Caracterização in vitro de um dosímetro de fibra ótica para braquiterapia de HDR

Recentemente foi desenvolvido um dosímetro baseado em fibras cintilantes (BCF-12 da companhia Saint Gobain Crystals com 1 e 0,5 mm de diâmetro e 5 mm de comprimento) para braquiterapia de baixa taxa de dose, em particular a braquiterapia direcionada para o tratamento do cancro da próstata. Este utiliza um novo fotomultiplicador de estado sólido dado pelo nome de MPPC - MultiPixel Photon Counter da companhia Hamamatsu Photonics (Japão). Nesta dissertação é estudado o mesmo dosímetro para a modalidade de braquiterapia de elevada taxa de dose (HDR). A informação sobre a dose neste tipo de dosímetros é obtida a partir de sinais óticos (em vez de sinais elétricos), que são imunes a interferências elétricas e eletromagnéticas. Adicionalmente as pequenas dimensões das fibras oferecem uma excelente resolução espacial e uma invasão mínima para uso em dosimetria in vivo, permitindo medir a dose diretamente ou próximo ao tumor e em tempo real. A sua utilização em braquiterapia para o cancro da próstata constitui-se assim como uma vantagem, uma vez que as fibras podem ser inseridas diretamente nos aplicadores utilizados neste tipo de tratamentos. Apesar de tudo, este tipo de dosímetros possui algumas desvantagens, como por exemplo a luz de Cherenkov e a fluorescência (forma de ruído dada pelo nome de stem effect) que, e a contrário da luz produzida pela fibra cintilante, não são diretamente proporcionais à energia depositada. Contudo, e para energias praticadas em braquiterapia de HDR, nesta dissertação, mostrou-se que este problema é pouco significativo dado que a percentagem de contribuição destes efeitos para o sinal medido é menor que 1% (ou 5% para distâncias menores que 25 mm). Ao longo desta dissertação é feita a caraterização do dosímetro (em modo corrente e impulso) e das suas várias partes em ambiente de laboratório e clínico. Nestes estudos o dosímetro, além de exibir uma boa reprodutibilidade (variação máxima de 3% entre medidas), mostrou uma alta linearidade para uma ampla gama de doses, assim como uma sensibilidade (µGy) semelhante à de uma câmara de ionização, tornando-o adequado para braquiterapia de HDR (tratamento que envolve altos gradientes de dose). Complementarmente, a sua grande versatilidade e simples utilização possibilita a sua aplicação prática em outras modalidades radioterapêuticas.

Contradictory male/masculine/men's "I"s: the unwriting of men, and the concept of sex

May I start with two observations? First, men’s relations to feminism are problematic—there is always a gap, a gap between men and feminism; second, the gendering of men and masculinities is now recognised. There are several challenges here. The gender challenge concerns how to move from the presumed “genderlessness” of men towards the gender-consciousness of being a man/men. Another challenge concerns the “public/private,” the disruption of dominant narratives of “I” of men and the masculine “I.” There is also a temporal challenge, of moving away from simple linearity of the “I.” Together, these challenges can be seen as moving away from taken-for-granted “gender power-coherence” towards gender power-consciousness. To address these kinds of question means interrogating the uneven non-equivalences of what it means to be male, a man, masculine. This is not easily reduced to sex or gender. Rather gender/sex, or simply gex, helps to speak of such blurrings.

Otimização e validação de metodologia analítica empregando SPE e LC-ESI-MS/MS para determinação de multiclasses de agrotóxicos e metabólitos em água de superfície e de abastecimento público

A aplicação de agrotóxicos nas práticas agrícolas aumentou muito nos últimos anos. Isto vem ocorrendo devido ao crescimento populacional, demandando maior produção de alimentos. O uso de agrotóxicos e seus resíduos tornaram-se um problema devido a possível contaminação das águas de superfície e subterrânea, podendo impactar o meio ambiente e causar danos à saúde pública. Na cidade de Rio Grande, RS, Brasil, o suprimento de água potável é realizado pela CORSAN (Companhia Riograndense de Saneamento), que capta a água do Canal São Gonçalo, o qual estabelece uma ligação entre as duas lagoas: Lagoa dos Patos e Lagoa Mirim. Em suas margens há também a captação de água para irrigação das culturas agrícolas. Esta interação entre o uso da água das lagoas e a agricultura, pode resultar na contaminação das águas que são captadas para abastecimento dos municípios situados na região. Uma metodologia analítica empregando Extração em Fase Sólida (SPE) e Cromatografia Líquida acoplada a uma fonte de ionização por Electrospray tandem Espectrometria de Massas (LCESI-MS/MS) foi desenvolvida e validada para a determinação de dezoito agrotóxicos multiclasses (herbicidas, inseticidas e fungicidas) e dois metabólitos em amostras de água superficial e de abastecimento público. Esta metodologia foi aplicada para monitoramento durante dez meses na água superficial do Canal São Gonçalo e na água de consumo da cidade de Rio Grande, após o tratamento pela CORSAN. Os agrotóxicos selecionados foram: clomazona, bispiribaque-sódio, diurom, atrazina, simazina, imazetapir, imazapique, metsulfuron-metílico, quincloraque, penoxsulam, 2,4-D, pirazosulfuron-etílico, bentazona, propanil, irgarol, tebuconazol, fipronil e carbofurano. Os metabólitos foram: 3,4-DCA e 3-hidroxicarbofurano. Os limites de detecção do método variaram entre 0,4 – 40,0 ng L -1 , enquanto para os limites de quantificação a variação foi de 4,0 – 100,0 ng L -1 . Todos os compostos apresentaram excelente linearidade, com coeficiente de determinação maior do que 0,99. As recuperações empregando SPE com cartuchos contendo 500 mg de C18ec, variaram entre 70 a 120%, para 95% dos compostos, apresentando %RSD 20%. Através do monitoramento de múltiplas reações (MRM), duas transições diferentes (íon precursor – íon produto) foram selecionadas para cada composto, uma para quantificação e outra para confirmação, o que aumentou a seletividade do método. Para as amostras analisadas, foram detectados agrotóxicos nível de ng L -1 . O método desenvolvido é sensível, rápido e apresenta elevada seletividade, permitindo a identificação e a quantificação dos agrotóxicos em águas superficiais e de abastecimento público, atendendo os níveis requeridos pelos órgãos reguladores como da União Européia (98/83/EC) e do Brasil segundo a Portaria Nº. 518 (25/03/2004).

In vitro studies of drug transformations: application to forensic toxicology

The forensic toxicologist faces challenges in the detection of drugs and poisons in biological samples due to transformations which occur both during life and after death. For example, changes can result from drug metabolism during life or from the use of formalin solution for post mortem embalming purposes. The former requires the identification of drug metabolites and the latter the identification of chemical reaction products in order to know which substances had been administered. The work described in this thesis was aimed at providing ways of tackling these challenges and was divided into two parts. Part 1 investigated the use of in vitro drug metabolism by human liver microsomes (HLM) to obtain information on drug metabolites and Part 2 investigated the chemical reactions of drugs and a carbamate pesticide with formalin solution and formalin-blood. The initial aim of part I was to develop an in vitro metabolism method using HLM, based on a literature review of previous studies of this type. MDMA was chosen as a model compound to develop the HLM method because its metabolism was known and standards of its metabolites were commercially available. In addition, a sensitive and selective method was developed for the identification and quantitation of hydrophilic phase I drug metabolites using LC/MS/MS with a conventional reverse-phase (C18) column. In order to obtain suitable retention factors for polar drug metabolites on this column, acetyl derivatives were evaluated for converting the metabolites to more lipophilic compounds and an optimal separation system was developed. Acetate derivatives were found to be stable in the HPLC mobile phase and to provide good chromatographic separation of the target analytes. In vitro metabolism of MDMA and, subsequently, of other drugs involved incubation of 4 µg drug substance in pH 7.4 buffer with an NADPH generating system (NGS) at 37oC for 90 min with addition of more NGS after 30 min. The reaction was stopped at 90 min by the addition of acetonitrile before extraction of the metabolites. Acetate derivatives of MDMA metabolites were identified by LC/MS/MS using multiple reaction monitoring (MRM). Three phase I metabolites (both major and minor metabolites) of MDMA were detected in HLM samples. 3,4-dihydroxy-methamphetamine and 4-hydroxy-3-methoxymethamphetamine were found to be major metabolites of MDMA whereas 3,4-methylenedioxyamphetamine was found to be a minor metabolite. Subsequently, ten MDMA positive urines were analysed to compare the metabolite patterns with those produced by HLM. An LC/MS method for MDMA and its metabolites in urine samples was developed and validated. The method demonstrated good linearity, accuracy and precision and insignificant matrix effects, with limits of quantitation of 0.025 µg/ml. Moreover, derivatives of MDMA and its metabolites were quantified in all 10 positive human urine samples. The urine metabolite pattern was found to be similar to that from HLM. The second aim of Part 1 was to use the HLM system to study the metabolism of some new psychoactive substances, whose misuse worldwide has necessitated the development of analytical methods for these drugs in biological specimens. Methylone and butylone were selected as representative cathinones and para-methoxyamphetamine (PMA) was chosen as a representative ring-substituted amphetamine, because of the involvement of these drugs in recent drug-related deaths, because of a relative lack of information on their metabolism, and because reference standards of their metabolites were not commercially available. An LC/MS/MS method for the analysis of methylone, butylone, PMA and their metabolites was developed. Three phase I metabolites of methylone and butylone were detected in HLM samples. Ketone reduction to β-OH metabolites and demethylenation to dihydroxy-metabolites were found to be major phase I metabolic pathways of butylone and methylone whereas N-demethylation to nor-methylone and nor-butylone were found to be minor pathways. Also, demethylation to para-hydroxyamphetamine was found to be a major phase I metabolic pathway of PMA whereas β-hydroxylation to β-OH-PMA was found to be a minor pathway. Formaldehyde is used for embalming, to reduce decomposition and preserve cadavers, especially in tropical countries such as Thailand. Drugs present in the body can be exposed to formaldehyde resulting in decreasing concentrations of the original compounds and production of new substances. The aim of part II of the study was to evaluate the in vitro reactions of formaldehyde with selected drug groups including amphetamines (amphetamine, methamphetamine and MDMA), benzodiazepines (alprazolam and diazepam), opiates (morphine, hydromorphone, codeine and hydrocodone) and with a carbamate insecticide (carbosulfan). The study would identify degradation products to serve as markers for the parent compounds when these were no longer detectable. Drugs standards were spiked in 10% formalin solution and 10% formalin blood. Water and whole blood without formalin were used for controls. Samples were analysed by LC/MS/MS at different times from the start, over periods of up to 30 days. Amphetamine, methamphetamine and MDMA were found to rapidly convert to methamphetamine, DMA and MDDMA respectively, in both formalin solution and formalin blood, confirming the Eschweiler-Clarke reaction between amine-containing compounds and formaldehyde. Alprazolam was found to be unstable whereas diazepam was found to be stable in both formalin solution and water. Both were found to hydrolyse in formalin solution and to give open-ring alprazolam and open-ring diazepam. Other alprazolam conversion products attached to paraformaldehyde were detected in both formalin solution and formalin blood. Morphine and codeine were found to be more stable than hydromorphone and hydrocodone in formalin solution. Conversion products of hydromorphone and hydrocodone attached to paraformaldehyde were tentatively identified in formalin solution. Moreover, hydrocodone and hydromorphone rapidly decreased within 24 h in formalin blood and could not be detected after 7 days. Carbosulfan was found to be unstable in formalin solution and was rapidly hydrolysed within 24 h, whereas in water it was stable up to 48 h. Carbofuran was the major degradation product, plus smaller amounts of other products, 3-ketocarbofuran and 3-hydrocarbofuran. By contrast, carbosulfan slowly hydrolysed in formalin-blood and was still detected after 15 days. It was concluded that HLM provide a useful tool for human drug metabolism studies when ethical considerations preclude their controlled administration to humans. The use of chemical derivatisation for hydrophilic compounds such as polar drug metabolites for analysis by LC/MS/MS with a conventional C18 column is effective and inexpensive, and suitable for routine use in the identification and quantitation of drugs and their metabolites. The detection of parent drugs and their metabolites or conversion and decomposition products is potentially very useful for the interpretation of cases in forensic toxicology, especially when the original compounds cannot be observed.

Understanding the role of auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation in olive (olea europaea L.) cultivars

Olive (Olea europaea L.), one of the main crops in the Mediterranean basin, is mainly propagated by cuttings, a classical propagation method that relies on the ability of the cuttings to form adventitious roots. While some cultivars are easily propagated by this technique, some of the most interesting olive cultivars are considered difficult-to-root which poses a challenge for their preservation and commercialization. Therefore, increasing the current knowledge on adventitious root formation is extremely important for species like olive. This research focuses on evaluating the role of free auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation of two olive cultivars with different rooting ability - ‘Galega vulgar’ (difficult-to-root) and ‘Cobrançosa’ (easy-to-root). In this context, free auxin levels and enzyme activities were determined in in vitro-cultured ‘Galega vulgar’ microshoots and in semi-hardwood cuttings of cvs. ‘Galega vulgar’ and ‘Cobrançosa’. To attain this goal, an analytical method for the quantification of free indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) was developed, which is based on dispersive liquid-liquid microextraction followed by microwave derivatization (DLLME-MAD) and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. The developed method was validated in terms of linearity, recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) and proved to be useful in the analysis of two very different types of plant tissues. The results from auxin quantification in olive samples point at a relationship between free auxin levels and rooting ability of both microshoots and semihardwood cuttings. A defective IBA-IAA conversion, resulting in a peak of free IAA during initiation phase, seems to be associated with low rooting ability. Likewise, differences in the activity of oxidative enzymes also appear to be related with rooting ability. Higher polyphenol oxidases (PPO) activity is likely related with an easyto- root behavior, while the opposite is true for peroxidases (POX) (including IAA oxidase (IAAox)) activity. A possible hypothesis for adventitious root formation in olive microcuttings is presented herein for the first time. Free auxins, oxidative enzymes, alternative oxidase (AOX) and reactive oxygen species (ROS) are some of the factors that may be involved in this highly complex physiological process. Interestingly, while temporal changes in auxin levels were similar between microshoots and semihardwood cuttings, the conclusions obtained from enzyme activity results in microshoots didn’t translate to semi-hardwood tissues, showing the emerging need for adaptation of classical agronomical research studies to modern techniques; Resumo: Procurando compreender o papel das auxinas e enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em cultivares de oliveira (Olea europaea L.) A oliveira (Olea europaea L.) é uma das principais culturas da bacia Mediterrânica e é propagada maioritariamente por estacaria, um processo altamente dependente da capacidade das estacas para formar raízes adventícias. Enquanto algumas cultivares são fáceis de propagar desta forma, algumas das cultivares de oliveira mais interessantes são consideradas difíceis de enraizar, o que dificulta a sua preservação e comercialização e torna extremamente importante aprofundar o conhecimento sobre o enraizamento adventício desta espécie. Este trabalho foca-se na avaliação do papel das auxinas livres e das enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em duas cultivares de oliveira com diferente capacidade de enraizamento - ‘Galega vulgar’ (difícil de enraizar) e ‘Cobrançosa’ (fácil de enraizar). Neste contexto, determinaram-se os níveis de auxinas livres e as actividades de enzimas oxidativas em microestacas de ‘Galega vulgar’ cultivadas in vitro bem como em estacas semi-lenhosas das cvs. ‘Galega vulgar’ e ‘Cobrançosa’. Para tal foi necessário desenvolver uma metodologia analítica para a quantificação de ácido indol-3-acético (IAA) e ácido indol-3-butírico (IBA), baseada em microextracção dispersiva líquido-líquido (DLLME) seguida de derivatização em microondas (MAD) e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS). O método desenvolvido foi validado em termos de linearidade, recuperação, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ), e mostrou-se eficaz na análise de dois tipos de tecidos vegetais bastante diferentes. Os resultados da análise de auxinas em amostras de oliveira apontam para uma possível relação entre os níveis de auxinas livres e a capacidade de enraizamento, tanto em microestacas como em estacas semi-lenhosas. Uma conversão IBA-IAA deficiente, que resulta num pico de IAA durante a fase de iniciação, parece estar associada à baixa capacidade de enraizamento. Por outro lado, a capacidade de enraizamento também parece estar relacionada com diferenças na actividade de enzimas oxidativas. Comportamentos fáceis de enraizar estão associados a actividade mais elevada das polifenoloxidases (PPO), enquanto o oposto é verdade para a actividade das peroxidases (POX) (incluindo a IAA oxidase (IAAox)). Neste trabalho propõe-se pela primeira vez uma possível explicação para o enraizamento adventício em microestacas de oliveira. Auxinas livres, enzimas oxidativas, oxidase alternativa (AOX) e espécies reactivas de oxigénio (ROS) são alguns dos factores envolvidos neste processo fisiológico altamente complexo. Curiosamente, enquanto as alterações temporais nos níveis de auxinas foram semelhantes entre microestacas e estacas semi-lenhosas, o mesmo não se observou relativamente à actividade enzimática, o que mostra a necessidade de adaptação dos estudos agronómicos tradicionais às técnicas correntes.

Madeira wine vinification process: analysis and control

The present study was done in collaboration with J. Faria e Filhos company, a Madeira wine producer, and its main goal was to fully characterize three wines produced during 2014 harvest and identify possible improving points in the winemaking process. The winemaking process was followed during 4 weeks, being registered the amounts of grapes received, the fermentation temperatures, the time at which fermentation was stopped and evolution of must densities until the fortification time. The characterization of musts and wines was done in terms of density, total and volatile acidity, alcohol content, pH, total of polyphenol, organic acids composition, sugars concentration and the volatile profile. Also, it was developed and validated an analytical methodology to quantify the volatile fatty acids, namely using SPME-GC-MS. Briefly, the following key features were obtained for the latter methodology: linearity (R2=0.999) e high sensitivity (LOD =0.026-0.068 mg/L), suitable precision (repeatability and reproducibility lower than 8,5%) and good recoveries (103,11-119,46%). The results reveal that fermentation temperatures should be controlled in a more strictly manner, in order to ensure a better balance in proportion of some volatile compounds, namely the esters and higher alcohols and to minimize the concentration of some volatiles, namely hexanoic, octanoic and decanoic acids, that when above their odours threshold are not positive for the wine aroma. Also, regarding the moment to stop the fermentation, it was verified that it can be introduced changes which can also be benefit to guarantee the tipicity of Madeira wine bouquet.

Desenvolvimento de método para determinação de ferro e cobre em vinho por espectrofotometria empregando DLLME

Este trabalho propõe o desenvolvimento de métodos de preparo de amostra empregando a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) para a extração e pré- concentração de Fe e Cu em vinho, seguido da determinação espectrofotométrica na região do ultravioleta-visível (UV-Vis). Nas extrações por DLLME, a complexação de Fe e Cu foi feita com pirrolidina ditiocarbamato de amônio (APDC) e dietilditiocarbamato de sódio (DDTC), respectivamente. Para a DLLME, foi usada uma mistura apropriada de pequenos volumes de dois solventes, um extrator e outro dispersor, a qual foi rapidamente injetada na amostra aquosa, ocorrendo à formação de uma dispersão e a extração praticamente instantânea dos analitos. Na otimização da DLLME para extração de Fe foram avaliados alguns parâmetros como, tipo de solvente extrator (C2Cl4, 80 µL) e dispersor (acetonitrila, 1300 µL) e seus volumes, pH (3,0), concentração do APDC (1%, m/v), adição de NaCl (0,02 mol L -1 ) e tempo de extração. Para extração de Cu foi aplicado um planejamento fatorial completo 25 para avaliar a influência de cinco variáveis independentes: volume dos solventes dispersor (acetonitrila, 1600 µL) e extrator (CCl4, 60 µL), concentração de DDTC (2%, m/v), pH (3,0) e concentração de NaCl. Após a otimização das condições para Fe, a curva de calibração com adição de analito foi linear entre 0,2 e 2,5 mg L-1 para vinho branco (R2 = 0,9985) e para vinho tinto (R2 = 0,9988). Para Cu, a curva de calibração com adição de analito foi linear entre 0,05 e 1,0 mg L-1 para vinho branco (R2 = 0,9995) e para vinho tinto (R2 = 0,9986). Os limites de quantificação foram de 0,75 e 0,37 mg L-1 para Fe e Cu, respectivamente. A exatidão foi avaliada utilizando ensaio de recuperação, as quais variaram entre 96% e 112%, com desvio padrão relativo inferior a 8%. Os métodos foram aplicados para 5 amostras de vinho branco e 5 amostras de vinho tinto, obtendo-se concentrações entre 1,3 e 5,3 e entre 2,5 e 4,4 mg L-1 para Fe e entre 0,4 e 1,5 e entre 0,9 e 2,5 mg L-1 para Cu, respectivamente. Os métodos desenvolvidos para a extração e pré-concentração de Fe e Cu em vinhos por DLLME e quantificação por UV-Vis mostraram-se adequados, em termos de linearidade, exatidão e precisão.

Otimização e validação de métodos empregando DLLME, SPE, HPLC-DAD e LC-ESI-MS/MS para determinação de agrotóxicos em água subterrânea

A preocupação com a poluição das águas por agrotóxicos tem aumentado, visto que aumentou o número de detecções de agrotóxicos em águas. A falta de avaliação da qualidade da água consumida pela população de áreas rurais onde não existe o abastecimento público de água potável, deve ser considerada, pois essas águas se encontram próximo a áreas de cultivo, onde há intensa aplicação de agrotóxicos. Nessas regiões, o abastecimento de água para as residências e para a irrigação é feito geralmente através das águas de poços. Neste trabalho, um método para determinação dos agrotóxicos carbofurano, clomazona, 2,4-D e tebuconazol em água subterrânea foi desenvolvido e validado. O método utilizou a Extração em Fase Sólida (SPE) e determinação por Cromatografia Líquida de Alta eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC-DAD) e confirmação por Cromatografia Líquida tandem Espectrometria de Massas (LC-MS/MS). Para a SPE utilizou-se cartuchos C18 de 200 mg, e eluição com 1 mL de metanol. Após a otimização dos parâmetros de extração e separação dos compostos, o método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação). Todas as curvas analíticas apresentaram valores de r maiores que 0,99. Os LOQs para o método, considerando a etapa de pré-concentração de 250 vezes, foram de 0,2 µg L -1 para todos os agrotóxicos por HPLC-DAD e, por LC-MS/MS, 4,0 ng L -1 para clomazona, carbofurano e tebuconazol e de 40,0 ng L -1 para 2,4-D. As recuperações foram entre 60,3 e 107,7% para a repetitividade e entre 67,5 e 115,3% para a precisão intermediária, com RSD de 0,8 a 20,7% para todos os compostos por HPLC-DAD. Para o LC-MS/MS a precisão em termos de repetitividade, variou entre 0,97 e 20,7%, e as recuperações entre 67,0 e 108,9%. O método foi aplicado na determinação de agrotóxicos em amostras de águas subterrâneas durante um ano. Nas amostras foram detectados agrotóxicos em níveis de µg L -1 . Dentro do contexto atual da Química Analítica, de desenvolver métodos mais rápidos, que utilizem menor quantidade de solvente, de amostra e com altos fatores de enriquecimento, foi otimizado um método de extração para os agrotóxicos carbofurano, clomazona e tebuconazol utilizando a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME) e determinação por LC-MS/MS. Foram otimizados alguns parâmetros que influenciam no processo de extração, como: tipo e volume dos solventes dispersores e extratores, tempo de extração, força iônica e velocidade de centrifugação. Nas condições otimizadas, as recuperações para os níveis de concentração entre 0,02 e 2,0 g L -1 variaram entre 62,7 e 120,0%, com valores de RSD entre 1,9 e 9,1%. O LOQ do método foi de 0,02 µg L -1 para todos os compostos. Quando comparado com a SPE se demonstrou rápido, simples, de baixo custo, além de necessitar de menores volumes de amostra para determinação de agrotóxicos em águas. O método mostrou-se adequado à análise dos agrotóxicos em água subterrânea e todos os parâmetros de validação obtidos estão dentro dos limites sugeridos para validação de métodos cromatográficos

Desenvolvimento e validação de método para determinação do perfil graxo do biodiesel de Tungue e Blendas com soja empregando GC-MS

No Brasil o biodiesel é utilizado em misturas com óleo diesel em proporções de 5%, sem que haja modificações nos motores. Com o intuito de diversificar a utilização de oleaginosas não comestíveis no ramo dos biocombustíveis, e ainda vincular a produção com agricultura sustentável, uma alternativa para o RS é a utilização do óleo de tungue para a produção de biodiesel. A caracterização e quantificação de ácidos graxos do biodiesel de tungue, torna-se importante devido à seu exclusivo perfil graxo. Neste trabalho, foi estudado o desenvolvimento e validação de método para a determinação do perfil graxo do biodiesel metílico de tungue e blendas com soja utilizando GC-MS. Os parâmetros de validação considerados foram: curva analítica, linearidade, seletividade, limite de detecção e quantificação, robustez, precisão e exatidão. Para determinar as melhores condições cromatográficas, foram testadas diferentes programações de temperatura no forno cromatográfico; fluxo de gás; temperatura do injetor, detector e interface; e modo de injeção. As condições do GCMS após a otimização foram: injeção de 1 µL com injeção em alta pressão (300 kPa), T do injetor: 250 ºC, injeção split 1:30, fluxo de 1 mL min-1, coluna Rtx-5MS com dimensões 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, T forno: isoterma de 2 min a 130 ºC, aumento de 20 ºC/min até 220 ºC, aumento de 0,5ºC/min até 223ºC, aumento de 7 ºC/min até 250 ºC e isoterma em 250 ºC por 3 min, resultando em 20 min de análise. A temperatura da fonte e interface foram de 200 ºC e 250 ºC, respectivamente, com o MS no modo full scan, ionização por impacto eletrônico a 70 eV, e intervalo de massas de 30 a 500 u.m.a. A identificação do α-eleosteárico foi baseada na fragmentação característica do composto, pela comparação com o espectro do ácido linolênico, e ainda pelo tempo de retenção do composto. Na validação, as curvas analíticas apresentaram valores de r maiores que 0,99. O LD e LQ foram adequados, permitindo a quantificação de ésteres na concentração mínima de 0,6%. Os valores de exatidão ficaram entre 86 e 117%, com RSD% menores que 8%. O efeito matriz também foi avaliado, sendo que esse efeito foi considerado médio para a maioria dos compostos, ficando entre ± 20 e 50%. Durante a aplicação do método, o mesmo se mostrou adequado para amostras de biodiesel metílico de tungue e blendas com soja, nas proporções de 15:85, 20:80 e 25:75 (T:S, v/v). A aplicabilidade do método também foi testada para o biodiesel de soja, obtendo resultados satisfatórios, mostrando-se assim, além de tudo, ser um método robusto.

Analyse simultanée des hormones stéroïdiennes et leurs formes chimiques dans les matrices d'eau et d'urine par SPE-LC-MS/MS en ligne

Dans les dernières années, les perturbateurs endocriniens ont été observés dans les rivières qui reçoivent des entrées importantes d’eaux usées. Parmi les perturbateurs endocriniens, les hormones stéroïdiennes naturelles et synthétiques sont des composés dont le potentiel d'imiter ou d'interférer avec les fonctions hormonales normales (développement, croissance et reproduction), est reconnu même au niveau ultra-traces (ng L-1). Bien que les hormones conjuguées soient moins actives que les hormones libres, elles peuvent être clivées et redevenir libres une fois exposées aux processus microbiens avant ou pendant le traitement des eaux usées. En raison de la nécessité d'identifier et de quantifier ces composés dans l'eau, une nouvelle méthode, entièrement automatisée, a été développée pour la détermination simultanée des deux formes de plusieurs hormones stéroïdiennes (conjuguées et libres) dans les matrices d'eau et dans l’urine des femmes. La méthode est basée sur l'extraction en phase solide couplée en ligne à la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS). Plusieurs paramètres ont été évalués dans le but d'optimiser l'efficacité de la méthode, tels que le type et le débit de la phase mobile, des différentes colonnes de SPE et de chromatographie, ainsi que différentes sources et modes d'ionisation des échantillons pour la MS. La méthode démontre une bonne linéarité (R2 > 0.993), ainsi qu'une précision avec un coefficient de variance inférieure à 10%. Les limites de quantification varient d’un minimum de 3 à 15 ng L-1 pour un volume d'injection entre 1 mL et 5 mL et le recouvrement des composés varie de 72 % à 117 %.

Casca de arroz como adsorvente para extração de micotoxinas em cebola

A produção mundial de arroz chega a 80 milhões de toneladas ao ano, considerando que as cascas representam 20% deste valor, anualmente são geradas cerca de 1.162.000 toneladas desse rejeito. Há alguns anos, esse material era descartado no ambiente, atualmente as leis de proteção ambiental, demandaram na preocupação com resíduos de casca de arroz (FOLETO, 2005). Segundo Mayer (2006) a casca leva aproximadamente 5 anos para se decompor e exala um volume elevado de metano, um dos gases responsáveis pelo efeito estufa. Visando proteger a integridade do meio ambiente, estão sendo buscadas alternativas para reduzir os impactos ambientais do descarte e recuperar os investimentos na cultura do grão. Devido seu alto teor de silício a casca de arroz, é matéria-prima de grande interesse para aplicação em vários ramos: indústria eletrônica, cerâmica e na agricultura e também pode ser utilizada como fonte energética e ser aplicadas como adsorvente, em análises químicas (FOLETO, 2005; ROSA, 2009). Neste trabalho o objetivo foi padronizar método para a determinação das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e ocratoxiana A em cebola, empregando a técnica de extração, Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD), tendo a casca de arroz como adsorvente, de forma a possibilitar a determinação dos contaminantes empregando cromatografia de camada delgada de alta eficiência (HPTLC) e/ou cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de fluorescência (HPLC-FD). A cebola (Allium cepa L.) foi a matriz escolhida devido sua importância econômica, ela é a terceira hortaliça mais importante economicamente no Brasil, depois do tomate e da batata. O país está entre os dez maiores produtores do mundo, sendo que na safra de 2010 a produção foi de 1.548.146 toneladas. Dentre os estados que se destacam pela sua produção estão: Santa Catarina, São Paulo e Rio Grande do Sul. No entanto, a cebola assim como os demais alimentos é suscetível à contaminação fúngica e se entre a microbiota estiverem espécies toxigênicas pode ocorrer à produção de micotoxinas. O método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação) para cada tipo de determinação cromatográfica. Para HPTLC, os limites de detecção variaram entre 0,33-5µg Kg-1 e os de quantificação entre 1-15µg Kg-1 Para o método HPLC-FD os limites de detecção variaram entre 0,003– 0,26 µg Kg-1 e os de quantificação 0,03 – 2,6 µg Kg-1 . As recuperações para o método HPTLC variaram entre 76- 95% e para HPLC-FD variaram entre 72-88%. O método desenvolvido foi aplicado para verificar a ocorrência de micotoxinas em 14 amostras de cebola. A contaminação com aflatoxinas foi verificada em 43% das amostras analisadas. O nível máximo encontrado foi de 90 µg Kg-1 para aflatoxina B2 em uma amostra de cebola crioula, com o defeito de mancha negra.

Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de sedativos e B-bloqueadores em rim por LC-MS/MS

O desenvolvimento de métodos adequados que permitam o monitoramento de resíduos e contaminantes em alimentos é de suma importância pois é a única forma de garantir a segurança dos alimentos evitando danos à saúde do consumidor. Para isso, fazse necessário que estes métodos sejam rápidos, fáceis e de baixo custo, capazes de detectar a presença de resíduos em concentrações baixas e em diferentes matrizes. Este trabalho consistiu no desenvolvimento de método para determinação de 5 sedativos e 14 β-bloqueadores em amostras de rim suíno e posterior análise por Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas em Série (LC-MS/MS). O procedimento de extração que melhor se adequou para análise destes compostos consistiu na pesagem de 2 g de amostra e adição de 10 mL de acetonitrila seguida de homogeneização com auxílio de Ultra-Turrax e mesa agitadora. Após extração, as amostras foram submetidas a duas técnicas de clean-up, sendo elas, congelamento do extrato à baixa temperatura e extração em fase sólida dispersiva (d-SPE) utilizando como sorvente Celite® 545. Uma etapa de concentração foi realizada com auxílio de concentrador de amostras sob fluxo de N2 e temperatura controlada. As amostras secas foram retomadas com metanol e analisadas utilizando sistema LC-MS/MS com Ionização por Eletrospray (ESI), operando no modo MRM positivo, coluna Poroshell 120 EC-C18 (3,0 x 50 mm, 2,7 μm) para separação dos analitos, e gradiente de fase móvel composta por (A) solução aquosa acidificada com 0,1% de ácido fórmico (v/v) e (B) metanol 0,1% ácido fórmico (v/v). Os parâmetros de validação avaliados foram linearidade, seletividade, efeito matriz, precisão, veracidade, recuperação, limite de decisão, capacidade de detecção, incerteza da medição, robustez, limite de detecção e de quantificação. Além disso foram observados os critérios de desempenho aplicáveis à detecção por espectrometria de massas e estabilidade dos compostos. A recuperação foi avaliada em 10 μg kg-1 e a veracidade em 5, 10 e 15 μg kg-1 apresentando resultados satisfatórios entre 70 - 85% e 90 - 101%, respectivamente. O limite de quantificação determinado foi de 2,5 μg kg-1 , exceto para carazolol que foi de 1,25 μg kg- 1 . O estudo de linearidade foi realizado entre 0 e 20 μg kg-1 apresentando coeficientes de determinação superiores a 0,98. Estes procedimentos foram realizados através de análise de matriz branca fortificada. Além disso, o presente método foi utilizado para analisar carazolol, azaperone e azaperol em amostras de ensaio colaborativo de rim suíno, apresentando resultados muito próximos aos reais. Portanto, é possível concluir que o método desenvolvido é adequado para análise de sedativos e β-bloqueadores através de extração dos compostos e limpeza do extrato eficientes utilizando procedimentos rápidos, fáceis e de baixo custo, garantindo resultados seguros e confiáveis.

Avaliação da técnica de dispersão da matriz em fase sólida assistida por vórtex para análise de fármacos em peixes

Os fármacos classificados como contaminantes orgânicos emergentes tornaramse tópico de discussão ambiental pois estes são capazes de atingir diferentes matrizes do meio ambiente, como água, solo e organismos aquáticos, e estudos demonstrando a toxicidade tem despertado o interesse científico. Neste estudo um método analítico foi otimizado e validado para determinação de quinze fármacos em amostras de peixes empregando preparo de amostras por dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) assistida por vórtex e determinação por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS). O estudo ainda focou na aplicação de diferentes suportes sólidos na etapa de dispersão da MSPD, sendo que três (quitina, quitosana e concha de mexilhão dourado) foram utilizados pela primeira vez para esta finalidade, O método otimizado foi validado seguindo os parâmetros do INMETRO, ANVISA, SANCO e FDA. A curva analítica e linearidade foram avaliados através da calibração externa e superposição na matriz. Os compostos demonstraram linearidade dentro da faixa recomendada, com coeficiente de correlação maior do que 0,99. Os limites de detecção do método variaram de 1 a 100 ng g -1 , e os limites de quantificação a variaram de 5 a 1000 ng g -1 . Os valores de recuperação variaram de 68% a 108%, com RSD menores que 13% para todos os compostos. O efeito de matriz foi avaliado e quatro dos quinze compostos apresentaram efeito maior que ±20%. Na aplicabilidade o método demonstrou ser eficiente para extração de fármacos de diferentes espécies de peixe, apresentando exatidão e precisão adequados. Não foram encontrados resíduos de fármacos nas amostras analisadas.

Otimização e validação de métodos empregando DLLME e DLLME-SFO para a extração simultânea de agrotóxicos multiclasse em água mineral

O Rio Grande Sul destaca-se no cenário nacional como grande produtor de diversas culturas, as quais demandam grande quantidade de agrotóxicos das mais diversas classes químicas e toxicidades. No entanto a intensa utilização destes compostos torna-se uma preocupação devido a possíveis contaminações das águas superficiais e subterrâneas. Em virtude da degradação dos mananciais a água mineral passou a ser uma das fontes mais utilizadas para o consumo humano, pois tem-se a percepção de que a mesma possui melhor qualidade que a água tratada, além disso acredita-se que a mesma esta isenta de substâncias orgânicas prejudiciais à saúde humana. Neste trabalho, foi realizada a determinação dos agrotóxicos atrazina, simazina, imazapique, imazetapir, imidacloprido, ciproconazol, tebuconazol e epoxiconazol em água mineral empregando a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME), Microextração Líquido-Líquido Dispersiva com Solidificação da Gota Orgânica Flutuante (DLLME-SFO) e Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas em série com fonte de ionização por Eletronebulização (LC-ESI-MS/MS). Para o método empregando DLLME e LC-ESI-MS/MS foram otimizados alguns fatores como o tipo e volume de solvente extrator e dispersor e pH. Após a otimização dos parâmetros de extração, fragmentação dos compostos e separação cromatográfica, o método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação). Todas as curvas analíticas apresentaram valores de r maiores que 0,999. Os Limites de Quantificação (LOQs) para o método estiveram na faixa de 5 a 500 ng L-1. Foram obtidas recuperações entre 102 - 120% para a repetibilidade e entre 92 e 110% para a precisão intermediária, com RSD de 2 a 10% para todos os compostos. Para o método empregando DLLME-SFO e LC-ESI-MS/MS foram avaliados alguns parâmetros que afetam a eficiência da extração como, tipo e volume de solvente extrator e dispersor, força iônica e pH. Nas condições ótimas de extração todas as curvas analíticas apresentaram valores de r maiores que 0,997. Os LOQs para o método variaram entre 12,5 - 125 ng L-1. As recuperações foram entre 70 e 118% para a repetitividade e entre 76 e 95% para a precisão intermediária, com RSD de 2 a 18% para todos os compostos. Com relação ao Efeito Matriz (EM) avaliado para todos os compostos pelos dois métodos, foi observado baixo EM. Isso indicou que não é necessário utilizar a curva analítica preparada no extrato branco da matriz para a quantificação destes analitos. Ambos os métodos foram aplicados para a determinação de resíduos de agrotóxicos em amostras de água mineral provenientes de diferentes regiões do estado do Rio Grande do Sul e não foram encontrados resíduos de agrotóxicos nas amostras analisadas. Os métodos validados apresentaram como principais vantagens baixo consumo de solventes orgânicos e amostra, rapidez, altos fatores de concentração e recuperações dentro da faixa aceitável. Os limites de quantificação dos métodos ficaram abaixo dos limites máximos de resíduos permitidos pela legislação brasileira para agrotóxicos em água mineral.

Determinação simultânea de Glicerol livre e total, MONO-, DI e triglicerídeos em biodiesel etílico de girassol, mamona e da mistura de sebo e soja empregando GC-FID

O biodiesel produzido para ser comercializado no Brasil deve estar de acordo aos padrões de qualidade estabelecidos pela resolução de 4 de fevereiro de 2010 da Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e do Biocombustível (ANP, 04/2010). Neste trabalho, foi estudada a aplicação dos métodos ASTM D 6584 e EN 14105 para o biodiesel de mamona e biodiesel oriundo de rota etílica. Ambos os métodos empregam GC (Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography) com FID (Detecção por Ionização em Chama, do inglês Flame Ionization Detection) e reação de sililação com N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoracetamida (MSTFA). Os compostos foram identificados para quantificação pelos tempos de retenção, para os diglicerídeos e triglicerídeos foram utilizadas bandas de tempo de retenção. Os parâmetros de validação considerados foram: curva analítica, linearidade, sensibilidade, robustez, precisão e exatidão. Os métodos ASTM D 6584 e EN 14105 apresentaram sensibilidade semelhante para todos os compostos. Foram escolhidas as condições cromatográficas estabelecidas pelo método ASTM D 6584 por ser mais rápido que o EN14105 e ter sensibilidade semelhante. O método apresentou boa linearidade com todas as curvas analíticas com r maiores que 0,999. A reação de sililação com MSTFA foi otimizada para o biodiesel etílico de mamona em virtude da sua composição química. Um volume de 500 μL de MSTFA foi escolhido para realização dos ensaios de exatidão e precisão. Os valores de exatidão ficaram entre 67 e 145,9% com valores de precisão menores que 11%. Foi avaliada a ocorrência de efeito matriz para biodiesel etílico de mamona, sendo que esse efeito foi considerado baixo para glicerol, monooleína e dioleína e médio para trioleína. Mesmo havendo efeito de matriz o preparo das curvas analíticas em solvente conforme sugerido pelos métodos de referência foi mantido. O método foi robusto frente às variações da composição química da matriz. Na aplicação do método, esse se mostrou adequado para amostras de biodiesel etílico de mamona, de girassol e da mistura de sebo e soja.