Rôle de la CuZn superoxyde dismutase dans la néovascularisation en réponse à l'ischémie

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques.

Heteroplasmy in mammal mitochondrial deoxyribonucleic acid

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire.

The Effects of Pro-inflammatory Cytokines on the L-type Calcium Current in Mouse Ventricular Myocytes

L’inflammation: Une réponse adaptative du système immunitaire face à une insulte est aujourd’hui reconnue comme une composante essentielle à presque toutes les maladies infectieuses ou autres stimuli néfastes, tels les dommages tissulaires incluant l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, l’inflammation se caractérise principalement par une activation à long terme du système immunitaire, menant à une faible, mais chronique sécrétion de peptides modulateurs, appelés cytokines pro-inflammatoires. En effet, la littérature a montré à plusieurs reprises que les patients souffrant d’arythmies et de défaillance cardiaque présentent des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires tels le facteur de nécrose tissulaire alpha (TNFα), l’interleukine 1β (IL-1β) et l’interleukine 6. De plus, ces patients souffrent souvent d’une baisse de la capacité contractile du myocarde. Le but de notre étude était donc de déterminer si un lien de cause à effet existe entre ces phénomènes et plus spécifiquement si le TNFα, l’IL-1β et l’IL-6 peuvent affecter les propriétés électriques et contractiles du cœur en modulant le courant Ca2+ de type L (ICaL) un courant ionique qui joue un rôle primordial au niveau de la phase plateau du potentiel d’action ainsi qu’au niveau du couplage excitation-contraction. Les possibles méchansimes par lesquels ces cytokines exercent leurs effets seront aussi explorés. Pour ce faire, des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveau-nées ont été mis en culture et traités 24 heures avec des concentrations pathophysiologiques (30 pg/mL) de TNFα, IL-1β ou IL-6. Des enregistrements de ICaL réalisés par la technique du patch-clamp en configuration cellule entière ont été obtenus par la suite et les résultats montrent que le TNFα n’affecte pas ICaL, même à des concentrations plus élevées (1 ng/mL). En revanche, l’IL-1β réduisait de près de 40% la densité d’ICaL. Afin d’examiner si le TNFα et l’IL-1β pouvaient avoir un effet synergique, les cardiomyocytes ont été traité avec un combinaison des deux cytokines. Toutefois aucun effet synergique sur ICaL n’a été constaté. En outre, l’IL-6 réduisait ICaL significativement, cependant la réduction de 20% était moindre que celle induite par IL-1β. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à la réduction de ICaL après un traitement avec IL-1β, l’expression d’ARNm de CaV1.2, sous-unité α codante pour ICaL, a été mesurée par qPCR et les résultats obtenus montrent aucun changement du niveau d’expression. Plusieurs études ont montré que l’inflammation et le stress oxydatif vont de pair. En effet, l’imagerie confocale nous a permis de constater une augmentation accrue du stress oxydatif induit par IL-1β et malgré un traitement aux antioxydants, la diminution de ICaL n’a pas été prévenue. Cette étude montre qu’IL-1β et IL-6 réduisent ICaL de façon importante et ce indépendamment d’une régulation transcriptionelle ou du stress oxydatif. De nouvelles données préliminaires suggèrent que ICaL serait réduit suite à l’activation des protéines kinase C mais des études additionelles seront nécessaires afin d’étudier cette avenue. Nos résultats pourraient contribuer à expliquer les troubles du rythme et de contractilité observés chez les patients souffrant de défaillance cardiaque.

Quantitative functional neuroimaging of cerebral physiology in healthy aging

Les études d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) ont pour prémisse générale l’idée que le signal BOLD peut être utilisé comme un succédané direct de l’activation neurale. Les études portant sur le vieillissement cognitif souvent comparent directement l’amplitude et l’étendue du signal BOLD entre des groupes de personnes jeunes et âgés. Ces études comportent donc un a priori additionnel selon lequel la relation entre l’activité neurale et la réponse hémodynamique à laquelle cette activité donne lieu restent inchangée par le vieillissement. Cependant, le signal BOLD provient d’une combinaison ambiguë de changements de métabolisme oxydatif, de flux et de volume sanguin. De plus, certaines études ont démontré que plusieurs des facteurs influençant les propriétés du signal BOLD subissent des changements lors du vieillissement. L’acquisition d’information physiologiquement spécifique comme le flux sanguin cérébral et le métabolisme oxydatif permettrait de mieux comprendre les changements qui sous-tendent le contraste BOLD, ainsi que les altérations physiologiques et cognitives propres au vieillissement. Le travail présenté ici démontre l’application de nouvelles techniques permettant de mesurer le métabolisme oxydatif au repos, ainsi que pendant l’exécution d’une tâche. Ces techniques représentent des extensions de méthodes d’IRMf calibrée existantes. La première méthode présentée est une généralisation des modèles existants pour l’estimation du métabolisme oxydatif évoqué par une tâche, permettant de prendre en compte tant des changements arbitraires en flux sanguin que des changements en concentrations sanguine d’O2. Des améliorations en terme de robustesse et de précisions sont démontrées dans la matière grise et le cortex visuel lorsque cette méthode est combinée à une manipulation respiratoire incluant une composante d’hypercapnie et d’hyperoxie. Le seconde technique présentée ici est une extension de la première et utilise une combinaison de manipulations respiratoires incluant l’hypercapnie, l’hyperoxie et l’administration simultanée des deux afin d’obtenir des valeurs expérimentales de la fraction d’extraction d’oxygène et du métabolisme oxydatif au repos. Dans la deuxième partie de cette thèse, les changements vasculaires et métaboliques liés à l’âge sont explorés dans un groupe de jeunes et aînés, grâce au cadre conceptuel de l’IRMf calibrée, combiné à une manipulation respiratoire d’hypercapnie et une tâche modifiée de Stroop. Des changements de flux sanguin au repos, de réactivité vasculaire au CO2 et de paramètre de calibration M ont été identifiés chez les aînés. Les biais affectant les mesures de signal BOLD obtenues chez les participants âgés découlant de ces changements physiologiques sont de plus discutés. Finalement, la relation entre ces changements cérébraux et la performance dans la tâche de Stroop, la santé vasculaire centrale et la condition cardiovasculaire est explorée. Les résultats présentés ici sont en accord avec l’hypothèse selon laquelle une meilleure condition cardiovasculaire est associée à une meilleure fonction vasculaire centrale, contribuant ainsi à l’amélioration de la santé vasculaire cérébrale et cognitive.

IL-23 receptor and IL-12 receptor expression is restricted to distinct cell types in the IL-23R-GFP reporter mouse

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MII) sont caractérisées par des réponses immunitaires incontrôlées dans l'intestin. Des études génétiques ont associé un polymorphisme dans le gène de l'IL23R à la résistance aux MII. IL23R code pour la protéine de l’IL-23r, une sous-unité du récepteur à l’IL-23 (IL-23R). Ce récepteur appartient à la famille de l’IL-12R, contenant plusieurs récepteurs hétérodimériques. D’ailleurs, IL-12R et IL-23R partagent la sous-unité IL12Rb1. Néanmoins, ces deux récepteurs favorisent des réponses immunitaires distinctes (Th1 vs Th17). Ce mémoire caractérise les dynamiques d’expression cellulaires de l’IL-23R et l’IL-12R, afin d’élucider leurs rôles dans l’inflammation. Nous avons établi qu’IL-23R et IL-12R ne sont jamais co-exprimés, malgré qu’ils partagent la sous-unité IL-12Rβ1. Parmi les cellules de rates de souris, la protéine IL-23r est trouvée dans certaines cellules T TCRγδ ou T CD4+, quelques cellules B et des cellules Lti-like. La protéine IL-12Rβ2 est exprimée par quelques cellules B. L’analyse de l’expression de l’IL-23R et l’IL-12R dans différents organes révéla que la plus grande proportion de cellules exprimant l’IL-23R se retrouve dans la lamina propria de l'intestin grêle, alors que les cellules exprimant l’IL-12Rβ2 ont été retrouvées en proportion équivalente dans tous les organes lymphoïdes. Ces observations appuient les études génétiques suggérant un rôle prédominant de l’IL23R dans les intestins. Finalement, des cultures in vitro suggèrent que l’IL-23R ou l’IL-12R avaient des réactions croisées à l’IL-12 ou l’IL-23. L’étude de l’IL-23R dans les MII devrait donc être complémentée par l’étude de l’IL-12R, car les deux récepteurs pourraient avoir des rôles complémentaires.

Impact of (pro)renin receptor deficiency in adipose tissue using a genetically engineered mouse model

La stimulation du récepteur de la rénine/prorénine [(P) RR], un membre récemment découvert du système rénine-angiotensine (SRA), augmente l'activité du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indépendante. Pour étudier l'impact potentiel du (P)RR dans le développement de l`obésité, nous avons émis l'hypothèse que les souris déficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le métabolisme du tissu adipeux, l'activité locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont été générées en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont été évalués hebdomadairement dans les mâles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors qu’ils étaient maintenu sur une diète normal. De plus, un groupe de femelles a été placé pour 6 semaines sur une diète riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activité ambulatoire ont été évaluées par l’EchoMRI et à l’aide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont été prélevés et pesés. De plus, les gras péri-gonadaux ont été utilisés pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont été évalués. Comme le gène du (P)RR est situé sur le chromosome X, les mâles étaient des KOs complets et les femelles étaient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport à WT, les différences étant plus prononcées chez les mâles. De plus, les femelles KOs étaient résistantes à l'obésité lorsqu'elles ont été placées sur la diète HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. L’analyse histologique des gras péri-gonadaux des KOs nous ont dévoilés qu’il avait une réduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de près de 3 fois de l'activité ambulatoire a été détectée chez les mâles. De plus, nous avons observé que leurs tibias étaient de longueur réduite ce qui suggère fortement l'affection de leur développement. Les gras péri-gonadaux des souris KO avaient une expression réduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associé avec le diabète de type II chez l'humain. Ainsi, les données recueillies suggèrent fortement que le (P)RR est impliquée dans la régulation du poids corporelle.

Effect of exercise training on preeclampsia superimposed on chronic hypertension in a mouse model

Preeclampsia is among the leading causes of perinatal mortality and morbidity, affecting 2-7% of pregnancies. Its incidence increases to 10-25% in already hypertensive women. To date, no treatment, aside from delivery, is known. Interestingly, several studies have reported that exercise training (ExT) can reduce preeclampsia prevalence although the available studies are considered insufficient. Therefore, the aim of this study is to determine the impact of ExT when practiced before and during gestation on pregnancy outcome in a mouse model of preeclampsia superimposed on chronic hypertension (SPE). To do so, mice overexpressing both human angiotensinogen and renin (R+A+) were used because they are hypertensive at baseline and they develop many hallmark features of SPE. Mice were trained by placing them in a cage with access to a running wheel 4 weeks before and during gestation. ExT in this study prevented the rise in blood pressure at term observed in the sedentary transgenic mothers. This may be realized through an increased activity of the angiotensin-(1-7) axis in the aorta. In addition, ExT prevented the increase in albumin/creatinine ratio. Moreover, placental alterations were prevented with training in transgenic mice, leading to improvements in placental and fetal development. Placental mRNA and circulating levels of sFlt-1 were normalized with training. Additionally, the increase in angiotensin II type I receptor and the decrease in Mas receptor protein were reversed with training. ExT appears to prevent many SPE-like features that develop in this animal model and may be of use in the prevention of preeclampsia in women.

Angiopoietine-like 2 : un facteur circulant pro-oxydant et pro-inflammatoire qui contribue au développement de l’athérosclérose

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs.

A virtual reality approach to the study of visually driven postural control in developing and aging humans

L'être humain utilise trois systèmes sensoriels distincts pour réguler le maintien de la station debout: la somesthésie, le système vestibulaire, et le système visuel. Le rôle de la vision dans la régulation posturale demeure peu connu, notamment sa variabilité en fonction de l'âge, du type développemental, et des atteintes neurologiques. Dans notre travail, la régulation posturale induite visuellement a été évaluée chez des participants au développement et vieillissement normaux âgés de 5-85 ans, chez des individus autistes (développement atypique) âgés de 12-33 ans, ainsi que chez des enfants entre 9-18 ans ayant subi un TCC léger. À cet effet, la réactivité posturale des participants en réponse à un tunnel virtuel entièrement immersif, se mouvant à trois niveaux de vélocité, a été mesurée; des conditions contrôles, où le tunnel était statique ou absent, ont été incluses. Les résultats montrent que la réactivité (i.e. instabilité) posturale induite visuellement est plus élevée chez les jeunes enfants; ensuite, elle s'atténue pour rejoindre des valeurs adultes vers 16-19 ans et augmente de façon linéaire en fonction de l'âge après 45 ans jusqu'à redevenir élevée vers 60 ans. De plus, à la plus haute vélocité du tunnel, les plus jeunes participants autistes ont manifesté significativement moins de réactivité posturale comparativement à leurs contrôles; cette différence n'était pas présente chez des participants plus âgés (16-33 ans). Enfin, les enfants ayant subi un TCC léger, et qui étaient initialement modérément symptomatiques, ont montré un niveau plus élevé d'instabilité posturale induite visuellement que les contrôles, et ce jusqu'à 12 semaines post-trauma malgré le fait que la majorité d'entre eux (89%) n'étaient plus symptomatiques à ce stade. En somme, cela suggère la présence d'une importante période de transition dans la maturation des systèmes sous-tendant l'intégration sensorimotrice impliquée dans le contrôle postural vers l'âge de 16 ans, et d'autres changements sensorimoteurs vers l'âge de 60 ans; cette sur-dépendance visuelle pour la régulation posturale chez les enfants et les aînés pourrait guider l'aménagement d'espaces et l'élaboration d'activités ajustés à l'âge des individus. De plus, le fait que l'hypo-réactivité posturale aux informations visuelles chez les autistes dépende des caractéristiques de l'environnement visuel et de l'âge chronologique, affine notre compréhension des anomalies sensorielles propres à l'autisme. Par ailleurs, le fait que les enfants ayant subi un TCC léger montrent des anomalies posturales jusqu'à 3 mois post-trauma, malgré une diminution significative des symptômes rapportés, pourrait être relié à une altération du traitement de l'information visuelle dynamique et pourrait avoir des implications quant à la gestion clinique des patients aux prises avec un TCC léger, puisque la résolution des symptômes est actuellement le principal critère utilisé pour la prise de décision quant au retour aux activités. Enfin, les résultats obtenus chez une population à développement atypique (autisme) et une population avec atteinte neurologique dite transitoire (TCC léger), contribuent non seulement à une meilleure compréhension des mécanismes d'intégration sensorimotrice sous-tendant le contrôle postural mais pourraient aussi servir comme marqueurs sensibles et spécifiques de dysfonction chez ces populations. Mots-clés : posture, équilibre, vision, développement/vieillissement sensorimoteur, autisme, TCC léger symptomatique, réalité virtuelle.

The specific in vivo role of PPARgamma and its downstream signaling pathway in the pathophysiology of Osteoarthritis

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.

Effect of osteogenesis imperfecta on orthodontic tooth movement in a mouse model

Thesis written in co-mentorship with director: Nelly Huynh; co-directors: Frank Rauch and Jean-Marc Retrouvey; collaborators: Clarice Nishio, Duy-Dat Vu and Nathalie Alos

Angiopoietin like-2: a pro-inflammatory and pro-oxidative protein that contributes to endothelial dysfunction

Le vieillissement vasculaire est caractérisé par une dysfonction de l’endothélium. De nombreux facteurs de risque cardiovasculaire tels que l’obésité et l’hypertension prédisposent l’endothélium à un stress oxydant élevé aboutissant à une dysfonction endothéliale, celle-ci étant communément accompagnée d’une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote. Bien que la fonction endothéliale soit un déterminant majeur de la prédiction du risque cardiovasculaire des patients, son évaluation individuelle reste très limitée. En conséquence, il existe un intérêt scientifique grandissant pour la recherche de meilleurs biomarqueurs. L’Angiopoiétine like-2 (angptl2), une protéine identifiée récemment, joue un rôle pro-inflammatoire et pro-oxydant dans plusieurs désordres causés par une inflammation chronique allant de l’obésité à l’athérosclérose. L’inflammation et un stress oxydant accru ont été établis comme des mécanismes sous-jacents à l’apparition d’une dysfonction endothéliale, c’est pourquoi ce travail met l’accent sur le rôle de l’angptl2 dans la dysfonction endothéliale. Plus précisément, ce travail vise à: 1) déterminer les effets aigus de l’angptl2 sur la fonction endothéliale, 2) caractériser la fonction endothéliale et la contribution des différents facteurs relaxants dérivés de l'endothélium (EDRF) dans plusieurs lits vasculaires, et ce, dans un modèle de souris réprimant l’expression de l’angptl2 (knock-down, KD), et 3) examiner si l'absence d'expression angptl2 protège contre la dysfonction endothéliale induite par un régime riche en graisses (HFD) ou par perfusion d'angiotensine II (angII) chez la souris. Dans la première étude, l’incubation aigue avec de l’angptl2 recombinante induit une dysfonction endothéliale dans les artères fémorales isolées de souris de type sauvage (WT), probablement en raison d’une production accrue d'espèces réactives oxygénées. Les artères fémorales de souris angptl2 KD présentent une meilleure fonction endothéliale en comparaison aux souris WT, vraisemblablement par une plus grande contribution de la prostacycline dans la vasodilatation. Après 3 mois d’une diète HFD, les principaux EDRF respectifs des artères fémorales et mésentériques sont conservés uniquement dans les souris angptl2 KD. Cette préservation est associée à un meilleur profil métabolique, une moindre accumulation de triglycérides dans le foie et des adipocytes de plus petite taille. De plus, l’expression de gènes inflammatoires dans ces tissus adipeux n’est augmentée que chez les souris WT. Dans la seconde étude, l’absence d’angptl2 résulte en une production accrue de monoxyde d’azote dans les artères cérébrales isolées par rapport à celles des souris WT. La perfusion chronique d’angII provoque, seulement chez les souris WT, une dysfonction endothéliale cérébrale probablement par le biais d’une augmentation de la production d’espèces réactives oxygénées, probablement dérivé des NADPH oxydase 1 et 2, ainsi que l'augmentation des facteurs constricteurs dérivés de l’endothélium issus de la cyclo-oxygénase. En revanche, l’apocynine réduit la dilatation cérébrale chez les souris KD traitées à l’angII, ce qui suggère le recrutement potentiel d’une voie de signalisation compensatoire impliquant les NADPH oxydases et qui aurait un effet vaso-dilatateur. Ces études suggèrent fortement que l’angptl2 peut avoir un impact direct sur la fonction endothéliale par ses propriétés pro-inflammatoire et pro-oxydante. Dans une optique d’application à la pratique clinique, les niveaux sanguins d’angptl2 pourraient être un bon indicateur de la fonction endothéliale.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

Changes in cortical and sub-cortical patterns of activity associated with aging during the performance of a lexical set-shifting task

Bien que le passage du temps altère le cerveau, la cognition ne suit pas nécessairement le même destin. En effet, il existe des mécanismes compensatoires qui permettent de préserver la cognition (réserve cognitive) malgré le vieillissement. Les personnes âgées peuvent utiliser de nouveaux circuits neuronaux (compensation neuronale) ou des circuits existants moins susceptibles aux effets du vieillissement (réserve neuronale) pour maintenir un haut niveau de performance cognitive. Toutefois, la façon dont ces mécanismes affectent l’activité corticale et striatale lors de tâches impliquant des changements de règles (set-shifting) et durant le traitement sémantique et phonologique n’a pas été extensivement explorée. Le but de cette thèse est d’explorer comment le vieillissement affecte les patrons d’activité cérébrale dans les processus exécutifs d’une part et dans l’utilisation de règles lexicales d’autre part. Pour cela nous avons utilisé l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) lors de la performance d’une tâche lexicale analogue à celle du Wisconsin. Cette tâche a été fortement liée à de l’activité fronto-stritale lors des changements de règles, ainsi qu’à la mobilisation de régions associées au traitement sémantique et phonologique lors de décisions sémantiques et phonologiques, respectivement. Par conséquent, nous avons comparé l’activité cérébrale de jeunes individus (18 à 35 ans) à celle d’individus âgés (55 à 75 ans) lors de l’exécution de cette tâche. Les deux groupes ont montré l’implication de boucles fronto-striatales associées à la planification et à l’exécution de changements de règle. Toutefois, alors que les jeunes semblaient activer une « boucle cognitive » (cortex préfrontal ventrolatéral, noyau caudé et thalamus) lorsqu’ils se voyaient indiquer qu’un changement de règle était requis, et une « boucle motrice » (cortex postérieur préfrontal et putamen) lorsqu’ils devaient effectuer le changement, les participants âgés montraient une activation des deux boucles lors de l’exécution des changements de règle seulement. Les jeunes adultes tendaient à présenter une augmentation de l’activité du cortex préfrontal ventrolatéral, du gyrus fusiforme, du lobe ventral temporale et du noyau caudé lors des décisions sémantiques, ainsi que de l’activité au niveau de l’aire de Broca postérieur, de la junction temporopariétale et du cortex moteur lors de décisions phonologiques. Les participants âgés ont montré de l’activité au niveau du cortex préfrontal latéral et moteur durant les deux types de décisions lexicales. De plus, lorsque les décisions sémantiques et phonologiques ont été comparées entre elles, les jeunes ont montré des différences significatives au niveau de plusieurs régions cérébrales, mais pas les âgés. En conclusion, notre première étude a montré, lors du set-shifting, un délai de l’activité cérébrale chez les personnes âgées. Cela nous a permis de conceptualiser l’Hypothèse Temporelle de Compensation (troisième manuscrit) qui consiste en l’existence d’un mécanisme compensatoire caractérisé par un délai d’activité cérébrale lié au vieillissement permettant de préserver la cognition au détriment de la vitesse d’exécution. En ce qui concerne les processus langagiers (deuxième étude), les circuits sémantiques et phonologiques semblent se fusionner dans un seul circuit chez les individus âgés, cela représente vraisemblablement des mécanismes de réserve et de compensation neuronales qui permettent de préserver les habilités langagières.

Liquid Chromatography-Electrospray Linear Ion Trap Mass Spectrometry Analysis of Targeted Neuropeptides in Tac1-/- Mouse Spinal Cords Reveal Significant Lower Concentration of Opioid Peptides.

Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. The treatment of pain is very important in medicine and many studies using NK1 receptor antagonists failed to show significant analgesic effects in humans. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. The objectives of this study were to develop a HPLC–MS/MRM assay to quantify targeted peptides in spinal cord tissues. Secondly, we wanted to verify if the Tac1-/- mouse endogenous opioid system is hampered and therefore affect significantly the pain modulatory pathways. Targeted neuropeptides were analyzed by high performance liquid chromatography linear ion trap mass spectrometry. Our results reveal that EM-2, Leu-Enk and Dyn A were down-regulated in Tac1-/- spinal cord tissues. Interestingly, Dyn A was almost 3 fold down-regulated (p < 0.0001). No significant concentration differences were observed in mouse Tac1-/- spinal cords for Met-Enk and CGRP. The analysis of Tac1-/- mouse spinal cords revealed noteworthy decreases of EM-2, Leu-Enk and Dyn A concentrations which strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These observations may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies.