Caracterização patogênica, fisiológica e morfológica de Pseudocercospora musae

As características patogênicas, fisiológicas e morfológicas de oito isolados de Pseudocercospora musae foram estudadas objetivando sua diferenciação. Para determinação da patogenicidade, os isolados foram inoculados em folhas de bananeira (Musa spp.) através de dois métodos: com e sem ferimento. Em ambos os casos, foram utilizados discos de micélio (4 mm de diâmetro), retirados de colônias jovens de cada um dos isolados. Maior eficiência na reprodução dos sintomas foi observada no método por ferimento, onde todos os isolados mostraram-se patogênicos, enquanto no sem ferimento, somente os isolados P-2 e P-4 apresentaram habilidade para penetrar e colonizar o tecido hospedeiro. Para a caracterização fisiológica, foi estudado o comportamento dos isolados em seis meios de cultura (BDA, V-8, leite de côco, Czapek, maltose-peptona e aveia) e três níveis de pH (4,5; 5,5 e 6,5), durante o período de incubação de sete dias, a temperatura de 25 °C e em condições de alternância luminosa. Leite de coco, BDA e aveia induziram maior crescimento micelial, enquanto que BDA, maltose-peptona, V-8 e Czapek, maior produção de conídios. Os isolados de P. musae cresceram melhor em pH 4,5 e a esporulação foi favorecida em pH 6,5, destacando-se o isolado P-1 em relação aos demais. As características culturais dos isolados mostraram pequena variação quanto a topografia, coloração e pigmentação da colônia, de acordo com o substrato e pH empregados. A caracterização morfológica revelou variação não significativa no tamanho e na relação comprimento/largura dos isolados de P. musae.

Progresso da brusone nas folhas e características agronômicas nas gerações avançadas de somaclones aromáticos da cultivar de arroz IAC 47

Foram conduzidos experimentos de campo por três anos utilizando somaclones da cultivar de arroz (Oriza sativa) de terras altas IAC 47. A variação para resistência à brusone e para outras características agronômicas foram avaliadas nas gerações avançadas de R5, R6 e R7. O progresso lento da brusone foi medido baseado na área sob a curva de progresso de doença (ASCPD) e taxa aparente de infecção (r). As correlações nas gerações R6 e R7 em relação a ASCPD e r foram positivas e altamente significantes. Os somaclones também mostraram dois tipos distintos de plantas, um com folha ereta verde escura e outro com folha decumbente verde-amarela, arquiteturas diferentes do tipo de planta da cultivar IAC 47, a qual é caracterizada por folha decumbente verde-palha. Todos os somaclones exibiram característica aromática do grão. Os somaclones mostraram também variação para tipo de grão, altura, duração do ciclo, peso de grãos de 100 panículas e produtividade. Foram identificados dois somaclones SCIA02 e SCIA06 que mostraram progresso lento de doença, precocidade e alto potencial de produtividade, comparados à cultivar parental IAC 47, além de possuir característica aromática e tipo de planta com folha ereta verde-escura. Estes somaclones podem ser utilizados como novas fontes de resistência à brusone no melhoramento de arroz de sequeiro.

Incidência e índice de doença do mosaico do trigo em cereais de inverno e em gramíneas de verão, associados ao Polymyxa graminis

O Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV) é transmitido pelo fungo de solo Polymyxa graminis. Em ensaios conduzidos a campo, por dois anos, avaliaram-se a incidência, severidade e presença do vetor do vírus no sistema radicular das gramíneas: aveia (Avena sativa e A. strigosa), azevém (Lilium multiforum), cevada (Hordeum vulgare), milhã (Digitaria sp.), milheto (Pannisetum americanum), milho (Zea mays), papuã (Brachiaria sp.), sorgo (Sorghum bicolor), trigo (Triticum aestivum) e triticale (Triticum secale). A incidência da virose foi calculada com base no percentual de plantas sintomáticas, sendo atribuído notas de 0-5 para determinar o ID (%) . Os segmentos radiculares foram coletados, corados com solução de lactofenol-azul de algodão e visualizados em microscópio luminoso, atribuindo-se níveis de infestação pela quantidade de grupos de esporos de resistência de P. graminis. Em espécies de aveia, não foram observados sintomas e esporos de resistência do vetor. Na cultura da cevada, não foram observados sintomas, mas sim esporos de resistência no sistema radicular. Para o triticale e o trigo, na primeira época de plantio, a incidência e ID (%) foram mais elevados quando comparados à segunda época. Observou-se uma relação direta entre o ID (%) e a quantidade de esporos de resistência. Nas gramíneas de verão, não foram observados sintomas de SBWMV nem esporos de resistência no sistema radicular.

Efeito do vírus do mosaico do trigo sobre o rendimento de trigo e triticale

O vírus do mosaico do trigo (Soil-borne wheat mosaic virus - SBWMV), transmitido pelo fungo de solo Polymyxa graminis, é responsável por uma das principais viroses que afetam a produção de trigo (Triticum aestivum). Com o objetivo de avaliar os danos causados pelo SBWMV, foram conduzidos experimentos no campo experimental da Embrapa Trigo, em solo naturalmente infestado com o fungo vetor, utilizando as cultivares de trigo, BR 32, BR 23, Embrapa 120, OR 1, IAC 5-Maringá, Embrapa 27, Embrapa 16 e as cultivares de triticale (Triticum secale) Embrapa 53 e Iapar 23, em duas épocas de plantio. Foram avaliados a altura de plantas, o número de perfilhos, número de grãos por espiga, número de grãos por planta, peso de grãos e o peso de mil grãos. Os dados foram submetidos à análise de variância comparando-se as médias pelo teste de Scott & Knott a 5%. Para a altura de plantas, houve redução de até 27,5% na cv. IAC 5-Maringá. A cv. BR 32 apresentou redução de 25% no número de perfilhos em plantas sintomáticas, ao passo que a cv. OR 1 aumentou 32,4% o número de perfilhos. O número de grãos por planta apresentou redução em torno de 49% nas duas espécies estudadas. A redução no peso de grãos por planta variou de sete a 56% em trigo e de 51 a 59% em triticale , para o peso de mil grãos a redução variou de quatro a 26% em trigo e 23 a 30% em triticale.

Disseminação de molicutes do milho a longas distâncias por Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae)

O objetivo do trabalho foi testar a hipótese de que a cigarrinha Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae) serve como reservatório natural dos molicutes (Spiroplasma kunkelii e fitoplasma) que infetam o milho (Zea mays) no Mato Grosso do Sul, após períodos prolongados de pousio. Nas safras 1997/98 e 1998/99, avaliou-se a infetividade natural de migrantes desse inseto vetor em plantios de primavera (novembro/dezembro) da região de Anastácio (MS), onde não se cultiva o milho na entressafra (abril a setembro), em duas situações distintas: (A) áreas onde o milho era plantado anualmente a partir de outubro, e (B) áreas onde o milho não era cultivado há vários anos. Cigarrinhas foram coletadas no campo e confinadas em plântulas sadias de milho, em casa de vegetação, para a inoculação dos patógenos. Após 50-60 dias, as plantas-teste foram avaliadas quanto a sintomas diagnósticos de S. kunkelii e por PCR para detecção de fitoplasma. Através dos bionsaios de transmissão, detectou-se S. kunkelii e fitoplasma em 2 a 20% e 1 a 4% dos indivíduos coletados, respectivamente. O aparecimento de adultos infetivos logo após a germinação da cultura, inclusive nas áreas onde o milho não era cultivado há vários anos, sugere que os molicutes foram transportados na entressafra por indivíduos migratórios de D. maidis.

Ocorrência de doenças causadas por molicutes e por vírus em milho nas Províncias de Tucumán e de Córdoba na Argentina

A incidência de doenças causadas por molicutes e por vírus foi avaliada em lavouras de milho (Zea mays) nas Províncias de Tucumán e de Córdoba, na Argentina, em fevereiro de 2000. Na Província de Tucumán verificou-se que 44% das lavouras apresentaram altos níveis de incidência de plantas com sintomas de enfezamentos causados por molicutes (50 a 100%), em altitudes variando de 300 a 2.000 m. A presença de fitoplasma e de espiroplasma foi confirmada em amostras de folhas de plantas com sintomas de enfezamentos, através dos testes de PCR e de "Western blotting". Constatou-se, porém, que a eficiência desses testes para detecção destes patógenos, quando os sintomas apresentados pelas plantas eram muito acentuados, foi da ordem de 70%, e de apenas 30% quando os sintomas eram menos acentuados. Na localidade Jesus Maria, foram encontradas plantas apresentando acentuado nanismo, folhas estreitas e com deformações. Dentre quatro amostras destas plantas, submetidas a testes de PCR, em duas foi detectada a presença de fitoplasma, possivelmente d istinto do "Maize Bushy Stunt Phytoplasma". A cigarrinha Dalbulus maidis, inseto vetor dos molicutes, foi encontrada apenas em Tucumán, estando ausente em Córdoba. O Mal de Rio Cuarto virus foi detectado em seis lavouras em Córdoba, e em três em Tucumán. A cigarrinha Delphacodes kuscheli foi detectada em todas as lavouras em Córdoba, e em apenas três lavouras em Tucumán. O Maize dwarf mosaic virus foi detectado em cerca de 60% das lavouras amostradas nas duas Províncias e o Maize rayado fino virus em apenas uma localidade em Tucumán.

Biologia molecular do processo de infecção por Agrobacterium spp.

Agrobacterium tumefaciens é o agente causal da galha-da-coroa, doença que afeta a maioria das plantas dicotiledôneas e caracteriza-se pelo crescimento de tumores na junção entre o caule e a raiz (coroa). A formação desses tumores é o resultado de um processo natural de transferência de genes de Agrobacterium spp. para o genoma da planta infetada. Esses genes estão contidos em um plasmídio de alto peso molecular (120 a 250 kb), denominado Ti ("tumor inducing"), presente em todas as linhagens patogênicas de Agrobacterium spp. Duas regiões do plasmídio Ti estão diretamente envolvidas na indução do tumor: a região-T, que corresponde ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a região de virulência (região vir), que contém genes envolvidos na síntese de proteínas responsáveis pelo processo de transferência da região-T. Esta região, uma vez transferida e integrada no genoma da célula vegetal, passa a ser denominada de T-DNA ("transferred DNA"). Os genes presentes no T-DNA codificam enzimas envolvidas na via de biossíntese de reguladores de crescimento, auxinas e citocininas. A síntese desses reguladores pelas células transformadas causa um desbalanço hormonal, levando à formação do tumor no local da infecção. Outro grupo de genes presentes no T-DNA codifica enzimas responsáveis pela síntese de opinas, que são catabolisadas especificamente pela bactéria colonizadora, como fonte de nutrientes. O conhecimento preliminar das bases moleculares envolvidas no processo de infecção de uma planta hospedeira por Agrobacterium spp., permitiu a utilização desta bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas.

Comportamento sazonal da clorose variegada dos citros em três regiões do Estado de São Paulo

Caracterizou-se a evolução de variáveis relacionadas à clorose variegada dos citros em plantas de três regiões do Estado de São Paulo (Noroeste, Centro e Sul), visando determinar diferenças no padrão sazonal do patógeno, dos vetores, do hospedeiro e da doença. Foram avaliadas mensalmente 20 plantas sintomáticas em talhões de laranja (Citrus sinensis) 'Pêra' enxertada em limão (Citrus limonia) 'Cravo', em três regiões do Estado de São Paulo, no período de dezembro de 1998 a dezembro de 2000, utilizando-se as seguintes variáveis: número de brotações novas (bn); percentagem de ramos sintomáticos (prs); percentagem de ramos assintomáticos infetados (prai); percentagem total de ramos infetados (ptri) e estimativa de concentração bacteriana (ecb). Em cada região foram obtidas as variáveis temperatura mínima, temperatura máxima, precipitação pluviométrica e número de cigarrinhas capturadas em armadilha amarela. Para a determinação de correlação entre variáveis, utilizou-se a análise de Lags Distribuídos e para a comparação de regiões e estações do ano, a análise de Kruskal-Wallis, Friedman e o teste de Nemenyi (p<0,005). As variáveis relacionadas à doença (prs, prai, ptri e ecb) apresentaram padrões sazonais, mas não se observou diferença estatística entre as estações do ano. O pomar da Região Noroeste apresentou maior quantidade de brotações novas e maior quantidade de ramos sintomáticos. O pomar da Região Sul apresentou maior quantidade de ramos com infecção assintomática. Não houve diferença de concentração bacteriana entre os pomares das três regiões.

Estudo da interação de um begomovírus isolado de tomateiro com a mosca branca

No estudo da interação de um begomovírus isolado de tomateiro (Lycopersicon esculentum) em Anápolis-GO, denominado GO-ANPL (taxonomicamente relacionado ao Tomato rugose mosaic virus, ToRMV) com o vetor Bemisia tabaci biótipo B, determinaram-se o período de acesso de aquisição do vírus (PAA), o período de acesso de inoculação (PAI), o período de latência (PL), a sua retenção e transmissão à progênie. Nos experimentos empregaram-se plantas de tomateiro 'Santa Clara' e cinco insetos por planta. Constatou-se um PAA mínimo de 15 min com o qual 6% dos tomateiros foram infetados. Este percentual aumentou para 65% quando o PAA foi estendido para 24 h. O PAI mínimo foi de 30 min registrando-se 18% de infecção, o qual foi elevado para 67% com 24 h de PAI. Observou-se o término do PL 16 h após o vetor adquirir o vírus. Na detecção do GO-ANPL no vetor via PCR, testes com mais de 2.500 espécimens constataram o vírus em ninfas desenvolvidas em tomateiro infetado, em adultos com diferentes PAAs, mas não em ovos de fêmeas avirulíferas ovipositados em planta infetada. Observou-se a passagem transestadial em 100% dos adultos testados que transmitiram o vírus em 33% dos casos. Evidenciou-se a transmissão à progênie pela detecção do vírus em ovos, ninfas e adultos provenientes de fêmeas virulíferas, contudo, a transmissão do vírus pelos adultos não foi observada. Os resultados obtidos indicam que a interação vírus-vetor é estabelecida desde a fase inicial do desenvolvimento do inseto e podem ser considerados relevantes para os estudos epidemiológicos dos begomovírus associados ao biótipo B de B. tabaci no país.

Expressão em Escherichia coli da proteína capsidial do Watermelon mosaic virus e produção de anti-soro

Um anti-soro policlonal específico para Watermelon mosaic virus (WMV) foi produzido por meio da imunização de coelhos com proteína capsidial purificada, expressa in vitro em células de Escherichia coli. O gene cp foi amplificado via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, a partir de RNA viral extraído de preparações virais concentradas. O fragmento amplificado foi clonado em pBLUESCRIPT KS+ e completamente seqüenciado para confirmação de sua identidade e integridade. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-A. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína capsidial em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni+-NTA, a partir de proteínas totais extraídas de E. coli. Uma vez purificada, a proteína foi quantificada e utilizada para imunização dos coelhos. O anti-soro foi testado quanto a sua especificidade e sensibilidade em testes de Western blot, DAS-ELISA, imunodifusão e ELISA indireto. Todos os testes demonstraram que o anti-soro produzido a partir da expressão in vitro da proteína capsidial é altamente específico para a detecção do WMV em extratos foliares, não tendo sido observada nenhuma reação heteróloga interespecífica.

Espécies vegetais hospedeiras de begomovírus isolados de tomateiro em Goiás e no Distrito Federal

A determinação da gama de hospedeiros de begomovírus isolados de tomateiro (Lycopersicon esculentum) é de elevada importância nos estudos conduzidos com esses patógenos, uma vez que contribui para o entendimento da larga disseminação dos vírus em condições de campo e oferece subsídios para o estudo da variabilidade genética de espécies e estirpes identificadas em diversas regiões do país. Visando a determinação e a comparação da gama de hospedeiros de dois isolados de begomovírus de tomateiro obtidos de lavouras da região de Anápolis-GO (GO-ANPL) e do Distrito Federal (DF-BR2) inocularam-se 31 espécies vegetais pertencentes a oito famílias botânicas, sob duas modalidades de inoculação: mecânica e com a mosca branca, Bemisia tabaci biótipo B. Constatou-se que o GO-ANPL e o DF-BR2 infetaram exclusivamente plantas da família Solanaceae como Datura stramonium, Nicandra physalodes e Nicotiana benthamiana. Para o GO-ANPL, o número de espécies vegetais infetadas com o emprego do inseto vetor foi superior ao obtido pela inoculação mecânica, diferindo dos resultados obtidos para o DF-BR2 em que as plantas hospedeiras foram igualmente infetadas em ambos os métodos de inoculação. A comparação entre as hospedeiras dos dois isolados e destes com as de outros begomovírus de tomateiro da região Nordeste revelaram que há variação tanto nas espécies hospedeiras como na sintomatologia exibida pelas plantas infetadas. Os testes foram todos confirmados com hibridização com sondas moleculares, em "dot blot".

Distribuição do elemento transponível impala em isolados de fusarium oxysporum patogênicos e não-patogênicos ao feijoeiro

A variabilidade genética de 20 isolados de Fusarium oxysporum, nove não-patogênicos e 11 patogênicos ao feijoeiro (Phaseouls vulgaris), foi determinada com base na distribuição do elemento transponível impala. A presença de impala das subfamílias D e E foi determinada por experimentos de PCR, empregando oligonucleotídeos específicos para cada subfamília. Foi observada a presença de representantes das duas subfamílias na maioria dos isolados, sugerindo, portanto, que impala é um antigo componente do genoma de F. oxysporum f. sp. phaseoli. A hibridização do DNA total de cada isolado, clivado com a enzima EcoRI, com um fragmento do elemento impala da subfamíla E, mostrou uma variação nos padrões de bandas dos isolados não-patogênicos, indicando a possível atividade desses elementos. No entanto, no caso dos isolados patogênicos, foram observados padrões de bandas mais homogêneas e alguns isolados apresentaram o mesmo perfil de bandas, indicando que se trata de cópias de impala que, possivelmente, não são mais capazes de sofrer transposição. Estas cópias inativas são excelentes marcadores genéticos. Um dos isolados patogênicos, Fus4, não apresentou cópias endógenas de impala, o que torna esse isolado um candidato para experimentos de mutagênese insercional usando o vetor pNI160, que possui o elemento impala ativo interrompendo o gene niaD, que codifica a enzima nitrato redutase.

Transmissão por afídeos e afinidade a Buchnera sp. GroEL de um mutante deletério da proteína de RTD do Potato leafroll virus

Potato leafroll virus (PLRV), gênero Polerovirus, família Luteoviridae, é transmitido por afídeos de um modo persistente e circulativo. Membros da família Luteoviridae associam-se a um homólogo de GroEL produzido pelo endosimbionte primário (Buchnera sp.) de afídeos para evitar a degradação na hemolinfa. Partículas purificadas de luteovirus contêm dois tipos de proteínas: a capa protéica (CP) de ~22 kDa e um componente "capsidial" de 54 kDa, o qual é uma forma truncada de uma proteína de "transleitura" a partir do códon de terminação do gene da CP. O domínio de transleitura (RTD) contém determinantes responsáveis pela transmissão do vírus. Um clone de cDNA infeccioso do PLRV e um mutante deletério da RTD foram usados para analisar as interações entre esse luteovirus e seu afídeo vetor Myzus persicae. As partículas mutantes do PLRV, deficientes da proteína RTD inteira, não foram transmissíveis por M. persicae e não se ligaram a Buchnera GroEL. Adicionalmente, esse mutante foi menos persistente na hemolinfa do afídeo do que o vírus selvagem.

Integração de pAN7-1 no genoma de Magnaporthe grisea mediada por enzima de restrição

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/10(7) protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.

Dinâmica temporal da população do ácaro Brevipalpus phoenicis e da leprose dos citros sob condições naturais de epidemia

A densidade populacional do ácaro vetor de Citrus leprosis virus (CiLV), Brevipalpus phoenicis, num talhão, é o principal indicador para a tomada de decisão de medidas de controle da leprose dos citros. Há pouca informação sobre o crescimento da incidência de plantas com leprose dos citros isoladamente ou em conjunto com a população do ácaro. Este trabalho teve por objetivo caracterizar o progresso temporal da população de B. phoenicis e da incidência de leprose dos citros e a relação entre essas populações, sob condições naturais de epidemia. Dois talhões de laranja doce, cvs. Valência e Natal, foram monitorados de 2002 a 2004, em intervalos de 22 dias, em média. O crescimento da incidência da doença foi lento e estimativas da taxa de progresso da doença foram bastante baixas, variando de 0,0126 a 0,0448 para 'Valência' e de 0,0044 a 0,0525 para 'Natal'. A quantidade de inóculo inicial nos ramos cresceu significativamente de um ciclo para outro. Ao final do período, a incidência foi de 32% das plantas de 'Valência' e de 6,8% na cv. Natal. Apesar de não ser sistêmica, a leprose dos citros comporta-se como poliética com acúmulo de inóculo de ano para ano, especialmente nos ramos. A incidência não esteve correlacionada com a presença de ácaros na planta em levantamentos anteriores, mas apresentou correlação positiva significativa (P<0,001) com a própria incidência da doença registrada anteriormente. Isto indica que a presença de sintomas, e não somente a de ácaros, deve ser considerada em amostragens visando controle da doença.