Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Neuronal differentiation and epithelial integrity: the role of Drosophila Short stop

The nervous system is the most complex organ in animals and the ordered interconnection of neurons is an essential prerequisite for normal behaviour. Neuronal connectivity requires controlled neuronal growth and differentiation. Neuronal growth essentially depends on the actin and microtubule cytoskeleton, and it has become increasingly clear, that crosslinking of these cytoskeletal fractions is a crucial regulatory process. The Drosophila Spectraplakin family member Short stop (Shot) is such a crosslinker and is crucial for several aspects of neuronal growth. Shot comprises various domains: An actin binding domain, a plakin-like domain, a rod domain, calcium responsive EF-hand motifs, a microtubule binding Gas2 domain, a GSR motif and a C-terminal EB1aff domain. Amongst other phenotypes, shot mutant animals exhibit severely reduced dendrites and neuromuscular junctions, the subcellular compartmentalisation of the transmembrane protein Fasciclin2 is affected, but it is also crucially required in other tissues, for example for the integrity of tendon cells, specialised epidermal cells which anchor muscles to the body wall. Despite these striking phenotypes, Shot function is little understood, and especially we do not understand how it can carry out functions as diverse as those described above. To bridge this gap, I capitalised on the genetic possibilities of the model system Drosophila melanogaster and carried out a structure-function analysis in different neurodevelopmental contexts and in tendon cells. To this end, I used targeted gene expression of existing and newly generated Shot deletion constructs in Drosophila embryos and larvae, analyses of different shot mutant alleles, and transfection of Shot constructs into S2 cells or cultured fibroblasts. My analyses reveal that a part of the Shot C-terminus is not essential in the nervous system but in tendon cells where it stabilises microtubules. The precise molecular mechanism underlying this activity is not yet elucidated but, based on the findings presented here, I have developed three alternative testable hypothesis. Thus, either binding of the microtubule plus-end tracking molecule EB1 through an EB1aff domain, microtubulebundling through a GSR rich motif or a combination of both may explain a context-specific requirement of the Shot C-terminus for tendon cell integrity. Furthermore, I find that the calcium binding EF-hand motif in Shot is exclusively required for a subset of neuronal functions of Shot but not in the epidermal tendon cells. These findings pave the way for complementary studies studying the impact of [Ca2+] on Shot function. Besides these differential requirements of Shot domains I find, that most Shot domains are required in the nervous system and tendon cells alike. Thus the microtubule Gas2 domain shows no context specific requirements and is equally essential in all analysed cellular contexts. Furthermore, I could demonstrate a partial requirement of the large spectrin-repeat rod domain of Shot in neuronal and epidermal contexts. I demonstrate that this domain is partially required in processes involving growth and/or tissue stability but dispensable for cellular processes where no mechanical stress resistance is required. In addition, I demonstrate that the CH1 domain a part of the N-terminal actin binding domain of Shot is only partially required for all analysed contexts. Thus, I conclude that Shot domains are functioning different in various cellular environments. In addition my study lays the base for future projects, such as the elucidation of Shot function in growth cones. Given the high degree of conservation between Shot and its mammalian orthologues MACF1/ACF7 and BPAG1, I believe that the findings presented in this study will contribute to the general understanding of spectraplakins across species borders.

Regulation der BDNF-Expression in Endothelzellen

Das Neurotrophin BDNF ist ein protektiver Faktor, der das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben neuronaler Zellen fördert. Neben der neuronalen Expression wird BDNF auch peripher exprimiert, so auch in Endothelzellen. Dort stimuliert BDNF die Angiogenese und fördert das Endothelzellüberleben. Eine Regulation der BDNF-Expression unter pathologischen Bedingungen wie Epilepsie, M. Alzheimer, M. Parkinson, Depression und Ischämie ist bereits mehrfach beschrieben worden. Literaturdaten zeigen veränderte BDNF-Expressionen unter pathologischen Bedingungen zeitgleich mit einem erhöhten Spiegel des Tumornekrosefaktors (TNF-a) bzw. einer Aktivierung der Proteinkinase C (PKC). Ob ein erhöhter TNF-a-Spiegel bzw. die Aktivierung der PKC Ursache der veränderten BDNF-Expression ist, ist bisher noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl TNF-a als auch eine Aktivierung der PKC in peripheren Endothelzellen die BDNF-Expression konzentrations- und zeitabhängig reduziert. Im Fall von TNF-a wird diese Reduktion über den TNF-a-Rezeptor 1 (TNFR1) vermittelt und auf dem Niveau der Transkription reguliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass BDNF die Angiogenese-Aktivität von humanen Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC) in Abhängigkeit der BDNF-Rezeptoren TrkB und p75NTR stimuliert. TNF-a hingegen reduziert die Angiogenese in HUVEC. Bei der Regulation der BDNF-Expression durch den PKC-aktivierenden Phorbolester Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) konnte eine Beteiligung der PKC-Isoformen d gezeigt werden. Die Verminderung der BDNF-Expression durch PKC-Aktivierung konnte durch Inhibitoren der PKC d aufgehoben werden. PMA hatte keine destabilisierende Wirkung auf die BDNF-mRNA. Auch hier wird BDNF durch PMA auf dem Niveau der Transkription reguliert. Weiterhin ist bisher eine pharmakologische Regulation der BDNF-Expression noch nicht näher untersucht worden. Erstmalig konnte eine Wirkung des b1-Adrenorezeptorblockers Nebivolol auf die BDNF-mRNA-Expression beobachtet werden. Nebivolol erhöht die BDNF-Expression in zerebralen Endothelzellen in vitro und im Mäuseherzen in vivo. Hierbei handelt es sich um eine substanzspezifische Wirkung von Nebivolol, die NO-unabhängig verläuft und nicht über den b3-Adrenozeptor vermittelt wird. Teile der klinisch beobachteten protektiven Wirkungen von Nebivolol könnten auf eine erhöhte BDNF-Expression zurückgeführt werden.

Der Einfluss der regulierten Expression der onkogenen Kinase PKB,Akt auf die T-Zell-vermittelte Tumorabstoßung

Eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Transformation von Zellen ist die Inaktivierung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Die dabei erworbenen Defekte der Apoptose-Signalwege führen häufig zu Resistenzen gegenüber Radio- und Chemotherapien. Immuntherapeutische Ansätze haben zum Ziel, solche resistenten Tumorzellen spezifisch zu entfernen. Resistenzen gegenüber Immuntherapien können wiederum in einer gestörten Immunerkennung der Tumorzellen oder deren Resistenz gegenüber Immuneffektormechanismen begründet sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu überprüfen, ob durch Proteinkinase B (PKB)/Akt Immunresistenz vermittelt werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung des PKB/Akt-Signalweges in Tumorzellen einen deutlichen Schutz gegenüber verschiedenen Apoptosestimuli in vitro vermittelt. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt hemmte sowohl die pharmakologisch, als auch die durch ZTL induzierte Apoptose-Signalkaskade über eine posttranskriptionelle Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins MCL-1. Diese Beobachtung konnte auch in einem murinen Tumorimmuntherapiemodell in vivo bestätigt werden. Unstimulierte Splenozyten von C57Bl/6-Mäusen wurden adoptiv in NOD/SCID-Mäuse mit etablierten, PKB/Akt-exprimierenden, murinen Fibrosarkomen transferiert. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt inhibierte den tumorsuppressiven Effekt dieser transplantierten Splenozyten signifikant. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die PKB/Akt-abhängige Immunresistenz auch in vivo durch anti-apoptotisches MCL-1 vermittelt wird. PKB/Akt-exprimierende Fibrosarkome mit supprimierter endogener MCL-1-Expression verloren ihre Resistenz gegenüber der durch adoptiven Splenozytentransfer vermittelten Tumorsuppression. Dies bestätigte endogenes MCL-1 als entscheidenden Faktor der PKB/Akt-vermittelten Immunresistenz. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der PKB/Akt-induzierten Signaltransduktion auf der Ebene der nachgeschalteten Kinase mTOR etablierte Fibrosarkome gegenüber adoptiver Lymphozytentherapie sensitiviert. Der mTOR-Inhibitor Rapamycin verhinderte die PKB/Akt-induzierte Aufregulation von MCL-1 und die damit einhergehende Resistenzentwicklung in vivo. Zusammengefasst wurde erstmalig gezeigt, dass eine Deregulation des PKB/Akt-Signalweges Resistenz gegenüber immunologischer Tumorsuppression vermitteln kann. PKB/Akt stellt somit ein entscheidendes Zielmolekül für die Verbesserung von Krebsimmuntherapien dar.

Effect of hypoxia and hyperglycemia on cell bioenergetics

Mitochondria have a central role in energy supply in cells, ROS production and apoptosis and have been implicated in several human disease and mitochondrial dysfunctions in hypoxia have been related with disorders like Type II Diabetes, Alzheimer Disease, inflammation, cancer and ischemia/reperfusion in heart. When oxygen availability becomes limiting in cells, mitochondrial functions are modulated to allow biologic adaptation. Cells exposed to a reduced oxygen concentration readily respond by adaptive mechanisms to maintain the physiological ATP/ADP ratio, essential for their functions and survival. In the beginning, the AMP-activated protein kinase (AMPK) pathway is activated, but the responsiveness to prolonged hypoxia requires the stimulation of hypoxia-inducible factors (HIFs). In this work we report a study of the mitochondrial bioenergetics of primary cells exposed to a prolonged hypoxic period . To shine light on this issue we examined the bioenergetics of fibroblast mitochondria cultured in hypoxic atmospheres (1% O2) for 72 hours. Here we report on the mitochondrial organization in cells and on their contribution to the cellular energy state. Our results indicate that prolonged hypoxia cause a significant reduction of mitochondrial mass and of the quantity of the oxidative phosphorylation complexes. Hypoxia is also responsible to damage mitochondrial complexes as shown after normalization versus citrate synthase activity. HIF-1α plays a pivotal role in wound healing, and its expression in the multistage process of normal wound healing has been well characterized, it is necessary for cell motility, expression of angiogenic growth factor and recruitment of endothelial progenitor cells. We studied hypoxia in the pathological status of diabetes and complications of diabetes and we evaluated the combined effect of hyperglycemia and hypoxia on human dermal fibroblasts (HDFs) and human dermal micro-vascular endothelial cells (HDMECs) that were grown in high glucose, low glucose concentrations and mannitol as control for the osmotic challenge.

Charakterisierung funktioneller Domänen von Centrin-Isoformen

Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Grünalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In Säugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolkörpern und Basalkörper, aber auch in Übergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellulären Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabhängig während der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist für die beschriebenen lichtabhängigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere mögliche Zielsequenzen für die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat für die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2Cund PP2C ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine rückgängig machen kann. Hoch auflösende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige räumliche Nähe zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abhängig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung dürfte an der Regulation der lichtabhängigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinitäten der Centrine für Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinitäten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Auflösen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabhängige Phosphorylierung der Centrine möglicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und Innensegment der Photorezeptorzellen.

Studio del ruolo della Protein chinasi B/Akt nella migrazione di Cellule Staminali Mesenchimali umane

Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.

Computational Modeling of Cardiac Excitation-Contraction Coupling in Physiological and Pathological Conditions

The cardiomyocyte is a complex biological system where many mechanisms interact non-linearly to regulate the coupling between electrical excitation and mechanical contraction. For this reason, the development of mathematical models is fundamental in the field of cardiac electrophysiology, where the use of computational tools has become complementary to the classical experimentation. My doctoral research has been focusing on the development of such models for investigating the regulation of ventricular excitation-contraction coupling at the single cell level. In particular, the following researches are presented in this thesis: 1) Study of the unexpected deleterious effect of a Na channel blocker on a long QT syndrome type 3 patient. Experimental results were used to tune a Na current model that recapitulates the effect of the mutation and the treatment, in order to investigate how these influence the human action potential. Our research suggested that the analysis of the clinical phenotype is not sufficient for recommending drugs to patients carrying mutations with undefined electrophysiological properties. 2) Development of a model of L-type Ca channel inactivation in rabbit myocytes to faithfully reproduce the relative roles of voltage- and Ca-dependent inactivation. The model was applied to the analysis of Ca current inactivation kinetics during normal and abnormal repolarization, and predicts arrhythmogenic activity when inhibiting Ca-dependent inactivation, which is the predominant mechanism in physiological conditions. 3) Analysis of the arrhythmogenic consequences of the crosstalk between β-adrenergic and Ca-calmodulin dependent protein kinase signaling pathways. The descriptions of the two regulatory mechanisms, both enhanced in heart failure, were integrated into a novel murine action potential model to investigate how they concur to the development of cardiac arrhythmias. These studies show how mathematical modeling is suitable to provide new insights into the mechanisms underlying cardiac excitation-contraction coupling and arrhythmogenesis.

Lokalisierung der Fortsatz-induzierenden Domäne von Transmembran-Agrin

Aggregation oder Überexpression der Transmembran-Isoform des extrazellulären Matrix-Proteoglycans Agrin in Neuronen führt zur Bildung zahlreicher filopodienartiger Fortsätze auf Axonen und Dendriten. Ähnliche Fortsätze können auch durch Überexpression von Transmembran-Agrin in verschiedenen nicht-neuronalen Zelllinien induziert werden. Untersuchungen zu dieser Fortsatz-induzierenden Aktivität in Neuronen und nicht-neuronalen Zellen zeigen, dass der extrazelluläre Teil von Transmembran-Agrin für die Fortsatzbildung notwendig ist. In dieser Arbeit wurde mittels verschiedener Deletions- und Mutationskonstrukte der Bereich zwischen den Cysteinen C535 und C567 der siebten Follistatin-ähnlichen Domäne von Transmembran-Agrin als essentiell für die Bildung der filopodienartigen Fortsätze identifiziert. Die siebte Follistatin-ähnliche Domäne konnte durch die erste oder sechste, jedoch nicht durch die achte Follistatin-ähnliche Domäne funktionell ersetzt werden, was für eine funktionelle Redundanz bei einigen Follistatin-ähnlichen Domänen Agrins spricht. Zudem scheint eine kritische Distanz der siebten Follistatin-ähnlichen Domäne zur Plasmamembran für die Fortsatzbildung wichtig zu sein. Diese Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Regionen innerhalb Agrins für die Bildung der Synapse an der neuromuskulären Endplatte und der Fortsätze im Zentralnervensystem verantwortlich sind, und deuten auf eine Funktion der Follistatin-ähnlichen Domänen Agrins bei der Entwicklung des Zentralnervensystems hin.

Identificazione dei meccanismi molecolari responsabili del ruolo oncosoppressivo della molecola CD99 nell'osteosarcoma

CD99, glicoproteina di membrana codificata dal gene MIC2, è coinvolta in numerosi processi cellulari, inclusi adesione, migrazione, apoptosi, differenziamento e regolazione del trafficking intracellulare di proteine, in condizioni fisiologiche e patologiche. Nell’osteosarcoma risulta scarsamente espressa ed ha ruolo oncosoppressivo. L’isoforma completa (CD99wt) e l’isoforma tronca (CD99sh), deleta di una porzione del dominio intracellulare, influenzano in modo opposto la malignità tumorale. In questo studio, comparando cellule di osteosarcoma caratterizzate da differenti capacità metastatiche e diversa espressione di CD99, abbiamo valutato la modulazione dei contatti cellula-cellula, la riorganizzazione del citoscheletro di actina e la modulazione delle vie di segnalazione a valle del CD99, al fine di identificare i meccanismi molecolari regolati da questa molecola e responsabili del comportamento migratorio e invasivo delle cellule di osteosarcoma. L'espressione forzata di CD99wt induce il reclutamento di N-caderina e β-catenina a livello delle giunzioni aderenti ed inibisce l'espressione di molecole cruciali nel processo di rimodellamento del citoscheletro di actina, come ACTR2, ARPC1A, Rho-associated, coiled–coil-containing protein kinase 2 (ROCK2), nonché di ezrina, membro della famiglia ezrin/radixin/moesin e chiaramente associata con la progressione tumorale e la metastatizzazione dell’OS. Gli studi funzionali identificano ROCK2 come mediatore fondamentale nella regolazione della migrazione e della diffusione metastatica dell’osteosarcoma. Mantenendo cSRC in una conformazione inattiva, CD99wt inibisce la segnalazione mediata da ROCK2 inducendo una diminuzione dell’ezrina a livello della membrana accompagnata dalla traslocazione in membrana di N-caderina e β-catenina, principali ponti molecolari per il citoscheletro di actina. La ri-espressione di CD99wt, generalmente presente negli osteoblasti, ma perso nelle cellule di osteosarcoma, attraverso l'inibizione dell'attività di cSrc e ROCK2, aumenta la forza di contatto e riattiva i segnali anti-migratori ostacolando l’azione pro-migratoria, altrimenti dominante, dell’ezrina nell’osteosarcoma. Abbiamo infine valutato la funzione di ROCK2 nel sarcoma di Ewing: nonostante il ruolo oncogenico esercitato da CD99, ROCK2 guida la migrazione cellulare anche in questa neoplasia.

The physiological role of APP in the activation of neuroprotective signaling mechanisms

Accumulating evidence indicates that loss of physiological amyloid precursor protein (APP) function leads to enhanced susceptibility of neurons to cellular stress during brain aging. This study investigated the neuroprotective function of the soluble APP ectodomain sAPPα. Recombinant sAPPα protected primary hippocampal neurons and neuroblastoma cells from cell death induced by trophic factor deprivation. This protective effect was abrogated in APP-depleted neurons, but not in APLP1-, APLP2- or IGF1-R-deficient cells, indicating that expression of holo-APP is required for sAPPα-dependent neuroprotection. Strikingly, recombinant sAPPα, APP-E1 domain and the copper-binding growth factor-like domain (GFLD) of APP were able to stimulate PI3K/Akt survival signaling in different wildtype cell models, but failed in APP-deficient cells. An ADAM10 inhibitor blocking endogenous sAPPα secretion exacerbated neuron death in organotypic hippocampal slices subjected to metabolic stress, which could be rescued by exogenous sAPPα. Interestingly, sAPPα-dependent neuroprotection was unaffected in neurons of APP-ΔCT15 mice which lack the intracellular C-terminal YENPTY motif of APP. In contrast, sAPPα-dependent Akt signaling was completely abolished in APP mutant cells lacking the C-terminal G-protein interaction motif and by specifically blocking Gi/o-dependent signaling with pertussis toxin. Collectively, the present thesis provides new mechanistic insights into the physiological role of APP: the data suggest that cell surface APP mediates sAPPα-induced neuroprotection via Go-protein-coupled activation of the Akt pathway.

Signalling mechanisms affecting regulated neurotrophin secretion in hippocampal neurons

Die Neurotrophine aus Säugetiere BDNF und NT-3 sind von Neuronen sekretierte Wachstumsfaktoren. Ferner sind Neurotrophine in verschiedene Formen der aktivitätsabhängigen synaptische Plastizität involviert. Obwohl die Ausschüttung von Neurotrophine aus Synapsen beschrieben worden ist, sind die intrazellulären Signalkaskaden, die die synaptische Ausschüttung von Neurotrophine regulieren, bei weitem nicht verstanden. Deswegen ist die Analyse der Sekretion von Neurotrophine auf subzellulärer Ebene erforderlich, um die genaue Rolle von präsynaptische und postsynaptische NT-Sekretion in der synaptischen Plastizität aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturen von dissoziierten hippocampalen Neuronen aus Ratten mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Konstrukten von BDNF und NT-3 transfiziert und Neurotrophine-enthaltenden Vesikeln durch die Colokalisierung mit dem cotransfizierten postsynaptischen Marker PSD-95-DsRed an glutamatergen Synapsen identifiziert. Depolarisationsinduzierte Sekretion von BDNF und NT-3 wurde per Direktaufnahme am Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die unvermittelte postsynaptische Depolarisation mit erhöhtem Kalium, in Gegenwart von Inhibitoren der synaptischen Transmission, erlaubte die Untersuchung der Signalwege, die am postsynaptischen Sekretionsprozess der Neurotrophinvesikel beteiligt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die depolarisationsinduzierte postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine durch Calcium-Einstrom ausgelöst wird, entweder über L-Typ-spannungsabhängige Calcium-Kanäle oder über NMDA-Rezeptoren. Eine anschließende Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über Ryanodin-Rezeptoren ist für den Sekretionsprozess erforderlich. Die postsynaptische Neurotrophinausschüttung wird durch KN-62 und KN-93 gehemmt, was auf eine unmittelbare Abhängigkeit von aktiver alpha-Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) hinweist. Der Inhibitor der cAMP/Proteinkinase A (PKA), Rp-cAMP-S, sowie der NO-Donor, SNP, minderten die Neurotrophinausschüttung. Hingegen blieben die Erhöhung des intrazellulären cAMP und der NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA ohne Wirkung. Mit dem Trk-Inhibitor K252a konnte gezeigt werden, dass autokrine Neurotrophin-induzierte Neurotrophinausschüttung nicht an der synaptischen Freisetzung der Neurotrophine beiträgt und, dass BDNF seine eigene postsynaptische Sekretion nicht auslöst. Freisetzungsexperimente mit dem Fluoreszenz-Quencher Bromphenolblau konnten den Nachweis erbringen, dass asynchrone und anhaltende Fusionsporenöffnung von Neurotrophinvesikeln während der Sekretion stattfindet. Wegen der im Vergleich zum komplexen Sekretionsprozess schnellen Fusionsporenöffnung, scheint die Freisetzungsgeschwindigkeit von Neurotrophine durch ihre Diffusion aus dem Vesikel begrenzt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine starke Abhängigkeit der aktivitätsabhängigen postsynaptischen Neurotrophinausschüttung vom Calcium-Einstrom, von der Freisetzung von Calcium aus internen Speichern, von der Aktivierung der CaMKII und einem intakten Funktion der PKA, während der Trk-Signalweg, die Aktivierung von Natrium-Kanäle und NO-Signale nicht erforderlich sind.

Regulation von "Silent mating type information regulation 2 homolog Type" 1 (SIRT1) durch die nach DNA-Schaden induzierte Kinase "Homeodomain-interaction kinase" (HIPK2)

"Silent mating type information regulation 2 Type" 1 (SIRT1), das humane Homolog der NAD+-abhängigen Histondeacetylase Sir2 aus Hefe, besitzt Schlüsselfunktionen in der Regulation des Metabolismus, der Zellalterung und Apoptose. Letztere wird vor allem durch die Deacetylierung von p53 an Lys382 und der dadurch verringerten Transkription proapoptotischer Zielgene vermittelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SIRT1 Regulation im Zusammenhang mit der DNA-Schadensantwort untersucht.rnIn der Apoptoseregulation übernimmt die Serin/Threonin-Kinase "Homeodomain interacting protein kinase" 2 (HIPK2) eine zentrale Rolle und daher wurde die SIRT1 Modifikation und Regulation durch HIPK2 betrachtet. Durch Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins p53 an Ser46 aktiviert HIPK2 das Zielprotein und induziert die Transkription proapoptotischer Zielgene von p53. Es wurde beschrieben, dass HIPK2 nach DNA-Schädigung über einen bisher unbekannten Mechnismus die Acetylierung von p53 potenzieren kann.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass SIRT1 von HIPK2 in vitro und in Zellen an Serin 27 und 682 phosphoryliert wird. Weiterhin ist die Interaktion von SIRT1 mit HIPK2 sowie die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 durch DNA-schädigende Adriamycinbehandlung erhöht. Es gibt Hinweise, dass HIPK2 die Expression von SIRT1 reguliert, da HIPK2 RNA-Interferenz zur Erniedrigung der SIRT1 Protein- und mRNA-Mengen führt.rnEin weiterer interessanter Aspekt liegt in der Beobachtung, dass Ko-Expression von PML-IV, welches SIRT1 sowie HIPK2 in PML-Kernkörper rekrutiert, die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 verstärkt. Phosphorylierung von SIRT1 an Serin 682 interferiert wiederum mit der SUMO-1 Modifikation, welche für die Lokalisation in PML-Kernkörpen wichtig ist.rnBemerkenswerterweise reduziert die DNA-schadendsinduzierte SIRT1 Phosphorylierung die Bindung des SIRT1 Ko-Aktivators AROS, beeinflusst aber nicht diejenige des Inhibitors DBC1. Dies führt zur Reduktion der enzymatischen Aktivität von SIRT1 und der darausfolgenden weniger effizienten Deacetylierung des Zielproteins p53.rnDurch die von mir in der vorliegenden Promotionsarbeit erzielten Ergebnisse konnte ein neuer molekularer Mechanismus entschlüsselt werden, welcher die durch HIPK2 modulierte Acetylierung von p53 und die daran anschließende Induktion der Apoptose beschreibt.rnHIPK2-vermittelte SIRT1 Phosphorylierung resultiert in einer verminderten Deacetylasefunktion von SIRT1 und führt so zu einer verstärkten acetylierungsinduzierten Expression proapoptotischer p53 Zielgene.

Rapid fusion and syncytium formation of heterologous cells upon expression of the FGFRL1 receptor

The fusion of mammalian cells into syncytia is a developmental process that is tightly restricted to a limited subset of cells. Besides gamete and placental trophoblast fusion, only macrophages and myogenic stem cells fuse into multinucleated syncytia. In contrast to viral cell fusion, which is mediated by fusogenic glycoproteins that actively merge membranes, mammalian cell fusion is poorly understood at the molecular level. A variety of mammalian transmembrane proteins, among them many of the immunoglobulin superfamily, have been implicated in cell-cell fusion, but none has been shown to actively fuse cells in vitro. Here we report that the FGFRL1 receptor, which is up-regulated during the differentiation of myoblasts into myotubes, fuses cultured cells into large, multinucleated syncytia. We used luciferase and GFP-based reporter assays to confirm cytoplasmic mixing and to identify the fusion inducing domain of FGFRL1. These assays revealed that Ig-like domain III and the transmembrane domain are both necessary and sufficient to rapidly fuse CHO cells into multinucleated syncytia comprising several hundred nuclei. Moreover, FGFRL1 also fused HEK293 and HeLa cells with untransfected CHO cells. Our data show that FGFRL1 is the first mammalian protein that is capable of inducing syncytium formation of heterologous cells in vitro.

Protein overexpression following lentiviral infection of primary mature neutrophils is due to pseudotransduction

Neutrophils are terminally differentiated cells with a short life-span due to constitutive apoptosis. Because of these characteristics, genetic manipulation of neutrophils has been difficult, although it is highly desired given the importance of neutrophils in the immune system. Here we demonstrate that transduction of primary human mature neutrophils with enhanced green fluorescent protein (eGFP)-encoding lentiviral particles results in GFP-containing cells as previously reported. Yet, our data further show that GFP expression in neutrophils upon transduction is largely due to protein transfer, a process called lentiviral pseudotransduction, and not due to bona fide transduction. Thus, inhibition of viral genome integration by the reverse transcriptase inhibitor 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) or of protein biosynthesis by cycloheximide (CHX) did not abolish GFP levels in transduced neutrophils. Importantly, lentiviral pseudotransduction of the enzyme death-associated protein kinase 2 (DAPK2) into primary human mature neutrophils resulted in increased protein levels, but not enzymatic functionality. Based on our data and previous reports of unspecific viral effects on immune cells following lentiviral transduction, we discourage scientists to use lentiviral transduction methods to manipulate primary mature neutrophils.