Wet chemical silver treatment of endotracheal tubes to produce antibacterial surfaces.

Mechanically ventilated patients in hospitals are subjected to an increased risk of acquiring nosocomial pneumonia that sometimes has a lethal outcome. One way to minimize the risk could be to make the surfaces on endotracheal tubes antibacterial. In this study, bacterial growth was inhibited or completely prevented by silver ions wet chemically and deposited onto the tube surface. Through the wet chemical treatment developed here, a surface precipitate was formed containing silver chloride and a silver stearate salt. The identity and morphology of the surface precipitate was studied using x-ray photoelectron spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, scanning electron microscopy, and x-ray powder diffraction. Leaching of silver ions into solution was examined, and bacterial growth on the treated surfaces was assayed using Pseudomonas aeruginosa wild type (PAO1) bacteria. Furthermore, the minimum inhibitory concentration of silver ions was determined in liquid- and solid-rich growth medium as 23 and 18 microM, respectively, for P. aeruginosa.

Proteomic analysis of the shistosome tegument and its surface membranes

The tegument surface of the adult schistosome, bounded by a normal plasma membrane overlain by a secreted membranocalyx, holds the key to understanding how schistosomes evade host immune responses. Recent advances in mass spectrometry (MS), and the sequencing of the Schistosoma mansoni transcriptome/genome, have facilitated schistosome proteomics. We detached the tegument from the worm body and enriched its surface membranes by differential extraction, before subjecting the preparation to liquid chromatography-based proteomics to identify its constituents. The most exposed proteins on live worms were labelled with impearmeant biotinylation reagents, and we also developed methods to isolate the membranocalyx for analysis. We identified transporters for sugars, amino acids, inorganic ions and water, which confirm the importance of the tegument plasma membrane in nutrient acquisition and solute balance. Enzymes, including phosphohydrolases, esterases and carbonic anhydrase were located with their catalytic domains external to the plasma membrane, while five tetraspanins, annexin and dysferlin were implicated in membrane architecture. In contrast, few parasite proteins could be assigned to the membranocalyx but mouse immune response proteins, including three immunoglobulins and two complement factors, were detected, plus host membrane proteins such as CD44, integrin and a complement regulatory protein, testifying to the acquisitive properties of the secreted bilayer.

Access of extracellular cations to their binding sites in Na,K-ATPase: role of the second extracellular loop of the alpha subunit.

Na,K-ATPase, the main active transport system for monovalent cations in animal cells, is responsible for maintaining Na(+) and K(+) gradients across the plasma membrane. During its transport cycle it binds three cytoplasmic Na(+) ions and releases them on the extracellular side of the membrane, and then binds two extracellular K(+) ions and releases them into the cytoplasm. The fourth, fifth, and sixth transmembrane helices of the alpha subunit of Na,K-ATPase are known to be involved in Na(+) and K(+) binding sites, but the gating mechanisms that control the access of these ions to their binding sites are not yet fully understood. We have focused on the second extracellular loop linking transmembrane segments 3 and 4 and attempted to determine its role in gating. We replaced 13 residues of this loop in the rat alpha1 subunit, from E314 to G326, by cysteine, and then studied the function of these mutants using electrophysiological techniques. We analyzed the results using a structural model obtained by homology with SERCA, and ab initio calculations for the second extracellular loop. Four mutants were markedly modified by the sulfhydryl reagent MTSET, and we investigated them in detail. The substituted cysteines were more readily accessible to MTSET in the E1 conformation for the Y315C, W317C, and I322C mutants. Mutations or derivatization of the substituted cysteines in the second extracellular loop resulted in major increases in the apparent affinity for extracellular K(+), and this was associated with a reduction in the maximum activity. The changes produced by the E314C mutation were reversed by MTSET treatment. In the W317C and I322C mutants, MTSET also induced a moderate shift of the E1/E2 equilibrium towards the E1(Na) conformation under Na/Na exchange conditions. These findings indicate that the second extracellular loop must be functionally linked to the gating mechanism that controls the access of K(+) to its binding site.

Bacillus subtilis alpha-phosphoglucomutase is required for normal cell morphology and biofilm formation.

Mutations designated gtaC and gtaE that affect alpha-phosphoglucomutase activity required for interconversion of glucose 6-phosphate and alpha-glucose 1-phosphate were mapped to the Bacillus subtilis pgcA (yhxB) gene. Backcrossing of the two mutations into the 168 reference strain was accompanied by impaired alpha-phosphoglucomutase activity in the soluble cell extract fraction, altered colony and cell morphology, and resistance to phages phi29 and rho11. Altered cell morphology, reversible by additional magnesium ions, may be correlated with a deficiency in the membrane glycolipid. The deficiency in biofilm formation in gtaC and gtaE mutants may be attributed to an inability to synthesize UDP-glucose, an important intermediate in a number of cell envelope biosynthetic processes.

Characterization of the tonoplast Ca2+/H+ antiport system from maize roots.

The tonoplast calcium Ca2+/H+ antiport system of maize (Zea mays L. cv LG 11) roots was characterized using the ''pH jump'' technique in order to avoid interference from the tonoplast proton and Ca2+ pumps. Ca2+ uptake was recorded in the presence of different inhibitors and divalent ions. Chemical modification of amino acid residues of the antiport was used to elucidate the amino acid residues participating in the Ca2+ transport activity. The Ca2+/H+ antiport activity was found to be strongly inhibited by ruthenium red and verapamil, whereas diethylstilbestrol was less effective. Vanadate, erythrosin B, cyclopiazonic acid, bafilomycin, thapsigargin, N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) and 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonate (DIDS) were without effect. Lanthanum and divalent ions were strongly inhibitory (Cd2+ > Mn2+ > Sr2+ > Ba2+). While reagents modifying sulfhydryl groups (N-ethylmaleimide and 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoate)) did not affect the antiport activity, modification of trytophan residues (N-bromosuccinimide) was strongly inhibitory. We conclude that ruthenium red, verapamil, lanthanum and divalent cations directly inhibit Ca2+ uptake independent of the function of the proton and Ca2+ pumps. Moreover, the results of chemically modified amino acid residues suggest that sulfhydryl groups are not involved in Ca2+ transport, while tryptophan residues seem important for this translocation.

Construcci�� d'un el��ctrode d'i�� selectiu amb membrana de PVC i marro de caf�� com a ion��for

Els el��ctrodes s��n instruments d���an��lisi molt emprats per la seva gran efici��ncia, f��cil utilitzaci��, de resposta ���in situ��� i que ocupen poc espai. Tot i aix��, existeix una problem��tica actual dels el��ctrodes, que ��s la no comercialitzaci�� d���el��ctrodes per tots els metalls que trobem dissolts en solucions d���inter��s anal��tic. Per aquest motiu s���estudien possibles subst��ncies dins la formaci�� de la membrana dels el��ctrodes, ion��fors, que reaccionin amb esp��cies i��niques amb inexist��ncia d���el��ctrodes comercials. S���han dut a terme estudis amb residus vegetals com a ion��fors. Algunes dels biomaterials estudiats s��n la rapa i la iohimbe per a la detecci�� del Cr(VI) i l���Hg(II). Aquestes han sigut les motivacions que han dut a construir un el��ctrode de i�� selectiu amb membrana de PVC i marro de caf�� com a ion��for, i seguidament avaluar-ne laseva resposta

Precursor ion scans for the targeted detection of stable-isotope-labeled peptides.

Stable isotope labels are routinely introduced into proteomes for quantification purposes. Full labeling of cells in varying biological states, followed by sample mixing, fractionation and intensive data acquisition, is used to obtain accurate large-scale quantification of total protein levels. However, biological processes often affect only a small group of proteins for a short time, resulting in changes that are difficult to detect against the total proteome background. An alternative approach could be the targeted analysis of the proteins synthesized in response to a given biological stimulus. Such proteins can be pulse-labeled with a stable isotope by metabolic incorporation of 'heavy' amino acids. In this study we investigated the specific detection and identification of labeled proteins using acquisition methods based on Precursor Ion Scans (PIS) on a triple-quadrupole ion trap mass spectrometer. PIS-based methods were set to detect unique immonium ions originating from labeled peptides. Different labels and methods were tested in standard mixtures to optimize performance. We showed that, in comparison with an untargeted analysis on the same instrument, the approach allowed a several-fold increase in the specificity of detection of labeled proteins over unlabeled ones. The technique was applied to the identification of proteins secreted by human cells into growth media containing bovine serum proteins, allowing the preferential detection of labeled cellular proteins over unlabeled bovine ones. However, compared with untargeted acquisitions on two different instruments, the PIS-based strategy showed some limitations in sensitivity. We discuss possible perspectives of the technique.

S��ntesis intermatricial y comparaci��n de nanopart��culas met��licas de Pd y Co soportadas en resinas cati��nicas y ani��nicas

Esta memoria de investigaci��n es producto del trabajo experimental que se realiz�� con resinas de intercambio i��nico para la s��ntesis intermatricial de nanopart��culas met��licas de Co y Pd. Los estudios que se realizaron correspondieron a la iniciaci��n en esta modalidad de s��ntesis de nanopart��culas. En ellos se contemplaron las propiedades intr��nsecas de la resina como: la capacidad de intercambio i��nico, y funcionalidad qu��mica, tanto antes como despu��s de la s��ntesis. Uno de los objetivos es que la resina no pierda ninguna de sus propiedades originales, sino que gane m��s versatilidad. La importancia que tienen en la actualidad los materiales nanom��tricos inspira a su modificaci��n y nuevas formas de producci��n. Con esta investigaci��n se inicia el trabajo de cara a los estudios doctorales. Aqu�� se estudia la aplicaci��n de las nanopart��culas de paladio y cobalto soportadas en resinas de intercambio i��nico. Las nanopart��culas de paladio tienen aplicaci��n en el ��rea de cat��lisis, y en su s��ntesis intermatricial, se consigue un catalizador heterog��neo, que brinda gran facilidad de recuperarlo y proceder con varios ciclos catal��ticos. As�� mismo, con el cobalto se pretendi�� otorgar propiedades ferromagn��ticas, de manera que el proceso de separaci��n de la resina de los medios de reacci��n, sea tan f��cil como la aplicaci��n de un campo magn��tico o pasar un im��n sobre el lugar en cuesti��n.

Stool sample storage conditions for the preservation of Giardia intestinalis DNA

Stool is chemically complex and the extraction of DNA from stool samples is extremely difficult. Haemoglobin breakdown products, such as bilirubin, bile acids and mineral ions, that are present in the stool samples, can inhibit DNA amplification and cause molecular assays to produce false-negative results. Therefore, stool storage conditions are highly important for the diagnosis of intestinal parasites and other microorganisms through molecular approaches. In the current study, stool samples that were positive for Giardia intestinalis were collected from five different patients. Each sample was stored using one out of six different storage conditions [room temperature (RT), +4��C, -20��C, 70% alcohol, 10% formaldehyde or 2.5% potassium dichromate] for DNA extraction procedures at one, two, three and four weeks. A modified QIAamp Stool Mini Kit procedure was used to isolate the DNA from stored samples. After DNA isolation, polymerase chain reaction (PCR) amplification was performed using primers that target the β-giardin gene. A G. intestinalis-specific 384 bp band was obtained from all of the cyst-containing stool samples that were stored at RT, +4��C and -20��C and in 70% alcohol and 2.5% potassium dichromate; however, this band was not produced by samples that had been stored in 10% formaldehyde. Moreover, for the stool samples containing trophozoites, the same G. intestinalis-specific band was only obtained from the samples that were stored in 2.5% potassium dichromate for up to one month. As a result, it appears evident that the most suitable storage condition for stool samples to permit the isolation of G. intestinalis DNA is in 2.5% potassium dichromate; under these conditions, stool samples may be stored for one month.

Molecular basis of interaction between Na,K-ATPase and FXYD proteins.

R��sum�� au large public Notre corps est constitu�� de diff��rents types de cellules. La condition minimale ou primordiale pour la survie des cellules est d'avoir de l'��nergie. Cette t��che est assum��e en partie par une prot��ine qui se situe dans la membrane de chaque cellule. Nomm�� Na, K��ATPase ou pompe �� sodium, c'est une prot��ine pressente dans toutes les cellules chez les mammif��res est compos��e de deux sous-unit��s, α et β. En transportant 3 ions de sodium hors de la cellule et 2 ions de potassium �� l'int��rieur de la cellule, elle transforme l'��nergie chimique sous forme de l'ATP en ��nergie motrice, qui permet aux cellules par la suite d'��changer des mat��riaux entre l'espace intracellulaire et extracellulaire ainsi que d'ing��rer des nutriments provenant de son environnement. Le manque de cette prot��ine chez la souris entra��ne la mort de l'embryon. Des d��fauts fonctionnels de cette prot��ine sont responsables de plusieurs maladies humaines comme par exemple, un type de migraine. En dehors de sa fonction vitale, cette prot��ine est ��galement engag��e dans diverses activit��s physiologiques comme la contractilit�� musculaire, l'activit�� nerveuse et la r��gulation du volume sanguin. Vue l'importance de cette prot��ine, sa d��couverte par Jens C. Skou en 1957 a ��t�� honor��e d'un Prix Noble de chimie quarante ans plus tard. Depuis lors, nous connaissons de mieux en mieux les m��canismes de fonctionnement de la Na, K-ATPase. Entre autre, sa r��gulation par une famille de prot��ines appel��es prot��ines FXYD. Cette famille contient 7 membres (FXYD 1-7). L'un d'entre eux nomm�� FXYD 2 est li�� �� une maladie h��r��ditaire connue sous le nom de hypomagnesemia. Nous disposons actuellement d'informations concernant les cons��quences de la r��gulation par les prot��ines FXYD sur activit�� de la Na, K-ATPase, mais nous savons tr��s peu sur le mode d'interaction entre les prot��ines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans ce travail de th��se, nous avons r��ussi �� localiser des zones d'interaction dans la sous- unit�� a de la Na, K-ATPase et dans FXYD 7. En m��me temps, nous avons d��termin�� un 3��me site de liaison sp��cifique au sodium de la Na, K-ATPase. Une partie de ce site se situe �� l'int��rieur d'un domaine prot��ique qui interagit avec les prot��ines FXYD. De plus, ce site a ��t�� d��montr�� comme responsable d'un m��canisme de transport de la Na, K-ATPase caract��ris�� par un influx ionique. En conclusion, les r��sultats de ce travail de th��se fournissent de nouvelles preuves sur les r��gions d'interaction entre la Na, K-ATPase et les prot��ines FXYD. La d��termination d'un 3��me site sp��cifique au sodium et sa relation avec un influx ionique offrent la possibilit�� 1) d'explorer les m��canismes avec lesquels les prot��ines FXYD r��gulent l'activit�� de la Na, ATPase et 2) de localiser un site �� sodium qui est essentielle pour mieux comprendre l'organisation et le fonctionnement de la Na, K-ATPase. R��sum�� Les gradients de concentration de Na+ et de K+ �� travers la membrane plasmatique des cellules animales sont cruciaux pour la survie et l'hom��ostasie de cellules. De plus, des fonctions cellulaires sp��cifiques telles que la reabsorption de Na dans le rein et le c��lon, la contraction musculaire et l'excitabilit�� nerveuse d��pendent de ces gradients. La Na, K��ATPase ou pompe �� sodium est une prot��ine membranaire ubiquitaire. Elle cr��e et maintient ces gradients en utilisant l'��nergie obtenu par l'hydrolyse de l'ad��nosine triphosphate. L'unit�� fonctionnelle minimale de cette prot��ine se compose d'une sous-unit�� catalytique α et d'une sous-unit�� r��gulatrice β. R��cemment, il a ��t�� montr�� que des membres de la famille FXYD, sont des r��gulateurs tissu-sp��cifiques de la Na, K-ATPase qui influencent ses propri��t��s de transport. Cependant, on conna��t peu de chose au sujet de la nature mol��culaire de l'interaction entre les prot��ines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans cette ��tude, nous fournissons, pour la premi��re fois, l'��vidence directe que des r��sidus du domaine transmembranaire (TM) 9 de la sous-unit�� α de la Na, K-ATPase sont impliqu��s dans l'interaction fonctionnelle et structurale avec les prot��ines FXYD. De plus nous avons identifi�� des r��gions dans le domaine transmembranaire de FXYD 7 qui sont importantes pour l'association stable avec la Na, K-ATPase et une s��rie de r��sidus responsables des r��gulations fonctionnelles. Nous avons aussi montr�� les contributions fonctionnelles du TM 9 de la Na, K-ATPase �� la translocation de Na + en d��terminant un 3��me site sp��cifique au Na+. Ce site se situe probablement dans un espace entre TM 9, TM 6 et TM 5 de la sous-unit�� α de la pompe �� sodium. De plus, nous avons constat�� que le 3��me site de Na + est fonctionnellement li�� �� un courant entrant de la pompe sensible �� l'ouaba��ne et activ�� par le pH acide. En conclusion, ce travail donne de nouvelles perspectives de l'interaction structurale et fonctionnelle entre les prot��ines FXYD et la Na, K-ATPase. En outre, les contributions fonctionnelles de TM 9 offrent de nouvelles possibilit��s pour explorer le m��canisme par lequel les prot��ines FXYD r��gulent les propri��t��s fonctionnelles de la Na, K-ATPase. La d��termination du 3��me site au Na + fournit une compr��hension avanc��e du site sp��cifique au Na + de la Na, K-ATPase et du m��canisme de transport de la Na, K-ATPase. Summary The Na+ and K+ gradients across the plasma membrane of animal cells are crucial for cell survival and homeostasis. Moreover, specific tissue functions such as Na+ reabsorption in kidney and colon, muscle contraction and nerve excitability depend on the maintenance of these gradients. Na, K-ATPase or sodium pump, an ubiquitous membrane protein, creates and maintains these gradients by using the energy from the hydrolysis of ATP. The minimal functional unit of this protein is composed of a catalytic α subunit and a regulatory β subunit. Recently, members of the FXYD family, have been reported to be tissue-specific regulators of Na, K-ATPase by influencing its transport properties. However, little is known about the molecular nature of the interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. In this study, we provide, for the first time, direct evidence that residues from the transmembrane (TM) domain 9 of the α subunit of Na, K-ATPase are implicated in the functional and structural interaction with FXYD proteins. Moreover, we have identified regions in the TM domain of FXYD 7 important for the stable association with Na, K-ATPase and a stretch of residues responsible for the functional regulations. We have further revealed the functional contributions of TM 9 of the Na, K-ATPase α subunit to the Na+ translocation by determining a 3rd Na+-specific cation binding site. This site is likely in a space between TM 9, TM 6 and TM 5 of the a subunit of the sodium pump. Moreover, we have found that the 3rd Na+ binding site is functionally linked to an acidic pH- activated ouabain-sensitive inward pump current. In conclusion, this work gives new insights into the structural and functional interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. Functional contributions of TM 9 offer new possibilities to explore the mechanism by which FXYD proteins regulate functional properties of Na, K-ATPase. The determination of the 3rd Na+ binding site provides an advanced understanding concerning the Na+ -specific binding site of Na, K-ATPase and the 3rd Na+ site related transport mechanism.

Acid-sensing ion channels : modulation by serine-proteases and involvement in acid-induced action potential generation in hippocampal neurons

SUMMARY Acid-sensing ion channels (ASICs) are non-voltage gated sodium channels. They are activated by rapid extracellular acidification and generate an inactivating inward current. Four ASIC genes have been cloned: ASIC1, 2, 3 and 4, with variants a and b for ASIC1and AS1C2. ASICs are expressed in neurons of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS). In the CNS, ASICs have a role in learning, memory, as well as in neuronal death in ischemia. In the PNS, ASICs are involved in the perception of acid-induced pain, as well as in mechanoperception. In one part of my thesis project, we addressed the question of the mechanism of regulation of ASIC1 a by the serine protease trypsin at the molecular level. Trypsin modifies the function of ASIC1 a but not of ASIC1b. In order to identify the channel region responsible for this effect, we created chimeras between ASIC1 a and 1b. Subsequently, to identify the exact trypsin target(s), we mutated predicted trypsin sites in the region identified by the chimera. In the second part of a project, we investigated the role of ASICs at the cellular level, in neuronal signaling. Using the whole-cell patch clamp in hippocampal neuronal culture, we studied the potential involvement of ASICs in action potential (AP) generation. In the first part of the thesis work, we showed that trypsin modifies ASIC1a function: it shifts the pH activation and the steady-state inactivation curve towards more acidic values and accelerates the time course of the channel recovery from inactivation. We also showed that trypsin cleaves ASIC1a and that the functional effect and a channel cleavage correlate. In the inactivated state, channels cannot be modified by trypsin. Cleavage occurs in a channel region that is also important for inactivation of all ASICs; a part of this region is critical for the inhibition of ASIC1 a by the spider toxin Psalmotoxin1. In the second part of the thesis work, we showed that ASIC activity can modulate AP generation. ASIC activity by itself can induce trains of APs. In situations in which this activity by itself is not sufficient to induce APs, it can contribute to AP generation. During high neuronal activity, ASIC activity can block already existing trains of APs. In conclusion, depending on the activity of neuron in a particular moment, ASICs can differently modulate AP generation; they can induce, facilitate or inhibit APs. We also showed that trypsin changes the capability of ASICs to modulate AP generation by shifting the pH dependence to more acidic values, which adapts channel gating to pH conditions which may occur in pathological conditions such as ischemia. Our finding that trypsin modifies ASIC1 a function identifies a novel pharmacological tool, and proposes a mechanism of ASIC1a regulation that may have a physiological importance. The identification of the exact site of trypsin action gives insight to the molecular mechanisms of ASIC regulation. This work proposes a role in modulation of AP generation for ASICs in the CNS. RESUME Les canaux ASIC sont les canaux ioniques activ��s par l'acidification rapide extracellulaire. Activ��s, ils g��n��rent un courant entrant qui inactive en pr��sence de stimulus acide. Quatre g��nes ASIC ont ��t�� clon��s, ASIC1, 2, 3 et 4, avec les variants a et b pour ASIC1 et 2. Les ASICs sont exprim��s dans les neurones du syst��me nerveux central (SNC) et p��riph��rique (SNP). Dans le SNC, les ASIC ont un r��le dans le m��moire, apprentissage et la mort neuronale dans t'isch��mie. Dans le SNP, ils ont un r��le dans la perception de la douleur et m��chanosensation. Dans une partie de mon projet de th��se, nous avons ��tudi�� les m��canismes de la r��gulation d'ASIC1a par la s��rine-prot��ase trypsine au niveau mol��culaire. La trypsine modifie la fonction d'ASIC1a et pas ASIC1b. Nous avons cr���� les chim��res entre ASIC1 a et 1 b, afin d'identifier la r��gion du canal responsable pour l'effet. Pour identifier le(s) site(s) exactes de l'action de la trypsine, nous avons mut�� les sites potentiels de la trypsine dans la r��gion identifi��e par les chim��res. Dans la deuxi��me partie du projet, nous avons ��tudi�� le r��le des ASICs au niveau cellulaire. En utilisant la technique du patch clamp dans les cultures des neurones de l'hippocampe, nous avons ��tudi�� l'implication des ASICs dans la g��n��ration des potentiels d'action (PA). Nous avons montr�� que la trypsine agit sur le canal ASIC1a ; elle d��cale l'activation et �� steady-state �� inactivation vers les valeurs plus acides, et elle raccourcit le temps du �� recovery �� du canal. La trypsine coupe ASIC1a sur le r��sidu K145 et l'effet fonctionnel et la coupure corr��lent. Nous avons identifi�� la r��gion du canal responsable pour l'inactivation de tous les ASICs ; une partie de cette r��gion est responsable pour ['inhibition d'ASIC1 a par la Psalmotoxinel . Nous avons montr�� que les ASICs peuvent moduler la g��n��ration des PAs. L'activit�� des ASICs peut induire les trains des PAs. Quand l'activit�� des ASICs n'est pas suffisante pour induire le PA, elle peut contribuer �� sa g��n��ration. Pendant l'activit�� neuronale forte, l'activit�� des ASICs peut bloquer les trains des PAs qui existent d��j��. En conclusion, d��pendant de l'activit�� neuronale, les ASICs peuvent moduler la g��n��ration des PAs diff��remment ; ils peuvent induire, faciliter ou inhiber les PAs. La trypsine change la capacit�� des ASICs de moduler les PAs. Apr��s l'action de la trypsine, les ASICs peuvent moduler la g��n��ration des PAs dans les conditions l��g��rement acides, suivies par les fluctuations du pH acide, qui peuvent exister dans l'isch��mie. Le fait que la trypsine agit sur ASIC1a d��finit l'outil pharmacologique et propose le m��canisme de la r��gulation d'ASICI a qui pourrait avoir l'importance physiologique. L'identification du site de l'action de la trypsine ��claircit les m��canismes mol��culaires de la r��gulation des ASICs. Cette ��tude propose un r��le des ASICs dans la modulation de la g��n��ration des PAs. R��sum�� pour le public large Les neurones sont les cellules de syst��me nerveux dont la fonction est la signalisation. Comme toutes les autres cellules, les neurones ont une membrane qui s��pare l'int��rieur du milieu ext��rieur. Cette membrane est imperm��able pour des particules charg��es (ions). Dans cette membrane existent les prot��ines sp��cifiques, �� canaux ��, qui permettent le transport des ions d'un c��t�� de la membrane �� l'autre, comme r��ponse aux stimuli diff��rents. Ce transport des ions �� travers la membrane g��n��re un courant, qu'on peut mesurer. Ce courant est la base de la communication entre les neurones, ou, ce qu'on appelle la signalisation neuronale. Quand ce courant est suffisamment grand, il permet la g��n��ration du potentiel d'action, qui est le message principal de communication neuronale. Les canaux ASIC (acid-sensing ion channel), que nous ��tudions dans le laboratoire, sont activ��s par les acides. Les acides sont rel��ch��s dans beaucoup de situations dans le syst��me nerveux. Les ASIC ont ��t�� d��couverts r��cemment (en 1996), et nous ne connaissons pas encore tr��s bien toutes les fonctions de ces canaux. Nous savons qu'ils ont un r��le dans le m��moire, apprentissage, la sensation de la douleur et l'infarctus c��r��bral. Dans la premi��re partie de ce projet de th��se, nous avons voulu mieux comprendre comment fonctionnent ces canaux. Pour faire ��a, nous avons ��tudi�� la r��gulation des ASICs par une prot��ine, trypsine, qui coupe le canal ASIC. Nous avons ��tudi�� ou exactement la trypsine coupe le canal et quels effets ��a produit sur la fonction du canal. Dans la deuxi��me partie du projet de th��se, nous avons voulu mieux conna��tre comment le canal fonctionne au niveau de la cellule, comment il interagit avec les autres canaux et si il a un r��le dans la g��n��ration des potentiels d'action. Nous avons pu montrer que la trypsine change la fonction du canal, ce qui lui permet de fonctionner diff��remment. Nous avons aussi d��termin�� ou exactement ta trypsine coupe le canal. Au niveau de la cellule, nous avons montr�� que les ASIC peuvent moduler la g��n��ration des potentiels d'action, ��tant, d��pendant de l'activit�� du neurone, soit activateurs, soit inhibiteurs. La trypsine est une mol��cule qui peut ��tre lib��r��e dans le syst��me nerveux pendant certaines conditions, comme l'infarctus c��r��bral. A cause de ��a, les connaissances que la trypsine agit sur le anal ASIC pourraient ��tre important physiologiquement. La connaissance de l'endroit exacte ou la trypsine coupe le canal nous aide �� mieux comprendre la relation structure-fonction du canal. La modulation de la g��n��ration des potentiels d'actions par les ASIC indique que ces canaux peuvent avoir un r��le important dans la signalisation neuronale.

Nanopart��cul��les core-shell estabilitzades en pol��mer amb propietats cal��tiques i bactericides medioambientalment segure

Aquest projecte de doctorat ��s un treball interdisciplinari adre��at a l���obtenci�� de nous nanocomp��sits (NCs) funcionals sintetitzats a partir de materials polim��rics bescanviadors d���ions que s��n modificats amb nanopart��cules met��l���liques (NPMs) de diferent composici��. Els materials desenvolupats s���avaluen en funci�� de dues possibles aplicacions: 1) com a catalitzadors de reaccions org��niques d���inter��s actual (NCs basats en pal���ladi) i, 2) la seva dedicaci�� a aplicacions bactericides en el tractament d���aig��es dom��stiques o industrials (NCs basats en plata). El desenvolupament de nanomaterials ��s de gran inter��s a l���actualitat donades les seves especials propietats, l���aprofitament de les quals ��s la for��a impulsora per a la fabricaci�� de nous NCs. Les nanopart��cules met��l���liques estabilitzades en pol��mer (Polymer Stabilized Metal Nanoparticles, PSNPM) s���han preparat mitjan��ant la t��cnica in-situ de s��ntesi intermatricial (Inter-matrix synthesis, IMS) que consisteix en la c��rrega seq��encial dels grups funcionals de les matrius polim��riques amb ions met��l���lics, i la seva posterior reducci�� qu��mica dins de la matriu polim��rica de bescanvi i��nic. L���estabilitzaci�� en matrius polim��riques evita l���agregaci�� entre elles (self-aggreagtion), un dels principals problemes coneguts de les NPs. Pel desenvolupament d���aquesta metodologia, s���han emprat diferents tipus de matrius polim��riques de bescanvi i��nic: membrana Sulfonated PolyEtherEtherKetone, SPEEK, aix�� com fibres sint��tiques basades en polypropil�� amb diferents tipus de grups funcionals, que ens permeten el seu ��s com a filtres en la desinfecci�� de solucions aquoses o com a material catalitzador. Durant el projecte s���ha anat avan��ant en l���optimitzaci�� del material nanocomposite final per a les aplicacions d���inter��s, en quant activitat i funcionalitat de les nanopart��cules i estabilitat del nanocomposite. Aix��, s���ha optimitzat la s��ntesi de NPs estabilitzades en resines de bescanvi i��nic, realitzant un screening de diferents tipus de resines i la seva avaluaci�� en aplicacions industrials d���inter��s.

Function and regulation of the scaffold protein IB1/JIP-1 in the uro-genital tract.

RESUME Ce m��moire de th��se traite de l'��tude de la �� scaffold ��prot��ine ou prot��ine ����chafaud��, �� Islet-Brain1/ JNK Interacting Protein 1 �� (IB1/JIP-1) dans la vessie et la prostate, deux organes importants de l'appareil uro-genital. Cette prot��ine, mise en ��vidence dans notre laboratoire �� la fin des ann��e 90, a ��t�� reconnue pour r��guler la voie de signalisation des �� Mitogen-Activated Protein Kinases �� (MAPKs), et en particulier de la MAPK appel��e c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Le r��seau de voie de signalisation permet aux cellules de percevoir les changements dans le milieu extracellulaire et de permettre une r��ponse appropri��e �� ces diff��rents stimuli. La connaissance des voies de signalisation a permis de mettre en ��vidence leur r��le crucial tant dans l'hom��ostase des tissus sains que dans des processus pathologiques comme l'oncogen��se. Parmi une vingtaine de voie de signalisation, la voie de signalisation des ��MAPKinases �� est une des plus importantes et a ��t�� montr��e pour participer �� diverses fonctions cellulaires telles que la diff��rentiation, la motilit��, la division et la mort cellulaire. La voie de signalisation des �� MAPKinases �� est typiquement constitu��e d'un module de trois kinases qui s'activent s��quentiellement par phosphorylation. On note la pr��sence d'une MAPK, d'un activateur de MAPK et d'un activateur de l'activateur de MAPK. Une fois la MAPK activ��e, elle permettra la r��gulation de diff��rentes cibles dont certain facteur de transcription. Chez les mammif��res, il existe 3 grands groupes de MAPKs : the extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK 1/2) cascade, qui r��gule pr��f��rentiellement la croissance et la diff��rentiation cellulaire, ainsi que les cascades JNK et p38 qui r��gulent pr��f��rentiellement la r��ponse �� diff��rents stress cellulaires telle que l'inflammation ou l'apoptose. JNK est activ�� par diff��rents stress cellulaire telle que les cytokines inflammatoires. JNK est ��galement requis au cours du d��veloppement embryonnaire et contribue �� la mort (apoptose) ou �� la prolif��ration cellulaire. Plusieurs ��tudes ont mis en ��vidence le r��le de JNK durant le processus tumoral, sans que son r��le soit clairement identifi��. JNK pourrait avoir des fonctions diff��rentes durant l'initiation puis de la progression tumorale. Chez les mammif��res, les voies de signalisation intracellulaires forment un r��seau complexe et elles interagissent entre elles, ce qui permet aux cellules une r��ponse ad��quate aux multitudes de stimuli existants dans les organismes pluricellulaires. Parmi plusieurs m��canismes de r��gulation, les prot��ines dites �� scaffold �� ou ����chafaud �� jouent un r��le crucial dans l'hom��ostase de la voie de signalisation des ��MAPKinase ��. L'introduction revoit bri��vement ces diff��rents aspects, de la voie de signalisation des ��MAPKinase et des connaissance sur IB1/JIP-1. Les premi��res ��tudes effectu��es sur IB1/JIP-1 ont montr�� une expression relativement sp��cifique de cette prot��ine dans certains types de neurones ainsi que dans la cellule beta-s��cr��trice d'insuline. IB1/JIP-1 r��gule la voie de signalisation JNK par interaction avec les diff��rents composants du module, modifiant ainsi le spectre de substrats activ��s par JNK. La fonction pr��cise de IB1/JIP-1 n'��tait pas encore ��lucid��e, mais plusieurs travaux mettaient en lumi��re un r��le dans la r��gulation, et la sous-location cellulaire des composants de la voie de signalisation JNK, ainsi que dans la survie cellulaire �� certain stress. Cette expression relativement sp��cifique est intrigante car elle sugg��re que sa pr��sence serait n��cessaire �� une r��gulation sp��cifique de la MAPKinase JNK ou �� certaines autres fonctions cellulaires ��galement sp��cifiques de certains tissus. Le premier but de ce travail a consist�� �� mettre en ��vidence l'expression de IB1/JIP-1 dans l'appareil uro-g��nital et plus particuli��rement dans la vessie et la prostate. Nos r��sultats ont montr�� que IB1/JIP-1 est sp��cifiquement exprim�� au niveau de l'uroth��lium v��sical, mais pas dans le muscle lisse. Il en est de m��me au niveau de la prostate o�� IB1/JIP-1 est exprim�� sp��cifiquement au niveau de l'��pith��lium s��cr��toire et absent au niveau du stroma fibro-musculaire. La vessie et la prostate sont des organes ou l'activit�� JNK pourrait ��tre crucial tant dans l' homeostase tissulaire que dans le d��veloppement de pathologies b��nignes ou malignes. La vessie et la prostate sont le si��ge fr��quent de tumeur. La base pour le d��veloppement du cancer est complexe et implique plusieurs anomalies g��n��tiques. Ce processus complexe li�� au d��veloppement tumoral est encore loin d`��tre compl��tement ��lucid��, raison pour laquelle il est crucial de poursuivre l'��tude des diff��rents g��nes pouvant ��tre impliqu�� dans ces processus ou pouvant ��tre utilis�� comme outil th��rapeutique. Dans l'urothelium de la vessie, la fonction de la MAPK JNK n'a ��t�� que tr��s peu ��tudi��e. Il existe quelques ��tudes, in vitro, sugg��rant une implication possible de cette voie de signalisation dans des processus telle que le d��veloppement ou la progression tumorale. Le chapitre 1 d��crit une ��tude in vivo dans la vessie un mod��le de stress m��canique, connu pour activer les MAPKinase. La dilatation v��sicale, due �� une obstruction ur��trale, a mis en ��vidence une diminution de l'expression de IB1/JIP-1 ainsi qu'une activation de la MAPKinase JNK. Dans ce mod��le, la r��gulation de IB1/JIP-1, par l'interm��diaire d'un vecteur viral, a permis de d��montrer que IB1/JIP-1 r��gulait l'activit�� de JNK dans ce tissu. Pour poursuivre l'��tude de cette fonction d' IB1/JIP-1 dans l'uroth��lium, nous avons investigu�� l'activit�� JNK dans des souris g��n��tiquement modifi��es et porteuse d'une d��l��tion de 1 des 2 all��les du g��ne codant pour IB1/JIP-1, avec un contenu en IB1/JIP-1 diminu�� de moiti��. L'activation de JNK est ��galement augment��e dans l'urothelium au repos de ces souris, ce qui confirme la fonction r��gulatrice de JNK par IB1/JIP-1. Ces r��sultats ont permis de mettre en ��vidence un r��le critique de celle-ci dans l'hom��ostase de I`urothelium et sugg��re une nouvelle cible pour r��guler la voie de signalisation dans ce tissu. En outre, la modulation des niveaux d'expression d'IB1/JIP-1 dans la vessie, in vivo, par l'interm��diaire de vecteurs viraux s'est r��v��l��e r��alisable et indique un moyen ��l��gant pour d��velopper une th��rapie g��nique dans cet organe. Un autre ��l��ment de ce travail de th��se, r��v��l��e au chapitre 2, a ��t�� d'��tudier la r��gulation dans la vessie de rat de la communication intercellulaire de type �� GAP ��. Les cellules adjacentes partagent des ions, messagers secondaires et des petits m��tabolites par l'interm��diaire de canaux intercellulaire qui forment les jonctions de type �� GAP ��. Ce type de communications intercellulaire permet une activit�� cellulaire coordonn��e, une caract��ristique importante pour l'hom��ostase des organismes multicellulaire. Ce type de communication intercellulaire est form�� de 2 demi-canaux appel��s connexons. Chaque connexon est form�� de six prot��ines appel��es connexins (Cx). Il existe environ vingt connexines diff��rentes nomm��es par leur poids mol��culaire respectif. Les jonctions de type canaux "GAP" permettent aux cellules de communiquer avec les cellules voisines au quelles elles sont m��caniquement ou ��lectriquement coupl��es. La vessie peut ��tre particuli��rement d��pendante de la communication intercellulaire par les canaux �� Gap �� qui permettrait de coordonner la r��ponse de la musculature ainsi que de l'uroth��lium �� l'augmentation de la pression transmurale du �� l'accumulation d'urine, situation fr��quemment observ��e dans le cadre de l'hyperplasie b��nigne de la prostate. Dans la vessie de rat, la connexine26 est exprim��e uniquement dans l'urothelium. La Cx26, a ��t�� montr��e pour ��tre un possible �� tumor suppressor gene �� dans le cancer de vessie. Une augmentation de la Cx26 ainsi que du couplage des cellules uroth��liales a ��t�� d��montr�� dans notre mod��le de stress m��canique sur la vessie de rat et est d��pendante de 2 ��l��ments de r��ponses connues pour interagir avec AP-1. La r��gulation de IB1/JIP-1 a permis de montrer que celle-ci r��gulait l'activit�� JNK, ainsi que l'activit�� du facteur de transcription AP-1, compos�� de c-Jun lui-m��me cible de JNK. Cette r��duction de l'activit�� de AP-1 est associ��e �� une diminution de l'expression du transcipt de la Cx26. En r��sum��, la Cx26 pourrait ��tre r��gul��e par le complexe AP-1 lui-m��me d��pendant du contenu en IB1/JIP-1. Dans le chapitre 3, l'��tude de IB1/J1P-1 s'est port��e sur la prostate. Cet organe, si��ge fr��quent de pathologie telle que le cancer ou l'hyperplasie b��nigne de la prostate, exprime IB1/JIP-1 au niveau de son ��pith��lium s��cr��toire. Cette expression est maintenue dans une lign��e cellulaire humaine largement ��tudi��e est reconnue comme un mod��le ad��quat de cellules tumorales de type androg��ne-sensible. IB1/JIP-1 a ��t�� investigu�� dans un mod��le in vitro d'apoptose en r��ponse �� un agent appel�� N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) qui induit une activation de la MAPK JNK ainsi que ��galement un diminution du contenu en IB1/JIP-1. La surexpression de IB1/JIP-1 en utilisant �� nouveau des virus comme vecteur a d��montr�� que IB1/JIP-1 ��tait capable de r��guler l'activit�� de JNK ainsi que les taux d'apoptose. Dans le cancer de la prostate, certains travaux ont montr�� que la diff��rentiation neuroendocrine des cellules tumorales est associ��e �� la progression tumorale et �� la perte de sensibilit�� aux androg��nes. Ce travail a permis de d��voiler l'augmentation d'expression de IB1/JIP-1 dans un mod��le de neurodifferentiation des cellules d'une lign��e prostatique humaine (LNCaP). Les m��canismes qui permettent une expression sp��cifique de IB1/JIP-1 ont ��t�� partiellement investigu��e dans notre laboratoire. Son promoteur humain contient un �� Neuron Restricive Silencer Element �� (NRSE) connu pour se lier a r��presseur transcriptionel appel�� �� RE-1 Silencer Transcription Factor �� ou �� Neuron Restrictive Silencer Factor �� (REST/NRSF). NRSF/REST est capable de r��primer l'expression de g��nes neuronaux en dehors du syst��me neuronal. Il prend part �� la diff��rentiation terminale des g��nes neuronaux. Dans le chapitre 3, on observe que l'activit�� de REST/NRSF est diminu��e dans les cellules LNCaP qui se transdifferencient de mani��re neuroendocrine, et que REST/NRSF est capable de moduler l'expression de ces g��nes cibles dans ce type cellulaire. Ces travaux laissent sugg��rer que NRSF/REST participe �� l'acquisition du ph��notype neuroendocrinien et pourrait ��tre une cible pour r��guler ce ph��nom��ne. En conclusion, ce travail de th��se pr��sente l'expression de IB1/JIP-1 dans 2 organes de l'appareil uro-g��nital ; la vessie et la prostate. La fonction de IB1/JIP-1 a ��t�� ��tudi��e in vivo dans la vessie de rat, ce qui a mis en ��vidence sa fonction r��gulatrice de l'activit�� de la MAPKinase JNK, et de l'activit�� du facteur de transcription AP-1 ; ainsi que sa possible implication r��gulatrice de g��ne cible tel que la Connexin 26 (Cx26). AP-1 et la Cx26 pourraient jouer un r��le dans le processus oncologique, tant dans le control de l'invasion cellulaire ou le control de la croissance cellulaire. Dans la prostate, IB1/JIP-1 r��gule ��galement l'activit�� JNK; crucial dans la transmission de certains stimulis pro-apoptotiques. Dans un mod��le de transdiff��renciation neuroendocrinienne, ph��notype possiblement li�� au caract��re agressif du cancer de la prostate, l'expression de IB1/JIP-1 est augment��, sugg��rant soit un r��le possible dans le d��veloppement du ph��notype neuronal ou une implication dans une fonction anti-apoptotique. Ce travail a donc permis d'��largir nos connaissances sur la r��gulation et le control de la voie de signalisation des MAPKinases par IB1/JIP-1, qui pourrait avoir encore d'autres fonctions dans ces tissus.

Bioconjugated lanthanide luminescent helicates as multilabels for lab-on-a-chip detection of cancer biomarkers.

The lanthanide binuclear helicate [Eu(2)(L(C2(CO(2)H)))(3)] is coupled to avidin to yield a luminescent bioconjugate EuB1 (Q = 9.3%, tau((5)D(0)) = 2.17 ms). MALDI/TOF mass spectrometry confirms the covalent binding of the Eu chelate and UV-visible spectroscopy allows one to determine a luminophore/protein ratio equal to 3.2. Bio-affinity assays involving the recognition of a mucin-like protein expressed on human breast cancer MCF-7 cells by a biotinylated monoclonal antibody 5D10 to which EuB1 is attached via avidin-biotin coupling demonstrate that (i) avidin activity is little affected by the coupling reaction and (ii) detection limits obtained by time-resolved (TR) luminescence with EuB1 and a commercial Eu-avidin conjugate are one order of magnitude lower than those of an organic conjugate (FITC-streptavidin). In the second part of the paper, conditions for growing MCF-7 cells in 100-200 microm wide microchannels engraved in PDMS are established; we demonstrate that EuB1 can be applied as effectively on this lab-on-a-chip device for the detection of tumour-associated antigens as on MCF-7 cells grown in normal culture vials. In order to exploit the versatility of the ligand used for self-assembling [Ln(2)(L(C2(CO(2)H)))(3)] helicates, which sensitizes the luminescence of both Eu(III) and Tb(III) ions, a dual on-chip assay is proposed in which estrogen receptors (ERs) and human epidermal growth factor receptors (Her2/neu) can be simultaneously detected on human breast cancer tissue sections. The Ln helicates are coupled to two secondary antibodies: ERs are visualized by red-emitting EuB4 using goat anti-mouse IgG and Her2/neu receptors by green-emitting TbB5 using goat anti-rabbit IgG. The fact that the assay is more than 6 times faster and requires 5 times less reactants than conventional immunohistochemical assays provides essential advantages over conventional immunohistochemistry for future clinical biomarker detection.

The cataract and glucosuria associated monocarboxylate transporter MCT12 is a new creatine transporter.

Creatine transport has been assigned to creatine transporter 1 (CRT1), encoded by mental retardation associated SLC6A8. Here, we identified a second creatine transporter (CRT2) known as monocarboxylate transporter 12 (MCT12), encoded by the cataract and glucosuria associated gene SLC16A12. A non-synonymous alteration in MCT12 (p.G407S) found in a patient with age-related cataract (ARC) leads to a significant reduction of creatine transport. Furthermore, Slc16a12 knockout (KO) rats have elevated creatine levels in urine. Transport activity and expression characteristics of the two creatine transporters are distinct. CRT2 (MCT12)-mediated uptake of creatine was not sensitive to sodium and chloride ions or creatine biosynthesis precursors, breakdown product creatinine or creatine phosphate. Increasing pH correlated with increased creatine uptake. Michaelis-Menten kinetics yielded a Vmax of 838.8 pmol/h/oocyte and a Km of 567.4 ��m. Relative expression in various human tissues supports the distinct mutation-associated phenotypes of the two transporters. SLC6A8 was predominantly found in brain, heart and muscle, while SLC16A12 was more abundant in kidney and retina. In the lens, the two transcripts were found at comparable levels. We discuss the distinct, but possibly synergistic functions of the two creatine transporters. Our findings infer potential preventive power of creatine supplementation against the most prominent age-related vision impaired condition.