Indução de síntese de homoglobina em células K562 por doxorrubicina e aclarrubicina : em busca de um mecanismo comum

As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

Comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 a ao aFGF em cultura

O propósito do presente estudo foi avaliar o comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 e ao aFGF, em cultura, nas seguintes concentrações: TGFβ1 a 1ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL, TGFβ1 a 1ng/mL + aFGF a 5ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL e aFGF a 5ng/mL. Foi avaliada a morfologia celular, a atividade da fosfatase alcalina, através de ensaio com pNPP como substrato e a expressão das proteínas osteocalcina, sialoproteína óssea e sialofosfoproteína de dentina, através de RT-PCR. Após quatro dias, verificou-se que a média do número de nucléolos no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com aFGF a 5ng/mL. A média da atividade da fosfatase alcalina no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL. Foi observada a expressão de osteocalcina em todas as células pulpares humanas que proliferaram em cultura. Entretanto, no grupo em que foi utilizado o aFGF a 5ng/mL houve diminuição da expressão da osteocalcina. A exposição dos fatores não induziu a expressão de componentes da matriz de dentina tais como BSP e DSPP. Sugere-se que as células expostas ao TGFβ1 1ng/mL foram estimuladas, apresentando uma maior atividade celular e as células expostas ao aFGF 5ng/mL foram inibidas, apresentando uma menor atividade celular.

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.

Efeito de polimorfismos no gene LEP na expressão da leptina em adipócitos de bovinos de corte

Os caracteres produtivos são normalmente influenciados por muitos fatores, sendo difícil determinar todos os locos envolvidos em um fenótipo específico. Por isso, a seleção animal tem se baseado principalmente em uma estimativa direta ou indireta do fenótipo. A leptina é um importante regulador do metabolismo energético, da adiposidade e da reprodução. E por desempenhar diferentes funções, pode ser considerado um bom gene candidato para o estudo de associações entre marcadores moleculares e a eficiência reprodutiva ou ganho de peso. Em várias espécies, têm sido descritos diversos polimorfismos no gene da leptina, influenciando o ganho de peso, a reprodução, e outras características produtivas. Em bovinos, o STR IDVGA51 e o SNP LEPSau3A1, foram descritos por afetarem a performance reprodutiva, os alelos IDVGA51*181 e LEPSau3A1*2 estando associados a um aumento no intervalo entre partos de 79 e 81 dias, respectivamente, e os STRs BMS1074 e BM1500 afetam o ganho de peso, em vacas, no pós-parto: os alelos BMS1074*151 e BM1500*135 reduzindo e aumentando, respectivamente, o ganho de peso diário. Para confirmar o efeito ou não destes alelos na expressão do gene da leptina, este trabalho comparou os níveis de mRNA de leptina em animais portadores e não portadores dos alelos IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 e BM1500*135, com os objetivos de: 1. Verificar as distribuições genotípicas e alélicas dos marcadores IDVGA51, BMS1074, BM1500 e LEPSau3A1, em uma amostra de 137 bovinos da raça Brangus-Ibagé, provenientes da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA-Pecuária Sul, Bagé-RS). 2. Identificar, no rebanho, animais portadores e não portadores dos alelos IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 ou BM1500*135, previamente descritos como associados à eficiência reprodutiva e ganho de peso. 3. Avaliar os animais, criados em campo nativo, com pastagem natural, quanto à sua condição corporal. 4. Realizar procedimento cirúrgico, para obtenção de amostras de tecido adiposo subcutâneo e omental. 5. Dosar os níveis de mRNA de leptina nos adipócitos destes dois tecidos, através do método quantitativo em tempo real (Real-Time RT-PCR), comparando a expressão do gene LEP entre indivíduos portadores e não portadores dos alelos de predisposição a ganho de peso e desempenho reprodutivo.

Estudo da prevalência do vírus Influenza A e B numa amostragem populacional do Arquipélago da Madeira

As infecções respiratórias de etiologia viral constituem um problema alarmante de Saúde Pública, sendo responsáveis pelo elevado e constante aumento dos índices de morbimortalidade registados no Mundo associados ao vírus influenza. O presente estudo teve como objetivo avaliar a prevalência dos anticorpos IgG e IgM em soros de utentes com requisições para análises serológicas ao vírus influenza A e B. Os utentes foram atendidos entre 1 de Abril de 2009 e 30 de Abril de 2011. Outro objectivo foi determinar a epidemiologia do vírus pandémico A (H1N1) 2009 nos indivíduos com sintomatologia de gripe durante o período entre Julho de 2009 e Julho de 2010 utilizando a técnica de RT-PCR em amostras de exsudado (ou aspirado) nasofaríngeo. Tendo por base o universo de amostragem de 981 indivíduos, constatou-se que 10,7 e 8,2% da população analisada apresenta valores positivos de anticorpos IgM e IgG indicativos de infecção pelo vírus influenza A e B, respectivamente. Constatou-se, também, que entre os 1934 indivíduos submetidos a procedimentos de diagnóstico laboratorial para a detecção de infecção pelo vírus pandémico A (H1N1) 2009, cerca de 747 (38,6%) estavam infectados. Verificou-se que, a população mais jovem foi mais susceptível à infecção pelo vírus influenza A (H1N1) 2009. Isto difere da típica época de gripe sazonal, na qual as pessoas mais idosas estão mais propensas a tornarem-se infectadas e a desenvolver doença grave por influenza A e/ou B. A prevalência de gripe na RAM é reduzida – um dos aspectos plausíveis que justifiquem esta afirmação poderá dever-se às características genéticas da população da RAM estudada. Embora seja de elevada relevância salientar que o Programa Regional de Vacinação (PRV) da RAM tem alcançado reconhecimento nacional e internacional devido às excelentes taxas de cobertura vacinal, fruto da atitude entre cidadãos e profissionais de saúde.

Co-infecção pelo vírus da hepatite G em pacientes infectados pelo Leihsmania chagasi

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à resposta ao estresse

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress.

Transcriptoma diferencial entre células-tronco mesenquimais humanas jovens e senescentes

Human mesenchymal stem cells (MSC) are powerful sources for cell therapy in regenerative medicine. The long time cultivation can result in replicative senescence or can be related to the emergence of chromosomal alterations responsible for the acquisition of tumorigenesis features in vitro. In this study, for the first time, the expression profile of MSC with a paracentric chromosomal inversion (MSC/inv) was compared to normal karyotype (MSC/n) in early and late passages. Furthermore, we compared the transcriptome of each MSC in early passages with late passages. MSC used in this study were obtained from the umbilical vein of three donors, two MSC/n and one MSC/inv. After their cryopreservation, they have been expanded in vitro until reached senescence. Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen) and marked with the GeneChip ® 3 IVT Express Kit (Affymetrix Inc.). Subsequently, the fragmented aRNA was hybridized on the microarranjo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc.). The statistical analysis of differential gene expression was performed between groups MSC by the Partek Genomic Suite software, version 6.4 (Partek Inc.). Was considered statistically significant differences in expression to p-value Bonferroni correction ˂.01. Only signals with fold change ˃ 3.0 were included in the list of differentially expressed. Differences in gene expression data obtained from microarrays were confirmed by Real Time RT-PCR. For the interpretation of biological expression data were used: IPA (Ingenuity Systems) for analysis enrichment functions, the STRING 9.0 for construction of network interactions; Cytoscape 2.8 to the network visualization and analysis bottlenecks with the aid of the GraphPad Prism 5.0 software. BiNGO Cytoscape pluggin was used to access overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. The comparison between senescent and young at each group of MSC has shown that there is a difference in the expression parttern, being higher in the senescent MSC/inv group. The results also showed difference in expression profiles between the MSC/inv versus MSC/n, being greater when they are senescent. New networks were identified for genes related to the response of two of MSC over cultivation time. Were also identified genes that can coordinate functional categories over represented at networks, such as CXCL12, SFRP1, xvi EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. The biological interpretation of these data suggests that the population of MSC/inv has different constitutional characteristics, related to their potential for differentiation, proliferation and response to stimuli, responsible for a distinct process of replicative senescence in MSC/inv compared to MSC/n. The genes identified in this study are candidates for biomarkers of cellular senescence in MSC, but their functional relevance in this process should be evaluated in additional in vitro and/or in vivo assays

Purification, characterization, crystallization and theoretical molecular modeling of gyroxin fraction from Crotalus durissus terrificus venom (Laurenti, 1768)

The venom of Crotalus durissus terrificus snakes presents various substances, including a serine protease with thrombin-like activity, called gyroxin, that clots plasmatic fibrinogen and promote the fibrin formation. The aim of this study was to purify and structurally characterize the gyroxin enzyme from Crotalus durissus terrificus venom. For isolation and purification, the following methods were employed: gel filtration on Sephadex G75 column and affinity chromatography on benzamidine Sepharose 6B; 12% SDS-PAGE under reducing conditions; N-terminal sequence analysis; cDNA cloning and expression through RT-PCR and crystallization tests. Theoretical molecular modeling was performed using bioinformatics tools based on comparative analysis of other serine proteases deposited in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database. Protein N-terminal sequencing produced a single chain with a molecular mass of similar to 30 kDa while its full-length cDNA had 714 bp which encoded a mature protein containing 238 amino acids. Crystals were obtained from the solutions 2 and 5 of the Crystal Screen Kit (R), two and one respectively, that reveal the protein constitution of the sample. For multiple sequence alignments of gyroxin-like B2.1 with six other serine proteases obtained from snake venoms (SVSPs), the preservation of cysteine residues and their main structural elements (alpha-helices, beta-barrel and loops) was indicated. The localization of the catalytic triad in His57, Asp102 and Ser198 as well as S1 and S2 specific activity sites in Thr193 and Gli215 amino acids was pointed. The area of recognition and cleavage of fibrinogen in SVSPs for modeling gyroxin B2.1 sequence was located at Arg60, Arg72, Gln75, Arg81, Arg82, Lis85, Glu86 and Lis87 residues. Theoretical modeling of gyroxin fraction generated a classical structure consisting of two alpha-helices, two beta-barrel structures, five disulfide bridges and loops in positions 37, 60, 70, 99, 148, 174 and 218. These results provided information about the functional structure of gyroxin allowing its application in the design of new drugs.

Sugarcane genes differentially expressed during water deficit

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Rotavírus bovino: fatores de risco, prevalência e caracterização antigênica de amostras em rebanhos leiteiros no estado de São Paulo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Aberrant expression of E-cadherin and beta-catenin proteins in placenta of bovine embryos derived from somatic cell nuclear transfer

Abnormal placental development is common in the bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT)-derived fetus. In the present study, we characterised the expression of E-cadherin and beta-catenin, structural proteins of adherens junctions, in SCNT gestations as a model for impaired placentation. Cotyledonary tissues were separated from pregnant uteri of SCNT (n - 6) and control pregnancies (n - 8) obtained by artificial insemination. Samples were analysed by western blot, quantitative RT-PCR (qRT-PCR) and immunohistochemistry. Bovine trophectoderm cell lines derived from SCNT and control embryos were analysed to compare with the in utero condition. Although no differences in E-cadherin or beta-catenin mRNA abundance were observed in fetal tissues between the two groups, proteins encoded by these genes were markedly under-expressed in SCNT trophoblast cells. Immunohistochemistry revealed a different pattern of E-cadherin and total beta-catenin localisation in SCNT placentas compared with controls. No difference was observed in subcellular localisation of dephosphorylated active-beta-catenin protein in SCNT tissues compared with controls. However, qRT-PCR confirmed that the wingless (WNT)/beta-catenin signalling pathway target genes CCND1, CLDN1 and MSX1 were downregulated in SCNT placentas. No differences were detected between two groups of bovine trophectoderm cell lines. Our results suggest that impaired expression of E-cadherin and beta-catenin proteins, along with defective beta-catenin signalling during embryo attachment, specifically during placentation, is a molecular mechanism explaining insufficient placentation in the bovine SCNT-derived fetus.

Ocorrência de animais persistentemente infectados pelo vírus da diarréia viral bovina em rebanhos bovinos nos Estados de Minas Gerais e São Paulo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Characterization of bovine transcripts preferentially expressed in testis and with a putative role in spermatogenesis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Protection levels of vaccinated pigeons (Columba livia) against a highly pathogenic newcastle disease virus strain

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)