfolgt werden. Durch Spaltung der Esterbindung des künstlichen Substrates Bis(p-aminophenoxy)-dimethylsilan war es möglich kinetische Parameter der Siliciumdioxid-Esterase-Aktivität des rekombinanten Silicateins zu ermitteln.rnZu den größten biogenen Silikatstukuren auf der Erde gehören die Kieselnadeln der Schwammklasse Hexactinellida. Nadelextrakte aus den Schwammklassen Demospongien (S. domuncula) und Hexactinellida (M. chuni) wurden miteinander verglichen um die potentielle Existenz von Silicatein oder Silicatein-ähnliche Molekülen und die dazu gehörige proteolytischen Aktivität nachzuweisen. Biochemische Analysen zeigten, dass das 27 kDA große isolierte Polypeptid in Monoraphis mehrere gemeinsame Merkmale mit den Silicateinen der Demospongien teilt. Dazu gehören die Größe und die Proteinase-Aktivität. rnUm die Frage zu klären, ob das axiale Filament selbst zur Formbildung der Skelettelemente beiträgt, wurde ein neues mildes Extraktionsverfahren eingeführt. Dieses Verfahren ermöglichte die Solubilisierung des nativen Silicateins aus den Spiculae. Die isolierten Silicateine lagen als Monomere (24 kDa) vor, die Dimere durch nicht-kovalente Bindungen ausbildeten. Darüber hinaus konnten durch PAGE-Gelelektrophorese Tetramere (95 kDa) und Hexamere (135 kDa) nachgewiesen werden. Die Monomere zeigten eine beträchtliche proteolytische Aktivität, die sich während der Polymerisationsphase des Proteins weiter erhöhte. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (TEM) konnte die Assemblierung der Proteine zu filamentartigen Strukturen gezeigt werden. Die Selbstorganisation der Silicatein-α-Monomeren scheint eine Basis für Form- und Musterbildung der wachsenden Nadeln zu bilden.rn Um die Rolle des kürzlich entdeckten Proteins Silintaphin-1, ein starker Interaktionspartner des Silicatein-α, während der Biosilifizierung zu klären, wurden Assemblierungs-Experimente mit den rekombinanten Proteinen in vitro durchgeführt. Zusätzlich wurde deren Effekt auf die Biosilikatsynthese untersucht. Elektronenmikroskopische Analysen ergaben, dass rekombinantes Silicatein-α zufällig verteilte Aggregate bildet, während die Koinkubation beider Proteine (molekulares Verhältnis 4:1) über fraktal artige Strukturen zu Filamenten führt. Auch die enzymatische Aktivität der Silicatein-α-vermittelte Biosilikatsynthese erhöhte sich in Gegenwart von Silintaphin-1 um das 5,3-fache. rn

Die Rolle der humanen Enzyme Paraoxonase-2 und -3 bei Krebserkrankungen und Pseudomonas-Infektionen

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Charakterisierung molekularer Funktionen humaner Paraoxonase (PON) Enzyme, insbesondere die der Proteine PON2 und PON3 im Hinblick auf medizinisch-relevante Fragestellungen. Zum einen wurde die Rolle von PON3 in der Tumorgenese und zum anderen eine mögliche Schutzfunktion von PON2 und PON3 gegenüber P. aeruginosa Infektionen untersucht. Bereits seit dem Jahr 2000 ist die anti-oxidative Eigenschaft von PON3 bekannt, jedoch war der zugrundeliegende Mechanismus bisher ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PON3 die Superoxid-Entstehung in den Mitochondrien abschwächt, wobei sie ihre anti-oxidative Eigenschaft vermutlich durch eine direkte Coenzym Q10-Interaktion in der inneren mitochondrialen Membran vermittelt. Dies führt zu weniger oxidativen Stress, zur Abschwächung mitochondrial-induzierter apoptotischer Signalwege und zur erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapeutika. Gleichzeitig wurde demonstriert, dass sich Tumorzellen diese anti-oxidative Eigenschaft zu Nutze machen. PON3 war in zahlreichen Tumorgeweben überexprimiert. Es konnte eine mögliche Funktion von PON3 als Tumormarker und Angriffspunkt in der Krebstherapie aufgezeigt werden. Die hier erlangten Daten liefern wertvolle Hinweise auf die Rolle von PON3 in Krebserkrankungen, welche eine Basis für zukünftige Analysen darstellen, die der Entwicklung neuer Krebstherapien dienen könnten. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit der gegenseitigen Beeinflussung der Enzyme PON2 / PON3 und der für P.aeruginosa essentiellen Virulenzfaktoren Pyocyanin (PCN) und dem Lacton 3OC12. Erstmalig wurde gezeigt, dass PON3 zellschädigende PCN-Effekte abschwächen kann, nämlich die PCN-induzierte Superoxid-Produktion, NF-kB-Aktivierung und IL-8-Sekretion. PON2 schützt in gleicher Weise gegen PCN und hydrolysiert zugleich noch das Lacton 3OC12. Folglich sind PON2 und PON3 wichtige Bestandteile der angeborenen Immunität, werden jedoch durch eine 3OC12-induzierte Ca2+-Mobilisation inaktiviert. Weitere Analysen ergaben, dass die PON2-Inaktivierung wahrscheinlich über einen Ca2+ / Calcineurin / Calmodulin-abhängigen Signalweg erfolgt, welcher eine offenbar regulative Serin311-Dephosphorylierung in PON2 vermittelt. Ähnliches könnte für PON3 gelten und wird derzeit erforscht, da eine Stabilisierung der enzymatischen Aktivitäten von PON2 und PON3 der bakteriellen Virulenz entscheidend entgegen wirken könnte.

Natural compounds Camptothecin and Triptolide: highly specific enzyme inhibitors and tools to dissect transcriptional functions

With this work I elucidated new and unexpected mechanisms of two strong and highly specific transcription inhibitors: Triptolide and Campthotecin. Triptolide (TPL) is a diterpene epoxide derived from the Chinese plant Trypterigium Wilfoordii Hook F. TPL inhibits the ATPase activity of XPB, a subunit of the general transcription factor TFIIH. In this thesis I found that degradation of Rbp1 (the largest subunit of RNA Polymerase II) caused by TPL treatments, is preceded by an hyperphosphorylation event at serine 5 of the carboxy-terminal domain (CTD) of Rbp1. This event is concomitant with a block of RNA Polymerase II at promoters of active genes. The enzyme responsible for Ser5 hyperphosphorylation event is CDK7. Notably, CDK7 downregulation rescued both Ser5 hyperphosphorylation and Rbp1 degradation triggered by TPL. Camptothecin (CPT), derived from the plant Camptotheca acuminata, specifically inhibits topoisomerase 1 (Top1). We first found that CPT induced antisense transcription at divergent CpG islands promoter. Interestingly, by immunofluorescence experiments, CPT was found to induce a burst of R loop structures (DNA/RNA hybrids) at nucleoli and mitochondria. We then decided to investigate the role of Top1 in R loop homeostasis through a short interfering RNA approach (RNAi). Using DNA/RNA immunoprecipitation techniques coupled to NGS I found that Top1 depletion induces an increase of R loops at a genome-wide level. We found that such increase occurs on the entire gene body. At a subset of loci R loops resulted particularly stressed after Top1 depletion: some of these genes showed the formation of new R loops structures, whereas other loci showed a reduction of R loops. Interestingly we found that new peaks usually appear at tandem or divergent genes in the entire gene body, while losses of R loop peaks seems to be a feature specific of 3’ end regions of convergent genes.

Enzyme tRNA interaction and (t)RNA conformation probed via environmentally sensitive cyanine dyes

Nukleosidmodifikationen beeinflussen Dynamik und Konformation von RNArnund sind epigenetisch wirksam. Wenig verstanden sind konformationelle Dynamik und enzymatische Erkennung von tRNA, sowie der Einfluss des mutmaßlichen kovalenten Inhibitors 5-Fluorouridine (5FU) auf Y Synthasen, die Pseudouridin (Y) erzeugen. Frühere Arbeiten nutzten mit den Fluorophoren Cy3 und Cy5rnmarkierte tRNA, um diese Fragen zu adressieren.rnDie vorliegende Arbeit weitet Cy3-Cy5-Markierung auf Hefe tRNArnPhernaus undrnnutzt Thermophorese und fortschrittliche Fluoreszenzspektroskopie. In der Thermophorese zeigte sich eine hohe Toleranz gegenüber Fluoreszenzmarkierung beirngleichzeitiger Erhöhung der Cy5 Fluoreszenz durch Enzymbindung. Zudem konnte die Konformation verschiedener Mutanten human mitochondrialer tRNArnLysrnund die Bindung von SAM durch SAM-I Riboswitch RNA untersucht werden.rnUm etwaige Unterschiede in der Interaktion von Y55 Synthase TruB mit Cy5-gelabelter U55- bzw. 5FU55-tRNA aufzudecken, wurde eine Kombination ausrnThermophorese, zeit- und polarisationsaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie undrn’gel shift’ Experimenten genutzt. Alle Ergebnisse zeigten übereinstimmend einernreversible Bindung ähnlicher Affinität für beide tRNAs und widersprechen somit einer kovalenten Inhibition durch 5FU. Folgerichtig wurde der SDS-stabilernKomplex von TruB mit 5FU-tRNA neu evaluiert, da er bisher als kovalent interpretiert wurde. Es erfolgte eine schnelle Komplexbildung in hoher Ausbeute auchrnfür schlechte Substrate, außerdem ließ sich die Komplexausbeute nicht durch andere Reaktionsbedingungen beeinflussen. Somit kann der SDS stabile Komplexrnnur den ersten, nicht-kovalenten Kontakt von Enzym und 5FU55-tRNA darstellen und repräsentiert kein kovalentes Addukt späterer Katalyse.

Association Between Posttraumatic Stress Disorder Following Myocardial Infarction and Liver Enzyme Levels: A Prospective Study

Research in rodents demonstrated that psychological stress increases circulating levels of alanine transaminase, aspartate transaminase, and alkaline phosphatase reflecting liver injury. Moreover, chronic posttraumatic stress disorder and transaminases predicted coronary heart disease.

Dynamic computer simulations of electrophoresis: a versatile research and teaching tool

Software is available, which simulates all basic electrophoretic systems, including moving boundary electrophoresis, zone electrophoresis, ITP, IEF and EKC, and their combinations under almost exactly the same conditions used in the laboratory. These dynamic models are based upon equations derived from the transport concepts such as electromigration, diffusion, electroosmosis and imposed hydrodynamic buffer flow that are applied to user-specified initial distributions of analytes and electrolytes. They are able to predict the evolution of electrolyte systems together with associated properties such as pH and conductivity profiles and are as such the most versatile tool to explore the fundamentals of electrokinetic separations and analyses. In addition to revealing the detailed mechanisms of fundamental phenomena that occur in electrophoretic separations, dynamic simulations are useful for educational purposes. This review includes a list of current high-resolution simulators, information on how a simulation is performed, simulation examples for zone electrophoresis, ITP, IEF and EKC and a comprehensive discussion of the applications and achievements.

Enantioselective capillary electrophoresis for identification and characterization of human cytochrome P450 enzymes which metabolize ketamine and norketamine in vitro

Ketamine, a phencyclidine derivative, is used for induction of anesthesia, as an anesthetic drug for short term surgical interventions and in subanesthetic doses for postoperative pain relief. Ketamine undergoes extensive hepatic first-pass metabolism. Enantioselective capillary electrophoresis with multiple isomer sulfated -cyclodextrin as chiral selector was used to identify cytochrome P450 enzymes involved in hepatic ketamine and norketamine biotransformation in vitro. The N-demethylation of ketamine to norketamine and subsequently the biotransformation of norketamine to other metabolites were studied via analysis of alkaline extracts of in vitro incubations of racemic ketamine and racemic norketamine with nine recombinantly expressed human cytochrome P450 enzymes and human liver microsomes. Norketamine was formed by CYP3A4, CYP2C19, CYP2B6, CYP2A6, CYP2D6 and CYP2C9, whereas CYP2B6 and CYP2A6 were identified to be the only enzymes which enable the hydroxylation of norketamine. The latter two enzymes produced metabolic patterns similar to those found in incubations with human liver microsomes. The kinetic data of ketamine N-demethylation with CYP3A4 and CYP2B6 were best described with the Michaelis-Menten model and the Hill equation, respectively. This is the first study elucidating the individual enzymes responsible for hydroxylation of norketamine. The obtained data suggest that in vitro biotransformation of ketamine and norketamine is stereoselective.