Efeitos tardios no tecido ovariano de ratas Wistar após tratamento com Docetaxel e Ciclofosfamida

O câncer de mama (CM) é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo. Sabe-se que a maior incidência de CM ocorre nas mulheres pós-menopausa, entretanto é crescente o número de mulheres jovens acometidas por esta doença. O tratamento do CM pode incluir: quimioterapia, radioterapia e/ou hormonioterapia. A quimioterapia, por se ser um tratamento sistêmico, pode causar importantes efeitos colaterais, entre eles a falência ovariana induzida por quimioterapia (FOIQ). As principais consequências da FOIQ são a infertilidade, além de complicações tardias relacionadas à diminuição do estrogênio, como a osteoporose e doenças cardiovasculares. O regime quimioterápico TC, adota a associação do docetaxel com a ciclofosfamida, como uma opção por fármacos que resultem numa taxa de sobrevida livre do câncer, e menores efeitos colaterais. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos tardios no ovário causados pelo tratamento com a associação dos quimioterápicos docetaxel e ciclofosfamida (TC), em modelo animal com ratos Wistar. Para verificar o sinergismo desses quimioterápicos e assim analisar o efeito da administração conjunta, ratos Wistar fêmeas foram divididos em dois grupos: um grupo controle e um grupo que recebeu quimioterapia (TC). Os animais foram submetidos a eutanasia cinco meses após o fim do tratamento, e foram recolhidos o plasma e os ovários. Foram observadas alterações importantes. O nível de estradiol no plasma foi significativamente reduzido no grupo de TC em comparação com o grupo controle. Além disso, o número de núcleos apoptóticos foi maior no grupo TC. O papel da resposta inflamatória no desenvolvimento da lesão ovariana foi também investigado, e notou-se um aumento do número de mastócitos, e aumento da expressão de Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) no grupo TC. O envolvimento de fibrose nesse processo, foi também investigado. Os resultados mostraram que níveis de expressão de Fator de Crescimento Tumoral-β1 (TGF-β1), Colágeno Tipo I (Col-I) e Colágeno Tipo III (Col-III) estavam maiores no grupo TC em comparação com o grupo de controle. A análise ultraestrutural revelou a presença de feixes de colágeno no grupo tratado, e mostrou que a arquitetura do tecido do ovário estava mais desorganizada neste grupo comparado ao grupo controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a combinação de ciclofosfamida e docetaxel, um recente regime quimioterápico proposto para o tratamento do CM, pode levar a importantes alterações no ovário. O processo inflamatório, desencadeado pela administração dos quimioterápicos, estimula a apoptose e liberação de TGF-β no estroma ovariano, que induz a produção de matriz extracelular e subsequente, substituição do tecido sadio por tecido fibrótico. A principal consequência deste processo é a diminuição, ou perda, da função ovariana, levando à menopausa precoce e possível infertilidade. É importante compreender os mecanismos envolvidos na infertilidade provocada pelo regime TC, a fim de estudar novos métodos que evitem este efeito indesejável em mulheres submetidas a tratamento do CM.

Modulação por Sucupira (Pterodon polygalaeflorus, Benth) da distribuição de Linfócitos T ativados e T de memória em linfonodos (LN) de camundongos com Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) e da mielopoiese em baços de camundongos primados com Adjuvante Completo de Freund (AFC)

Sementes de árvores do gênero Pterodon, conhecidas principalmente pelo nome Sucupira, são utilizadas popularmente para o tratamento de doenças reumáticas. Na presente dissertação, temos como objetivo estudar a possível ação do extrato hidroalcoólico de sementes de Pterodon polygalaeflorus (EHPp) no tratamento de Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) em camundongos DBA/1J. Verificou-se a distribuição de Linfócitos T CD4+ com fenótipo de memória em linfonodos de animais com CIA; a possível interferência do tratamento no segundo aumento de células mielóides (Mac-1+) esplênicas gerado pela segunda injeção de colágeno tipo II (CII) para indução da CIA e confirmou-se o fenótipo granulocítico dessas células mielóides. Além disso, através de outro modelo experimental de 10 dias de duração, objetivou-se estudar as células mielóides Mac-1+: se o tratamento com EHPp interfere na mielopoese esplênica induzida somente pela injeção de Adjuvante de Freund Completo (AFC) em camundongos DBA1/J e avaliar uma eventual diferença entre o grau de ativação dessas células em animais primados com AFC tratados ou não com EHPp. A CIA foi induzida em camundongos DBA/1J machos, por injeção intradérmica (i.d.) de CII em AFC com reforço intraperitonial de CII três semanas após a primeira injeção. O tratamento oral, diário, com EHPp por cerca de 30 dias foi iniciado no dia do reforço com CII. No modelo de curta duração, com o intuito de verificar o possível aumento de células Mac-1+ no baço, os animais foram tratados oralmente com EHPp, por 9 dias, sendo o AFC injetado, i.d., no 5o dia do tratamento e os animais sacrificados no 10o. Os resultados obtidos foram: o tratamento com EHPp interfere na distribuição de Linfócitos T com fenótipo de memória em animais com indução de CIA; resultados preliminares sugerem que o tratamento com EHPp não interfere no segundo aumento de células mielóides no baço no modelo CIA; a maioria das células mielóides presentes no baço de animais sadios ou de animais com CIA apresenta fenótipo granulocítico (GR.1+); o tratamento com EHPp reduz significantemente a mielopoese esplênica induzida pela injeção de AFC; a fração significante de células Mac-1+ no baço de animais primados com AFC apresenta aumento de produção de Espécies Reativas de Oxigênio em relação aos animais sadios ou tratados com EHPp. Em conjunto, estes resultados permitem identificar uma possível ação anti-inflamatória do EHPp ao impedir o aumento de células inflamatórias no baço de animais primados com AFC, bem como uma atividade imunossupressora, evidenciada pela redução de Linfócitos com perfil de recém ativação e de Linfócitos com perfil de memória nos LNs em relação aos animais com CIA, sugerindo o seu envolvimento nos processos de ativação e de migração linfocitários.

Efeito do tratamento com a proteína quimérica IL-13PE sobre a inflamação pulmonar induzida por partículas de sílica em camundongos

A interleucina 13 (IL-13) tem sido apontada como um dos principais mediadores em processos de ativação de fibroblastos e indução de fibrose pulmonar, sendo, portanto, considerada como um alvo terapêutico importante. A silicose é uma doença pulmonar inflamatória crônica, de caráter ocupacional, caracterizada por uma intensa resposta fibrótica e granulomatosa. Com base nestas observações, tivemos por objetivo investigar o potencial efeito da administração da imunotoxina IL-13-PE38QQR (IL-13PE) sobre o modelo de silicose em camundongos. Camundongos Swiss-Webster foram anestesiados e instilados intranasalmente com partículas de sílica (10 mg), sendo a administração da IL-13PE (200ng/dia) realizada por via intranasal, uma vez ao dia em dias alternados no período entre 21 a 27 dias após a provocação. Analisamos o componente inflamatório, a deposição de colágeno e a área de granuloma avaliados através de técnicas clássicas de histologia, incluindo coloração com H&E e Picrus-sirius, ou ainda a quantificação do conteúdo de colágeno por Sircol. Os componentes de matriz extracelular fibronectina e laminina foram avaliados através de imunohistoquímica. Citocinas e quimiocinas foram quantificadas por sistema de ELISA. As medidas de função pulmonar e resposta de hiperreatividade foram realizadas através do sistema de pletismografia de corpo inteiro invasiva. Verificamos que o tratamento curativo com a IL-13PE inibiu de forma acentuada o comprometimento da função pulmonar nos camundongos silicóticos, incluindo tanto aumento da resistência como da elastância, assim como a resposta de hiperratividade das vias aéreas ao agente broncoconstrictor metacolina. De forma coerente, os animais silicóticos quando submetidos ao tratamento com IL-13PE apresentaram marcada redução do componente inflamatório pulmonar e da resposta fibrótica, atestado pela diminuição na produção de colágeno, laminina e fibronectina e redução importante da área de granuloma. De forma semelhante, as citocinas (TNF-α e TGF-) e quimiocinas (MIP-1α, MIP-2, TARC, IP-10, MDC) detectadas em quantidade aumentada no pulmão de animais silicóticos foram reduzidas pelo tratamento com a IL-13PE. Em conclusão, nossos resultados mostram que a administração curativa da IL-13PE foi capaz de inibir os componentes inflamatórios e fibróticos da fase crônica do quadro silicótico em camundongos, o que se refletiu de forma clara na melhora da função pulmonar. Em conjunto, nossos achados indicam que a utilização da IL13PE parece constituir uma abordagem terapêutica extremamente promissora para aplicação em casos de doenças crônicas de natureza fibrótica como a silicose.

Transplantation of human fetal blood stem cells in the osteogenesis imperfecta mouse leads to improvement in multiscale tissue properties.

Osteogenesis imperfecta (OI or brittle bone disease) is a disorder of connective tissues caused by mutations in the collagen genes. We previously showed that intrauterine transplantation of human blood fetal stem/stromal cells in OI mice (oim) resulted in a significant reduction of bone fracture. This work examines the cellular mechanisms and mechanical bone modifications underlying these therapeutic effects, particularly examining the direct effects of donor collagen expression on bone material properties. In this study, we found an 84% reduction in femoral fractures in transplanted oim mice. Fetal blood stem/stromal cells engrafted in bones, differentiated into mature osteoblasts, expressed osteocalcin, and produced COL1a2 protein, which is absent in oim mice. The presence of normal collagen decreased hydroxyproline content in bones, altered the apatite crystal structure, increased the bone matrix stiffness, and reduced bone brittleness. In conclusion, expression of normal collagen from mature osteoblast of donor origin significantly decreased bone brittleness by improving the mechanical integrity of the bone at the molecular, tissue, and whole bone levels.

The toughness of adipose tissue: measurements and physical basis.

The measured toughness J(C) of adipose and dermal porcine tissues are 4.1 and 17 kJ m(-2), respectively, via a trouser tear test. An assessment is made of the contribution to overall toughness from the microstructural elements. The analysis suggests that the toughness of adipose tissue is determined by the collagen network that surrounds the adipocytes. The volume fraction of the interlobular septa is sufficiently low for it to make a negligible contribution to the macroscopic toughness.

Material model of lung parenchyma based on living precision-cut lung slice testing.

We describe a novel constitutive model of lung parenchyma, which can be used for continuum mechanics based predictive simulations. To develop this model, we experimentally determined the nonlinear material behavior of rat lung parenchyma. This was achieved via uni-axial tension tests on living precision-cut rat lung slices. The resulting force-displacement curves were then used as inputs for an inverse analysis. The Levenberg-Marquardt algorithm was utilized to optimize the material parameters of combinations and recombinations of established strain-energy density functions (SEFs). Comparing the best-fits of the tested SEFs we found Wpar = 4.1 kPa(I1-3)2 + 20.7 kPa(I1 - 3)3 + 4.1 kPa(-2 ln J + J2 - 1) to be the optimal constitutive model. This SEF consists of three summands: the first can be interpreted as the contribution of the elastin fibers and the ground substance, the second as the contribution of the collagen fibers while the third controls the volumetric change. The presented approach will help to model the behavior of the pulmonary parenchyma and to quantify the strains and stresses during ventilation.

Variability of nanoindentation responses of bone and artificial bone-like composites

Nanoindentation is a popular technique for measuring the intrinsic mechanical response of bone and has been used to measure a single-valued elastic modulus. However, bone is a composite material with 20-80 nm hydroxyapatite plates embedded in a collagen matrix, and modern instrumentation allows for measurements at these small length scales. The present study examines the indentation response of bone and artificial gelatin-apatite nanocomposite materials across three orders of magnitude of lengthscale, from nanometers to micrometers, to isolate the composite phase contributions to the overall response. The load-displacement responses were variable and deviated from the quadratic response of homogeneous materials at small depths. The distribution of apparent elastic modulus values narrowed substantially with increasing indentation load. Indentation of particulate nanocomposites was simulated using finite element analysis. Modeling results replicated the convergence in effective modulus seen in the experiments. It appears that the apatite particles are acting as the continuous ("matrix") phase in bone and nanocomposites. Copyright © 2004 by ASME.

Mineralization and nanomechanical properties in Articular Calcified Cartilage (ACC)

The contribution of the relative volumes of mineral and collagen to the nanomechanical behavior of articular calcified cartilage is explored using nanoindentation, quantitative backscattered electron imaging, and finite element analysis. Elastic modulus generally increases with mineral volume fraction. In highly mineralized tissues, the mineral occupation of water space significantly increases modulus with addition of little mineral. Mineral and organic phases were modeled using Hashin-Shtrikman composite bounds, calculated as a function of mineral volume fraction. Modulus values fall between the Hashin-Shtrikman bounds, indicating some intermediate degree of mineral phase connectivity. Such connectivity in ACC is greater than that achieved in bone and results from uniform collagen orientation and large volume of water space available for mineral occupation.

Nanoindentation measurements of bone viscoelasticity as a function of hydration state

Bone is an anisotropic material, and its mechanical properties are determined by its microstructure as well as its composition. Mechanical properties of bone are a consequence of the proportions of, and the interactions between, mineral, collagen and water. Water plays an important role in maintaining the mechanical integrity of the composite, but the manner in which water interacts within the ultrastructure is unclear. Dentine being an isotropic two-dimensional structure presents a homogenous composite to examine the dehydration effects. Nanoindentation methods for determining the viscoelastic properties have recently been developed and are a subject of great interest. Here, one method based on elastic-viscoelastic correspondence for 'ramp and hold' creep testing (Oyen, J. Mater. Res., 2005) has been used to analyze viscoelastic behavior of polymeric and biological materials. The method of 'ramp and hold' allows the shear modulus at time zero to be determined from fitting of the displacement during the maximum load hold. Changes in the viscoelastic properties of bone and dentine were examined as the material was systematically dehydrated in a series of water:solvent mixes. Samples of equine dentine were sectioned and cryo-polished. Shear modulus was obtained by nanoindentation using spherical indenters with a maximum load hold of 120s. Samples were tested in different solvent concentrations sequentially, 70% ethanol to 50% ethanol, 70 % ethanol to 100% ethanol, 70% ethanol to 70% methanol to 100% methanol, and 70% ethanol to 100% acetone, after storage in each condition for 24h. By selectively removing and then replacing water from the composite, insights in to the ultrastructure of the tissue can be gained from the corresponding changes in the experimentally determined moduli, as well as an understanding of the complete reversibility of the dehydration process. © 2006 Materials Research Society.

A model for nonlinear viscoelastic mechanical responses of collagenous soft tissues

Experimental observations of the time-dependent mechanical responses of collagenous tissues have demonstrated behavior that deviates from standard treatments of linear or quasi-linear viscoelasticity. In particular, time-dependent deformation can be strongly coupled to strain level, and strain-rate independence can be observed under monotonic loading, even for a tissue with dramatic stress relaxation. It was postulated that this nonlinearity is fundamentally associated with gradual recruitment of individual collagen fibrils during applied mechanical loading. Based on previously observed experimental results for the time-dependent response of collagenous soft tissues, a model is developed to describe the mechanical behavior of these tissues under uniaxial loading. Tissue stresses, under applied strain-controlled loading, are assumed to be a sum of elastic and viscoelastic stress contributions. The relative contributions of elastic and viscoelastic stresses is assumed to vary with strain level, leading to strain- and time-dependent mechanical behavior. The model formulation is examined under conditions of monotonic loading at varying constant strain rates and stress-relaxation at different applied strain levels. The model is compared with experimental data for a membranous biological soft tissue, the amniotic sac, and is found to agree well with experimental results. The limiting behavior of the novel model, at large strains relative to the collagen recruitment, is consistent with the quasi-linear viscoelastic approach. © 2006 Materials Research Society.

Antihemostatic molecules from saliva of blood-feeding arthropods

The ability to feed on vertebrate blood has evolved many times in various arthropod clades. Consequently, saliva of blood-feeding arthropods has proven to be a rich source of antihemostatic molecules. A variety of platelet aggregation inhibitors antagonize platelet responses to wound-generated signals, including ADP, thrombin, and collagen. Anticoagulants disrupt elements of both the intrinsic and extrinsic pathways. Vasodilators include nitrophorins (nitric oxide storage and transport heme proteins), a variety of peptides that mimic endogenous vasodilatory neuropeptides, and proteins that catabolize or sequester endogenous vasoconstrictors. Multiple salivary proteins may be directed against each component of hemostasis, resulting in both redundancy and in some cases cooperative interactions between antihemostatic proteins. The complexity and redundancy of saliva ensures an efficient blood meal for the arthropod, but it also provides a diverse array of novel antihemostatic molecules for the pharmacologist.

Identification of novel semenogelin I-derived antimicrobial peptide from liquefied human seminal plasma

Semenogelin I (SgI) is one of the most abundant proteins in human seminal plasma. SgI plays a key role in sperm coagulation and spermatozoon immobilization. in addition, SgI and/or its proteolytic fragments are involved in regulating spermatozoon motility

Biochemical and biological properties of Trimeresurus jerdonii venom and characterization of a platelet aggregation-inhibiting acidic phospholipase A(2)

Several biochemical and biological activities such as phospholipase A(2), arginine esterase, proteolytic, L-amino acid oxidase, 5'nucleotidase, acetylcholinesterase, thrombin-like, anticoagulant, and hemorrhagic activities were determined for whole desiccated venom of Trimeresurus jerdonii. An acidic phospholipase (named TJ-PLA(2)) was purified by anionic exchange chromatography, gel filtration, and reverse phase HPLC. TJ-PLA(2) had a molecular weight of 16,000 and a pI of 4.8. TJ-PLA(2) was non-lethal to mice up to an i.p. dose of 15 mg/kg body weight and lacked neurotoxicity and myotoxicity. It induced edema in the footpads of mice. The purified enzyme inhibited ADP- and collagen-induced human platelet aggregation in a manner which was both dose- and time-dependent.

A novel disintegrin, jerdonatin, inhibits platelet aggregation and sperm-egg binding

A novel disintegrin, jerdonatin, was purified to homogeneity from Trimeresurus jerdonii venom by gel filtration and reversed-phase high-pressure liquid chromatography. We isolated the cDNA encoding jerdonatin from the snake venom gland. Jerdonatin cDNA precursor,;encoded pre-peptide, metalloprotease and disintegrin domain. Jerdonatin is composed of 72 amino acid residues including 12 cysteines and the tripeptide sequence Arg-Gly-Asp (RGD), a well-known characteristic of the disintegrin family. Molecular mass of jerdonatin was determined to be 8011 Da by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Jerdonatin inhibited ADP- and collagen-induced human platelet aggregation with IC50 of 123 and 135 nM, respectively. We also investigated the effect of jerdonatin on the binding of B6D2F1 hybrid mice spermatozoa to mice zona-free eggs and their subsequent fusion. Jerdonatin significantly inhibited sperm-egg binding in a concentration-dependent manner, but had no effect on the fusion of sperm-egg. These results indicate that integrins on the egg play a role in mammalian fertilization. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

SECRETORY MONOCLONAL IGA ANTIBODY TO HUMAN SPERM PRODUCED BY GASTROINTESTINAL IMMUNIZATION INHIBITS HUMAN SPERM ACTIVITY AND MOUSE INVITRO FERTILIZATION

BALB/c mice were immunized intragastrically with human sperm. Cells from the Peyer's patches and spleens of the immunized mice were for the preparation of hybridomas secreting antisperm monoclonal IgA (mcIgA). The specific ratio of IgA-secreting cells in Peyer's patches was much higher than that in spleen. The binding site on human sperm of 9 of 19 mcIgA was in the post-acrosomal region using an immunofluorescent assay. Two of eight selected mcIgA caused strong human sperm agglutination and three of them produced significant inhibition of mouse in vitro fertilization. No mcIgA tested caused obvious human sperm immobilization or inhibited mouse in vivo fertilization. In vitro assembly of selected mcIgA in ascites with mouse secretory component (SC) caused no significant changes in effects on sperm function and in vitro fertilization. By use of Western blotting, dimer or higher polymers were demonstrated in all selected mcIgAs and corresponding protein antigens in 6 of 8 selected mcIgAs. These results suggest that human sperm function may be inhibited and fertilization rate reduced by specific secretory IgA to human sperm and that secretory immunity to protein antigens of human sperm could be induced by intragastrointestinal immunization.