Étude de la collaboration entre les facteurs de transcription hématopoïétiques lors du développement et de la différenciation des cellules érythroïdes

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques.

Impacts fonctionnels des variants génétiques dans les promoteurs des gènes associés à la survie et à la mort cellulaire

La régulation de l’apoptose est importante dans le maintient de l’homéostasie cellulaire et l’intégrité du matériel génétique. L’apoptose est un mécanisme cellulaire qui élimine les cellules endommagées. Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies génétiques. La dérégulation des gènes codants pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose est fréquemment observée chez divers types de cancers, incluant la leucémie. Nous proposons que des polymor¬phis¬mes fonctionnels localisés dans la région régulatrice (rSNP) des gènes impliqués dans la voie d’apoptose intrinsèque auraient un impact significatif dans l’oncogenèse en modifiant le taux d’expression de ces gènes. Dans cette étude, nous avons validé, à l’aide d’une combinaison d’approches in silico et in vitro, l’impact fonctionnel de la variabilité génétique sous la forme d’haplotypes (rHAPs), au niveau du promoteur proximal, de 11 gènes codant pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose. Pour ce faire, nous avons sous-cloné les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le gène rapporteur luciférase (pGL3b). Ces constructions furent utilisées dans des essais de transfections transitoires dans 3 lignées cellulaires (Hela, Jeg3 et Jurkat). Nous avons observé qu’au moins 2 rHAPs influencent significativement l’activité transcriptionelle de façon allèle spécifique. Ces rHAPs sont associés aux gènes YWHAB et YWHAQ. Les analyses de retard sur gel d’électrophorèse (EMSA) ont permis d’identifier 2 sites de liaison ADN-protéine différentielles dans les rHAPs du gène YWHAB. La variabilité du niveau d’expression des gènes étudiés pourrait contribuer à la susceptibilité interindividuelle de développer un cancer, tel que la leucémie de l’enfant.

Génomique fonctionnelle des cellules corticotropes hypophysaires : contrôle génétique de la gestion systémique des stress

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques.

Étude des mécanismes associés aux effets bénéfiques de la restriction calorique sur la fonction somatotrope du rat vieillissant.

Dans les cellules somatotropes, la liaison du facteur de libération de l’hormone de croissance (GHRH) à son récepteur (GHRH-R) stimule la synthèse et la sécrétion de l’hormone de croissance (GH) ainsi que la prolifération cellulaire. Chez les mammifères, le vieillissement est caractérisé par une diminution de la sécrétion de GH, liée à une perte de sensibilité des somatotropes au GHRH. Chez le rat âgé, des modifications de niveaux d'ARNm du GHRH-R et une diminution d'affinité et de capacité de liaison du GHRH sont rapportés. Au cours du vieillissement, une augmentation des niveaux de glucose et d’acides gras libres sérique suggère qu’une gluco- ou lipotoxicité puisse contribuer au dysfonctionnement de la fonction somatotrope. À ce jour, la restriction calorique modérée de longue durée (RCMLD) constitue l’intervention la plus efficace pour prévenir ou retarder les détériorations liées à l’âge. Des études ont montré des effets bénéfiques de la RCMLD sur l’axe somatotrope au cours du vieillissement via un maintien des paramètres de liaison du GHRH-R. Compte tenu de l’importance de cet axe, la compréhension des mécanismes menant à la somatopause ainsi que ceux associés aux effets bénéfiques de la RCMLD s’avère importante. Les objectifs principaux de la présente thèse étaient : 1) de déterminer les effets de la RCMLD chez le rat, sur le GHRH-R hypophysaire et la sensibilité des somatotropes au GHRH, 2) d’identifier les mécanismes associés à la somatopause et aux effets bénéfiques de la RCMLD, et 3) de préciser les effets d’une gluco-ou lipotoxicité sur l’axe somatotrope de rats et leur implication dans la somatopause. Des rats de 8 mois ont été soumis à une restriction calorique de 40% jusqu’à l’âge de 18-20 mois et ont été comparés à des rats jeunes et âgés nourris ad libitum. Cette étude a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques de la RCMLD sur la régulation et la fonctionnalité du GHRH-R et de proposer que le glucose et les acides gras libres (AGL) circulants soient impliqués dans le vieillissement de la somatotrope. Une étude de micro-puce à ADN à permis d’identifier des gènes associés à des mécanismes de protection et de réparation des dommages cellulaires mis en place dans l’hypophyse antérieure au cours du vieillissement et par la RCMLD. Finalement, les effets d’un stress gluco- ou lipotoxique sur la fonction somatotrope ont été étudiés chez des rats de 2 et 6 mois, infusés 72 h avec une solution de glucose ou d’Intralipides, mimant les niveaux circulants de glucose et d’AGL retrouvés chez le rat âgé. Les résultats obtenus montrent que la glucotoxicité affecte la régulation de certains gènes de la somatotrope, dont le GHRH-R, et suggèrent que la capacité de réponse à ce type de stress est altérée. Les mécanismes par lesquels la glucotoxicité exerce ces effets pourraient inclure la génération de stress oxydant. L’ensemble de ces résultats proposent de nouvelles pistes mécanistiques qui pourraient contribuer au retardement de la somatopause et, ultimement, à l’élaboration de nouvelles stratégies d’intervention nutritionnelles ou pharmacologiques ciblant les mêmes voies que la RCMLD, avec une efficacité similaire ou supérieure.

Étude des mécanismes moléculaires influençant la variation de phase des adhésines P, F1651 et CS31A présentes chez des souches d'Escherichia coli pathogènes.

F1651, les pili Pap et l’antigène CS31A associé aux antigènes de surface K88 sont tout trois des membres de la famille de type P des facteurs d’adhérence jouant un rôle prépondérant lors de l’établissement d’une maladie causée par des souches Escherichia coli pathogènes, en particulier des souches d’E. coli pathogènes extra-intestinales (ExPEC, Extra-intestinal pathogenic E. coli). Leur expression est sous le contrôle d’un mécanisme de régulation transcriptionnel dépendant de l’état de méthylation de l’ADN, résultant dans l’existence de deux populations définies, l’une exprimant l’adhésine (population ON) et l’autre ne l’exprimant pas (population OFF). Malgré de fortes identités de séquences, ces trois systèmes diffèrent l’un de l’autre, principalement par le pourcentage de cellules ON rencontrées. Ainsi, quand CS31A est systématiquement orienté vers un état considéré comme OFF, F1651 présente une phase ON particulièrement élevée et Pap montre deux états OFF et ON bien distincts, selon le phénotype de départ. La protéine régulatrice sensible à la leucine (Lrp, Leucine-responsive regulatory protein) joue un rôle essentiel dans la réversibilité de ce phénomène épigénétique et il est supposé que les différences de séquences au niveau de la région régulatrice modifient la localisation à ces sites de fixation de Lrp; ce qui résulte, en final, aux différences de phase existant entre CS31A, F1651 et Pap.À l’aide de divers techniques parmi lesquelles l’utilisation de gènes rapporteurs, mutagénèses dirigées et d’analyse des interactions ADN-protéines in vitro, nous montrons dans ce présent projet que la phase OFF prédominante chez CS31A est principalement due à une faible interaction de Lrp avec la région distale de l’opéron clp, et que la présence d’un homologue du régulateur local PapI joue un rôle également clef dans la production de CS31A. Dans le cas de F1651, nous montrons dans cette étude que le taux élevé de cellules en phase ON est dû à une altération dans le maintien de Lrp sur les sites répresseurs 1-3. Ceci est dû à la présence de deux nucléotides spécifiques, situé de part et d’autre du site répresseur 1, qui défavorisent la fixation de Lrp sur ce site précis. Tout comme dans le cas de CS31A, la formation d’un complexe, activateur ou répresseur de la phase ON, dépend également de l’action de du régulatuer local FooI, qui favorise alors le déplacement de Lrp des sites répresseurs 1-3 vers les sites activateurs 4-6.

Décliner la frontière : transit et contagion de la violence dans la fiction sacrificielle de Bernard-Marie Koltès

Ce mémoire de maîtrise traite de quatre pièces de l’auteur français Bernard-Marie Koltès. Résolument axé sur l’étude du texte écrit, il vise dans un premier temps l’analyse d’un ensemble de désajustements et d’une culture de l’équivoque dans le traitement du lieu, du temps et de l’identité. Le premier but de ces analyses est l’approfondissement de certaines avenues déjà investies par la critique (marginalité des lieux et des personnages, présence constante de la violence et de la mort, etc.), dans la recherche d’une signification globale à un ensemble de pratiques textuelles liées à la notion de limite ou de frontière. Opérant un changement de perspective, la seconde partie de l’étude s’attarde à la violence ainsi qu’aux modalités et implications de sa mise en texte dans une étude croisée de l’acte créateur et de la pratique de lecture. À partir de la théorie du sacrifice élaborée par René Girard dans La violence et le sacré, et faisant dialoguer certains textes importants d’auteurs divers (Aristote, Nietzsche, Artaud, Foucault, Derrida et Adorno), l’analyse vise à inscrire la littérarité du texte koltésien dans une entreprise plus vaste ayant à voir avec la violence, sa régulation et sa diffusion. Au carrefour des études théâtrales, de la littérature et de la philosophie, cette réflexion cherche à concevoir le théâtre de Koltès (particulièrement Roberto Zucco) comme un sacrifice rituel, afin de mieux en comprendre le rapport au réel et certaines de ses particularités du point de vue du mécanisme cathartique.

La structure du sommeil et l’activité cardiaque nocturne chez les adolescents ayant un trouble anxieux

L’objectif de la présente thèse était de caractériser le sommeil d’un groupe clinique d’enfants et d’adolescents ayant un trouble d’anxiété comme diagnostic primaire et le comparer à un groupe témoin. Dans un premier temps, nous avons vérifié si le profil de la fréquence cardiaque nocturne des enfants et des adolescents pouvait être regroupé selon le diagnostic. Pour ce faire, la fréquence cardiaque nocturne de 67 adolescents anxieux et 19 sujets non anxieux a été enregistrée à l’aide d’un équipement ambulatoire. Les résultats de cette étude montrent que le profil de la fréquence cardiaque nocturne chez les enfants anxieux varie selon le diagnostic. Alors que les adolescents non anxieux montrent un profil de la fréquence cardiaque nocturne plat, on retrouve les associations suivantes chez les adolescents ayant un trouble anxieux : a) un profil croissant de la fréquence cardiaque chez les adolescents ayant un trouble d’anxiété de séparation; b) un profil décroissant de la fréquence cardiaque chez les adolescents ayant un trouble d’anxiété généralisé; c) un profil en forme de U chez les adolescents ayant un trouble d’anxiété sociale. De plus, une association significative a été observée entre le diagnostic et la présence de fatigue matinale. L’association d’un profil de la fréquence cardiaque nocturne avec un diagnostic d’anxiété suggère la présence d’une dysrégulation de la modulation chronobiologique du système nerveux autonome. Étant donné que le profil de la fréquence cardiaque nocturne s’exprime différemment selon le diagnostic, qu’en est-il de l’architecture du sommeil? Dans un deuxième temps, nous avons enregistré le sommeil en laboratoire d’un groupe clinique de 19 jeunes ayant un trouble d’anxiété comme diagnostic primaire, avec comorbidités et médication et comparé à 19 jeunes non anxieux. Les résultats de cette étude ont montré que les participants du groupe anxieux ont une latence au sommeil plus longue, une latence au sommeil paradoxal plus longue et une durée d’éveil plus longue lorsque comparé au groupe témoin. L’évaluation subjective de la qualité du sommeil chez le groupe d’adolescents anxieux montre que leur auto-évaluation reflète les valeurs enregistrées en laboratoire. Nous avons également observé chez le groupe anxieux une fréquence cardiaque moyenne plus élevée et un index plus élevé d’apnée-hypopnée, bien que non pathologique. Nous avons également observé une association positive entre l’anxiété de trait et l’indice d’apnée-hypopnée et la latence au sommeil, ainsi qu’une association positive entre l’anxiété manifeste et la latence au sommeil paradoxal. Ces résultats suggèrent que le sommeil chez cette population est altéré, que des signes d’hypervigilance physiologique sont présents et qu'une association existe entre ces deux paramètres. Finalement, dans la troisième étude de cette thèse, nous avons analysé l’activité cardiaque pendant le sommeil en utilisant les paramètres temporels et fréquentiels de la variabilité cardiaque chez un groupe clinique de dix-sept enfants et adolescents ayant un trouble d’anxiété comme diagnostic primaire avec comorbidité et médication, et comparé à un groupe non anxieux. Les résultats ont montré que les participants du groupe anxieux, lorsque comparés au groupe non anxieux, présentent des intervalles interbattements plus courts, un indice temporel de la variabilité cardiaque représentant la branche parasympathique moindre, une activité des hautes fréquences normalisées moindre et un ratio basse fréquence sur haute fréquence augmenté. Plusieurs corrélations ont été observées entre les mesures cliniques de l’anxiété et les mesures de la variabilité cardiaque. Ces résultats viennent ajouter à la littérature actuelle un volet descriptif clinique à ce jour non documenté, soit l’impact de l’anxiété pathologique chez un groupe clinique d’enfants et d’adolescents sur le processus normal du sommeil et sur la régulation de la fréquence cardiaque. En résumé, les résultats de ces trois études ont permis de documenter chez un groupe clinique d’enfants et d’adolescents ayant de l’anxiété pathologique, la présence d’une altération circadienne du profil de la fréquence cardiaque, d’une architecture altérée du sommeil ainsi qu’une dysrégulation du système nerveux contrôlant l’activité cardiaque.

Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

The BTB/POZ Transcription Factor Miz-1 Is Required To Regulate The Commitment, Survival And Differentiation Of Early B And T Cell Lineages

Les lymphocytes B et T sont issus de cellules progénitrices lymphoïdes de la moelle osseuse qui se différencient grâce à l’action de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont l’interleukine-7 (IL-7)/IL-7 récepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprimé par les cellules lymphoïdes et contrôle leur croissance et leur différenciation. Cette régulation transcriptionnelle peut être coordonnée par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet était de comprendre les mécanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le développement des lymphocytes B et T. Pour réaliser ce projet, des souris déficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris à allèles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empêche l’interaction avec Miz-1, ont été générées. La caractérisation des souris Miz 1POZ a démontré que l’inactivation de Miz-1 perturbe le développement des lymphocytes B et T aux stades précoces de leur différenciation qui dépend de l’IL-7. L’analyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montré que ces cellules surexpriment la protéine inhibitrice SOCS1 qui empêche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la régulation à la hausse de la protéine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrôle son activité. En plus de contrôler l’axe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spécifiquement aux stades précoces du développement afin d’assurer la survie des progéniteurs B et T, Miz-1 régule l’axe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux nécessaires pour la différenciation des cellules immatures. La caractérisation des souris c-MycV394D a montré, quant à elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indépendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un défaut de différenciation additionnel au niveau de la -sélection, étape où les signaux initiés par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifération et la différenciation des thymocytes en stades plus matures. À cette étape du développement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble être requise pour contrôler le niveau d’activation de la voie p53, induite lors du processus de réarrangement V(D)J du TCR. L’expression de gènes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du régulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est régulée à la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un débalancement pro-apoptotique qui empêche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut être rétablie à ce stade de différenciation en assurant une coordination adéquate entre les signaux initiés par l’introduction d’un TCR transgénique et d’un transgène codant pour la protéine Bcl-2. En conclusion, ces études ont montré que Miz-1 intervient à deux niveaux du développement lymphoïde: l’un précoce en contrôlant la signalisation induite par l’IL-7 dans les cellules B et T, en plus de l’axe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et l’autre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. Étant donné que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets à plusieurs rondes de prolifération, ces études serviront à mieux comprendre l’implication des régulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la génération des signaux nécessaires à la différenciation non aberrante et à la survie des ces cellules. Enfin, les modèles expérimentaux, souris déficientes ou à allèles mutantes, utilisés pour ce travail permettront de mieux définir les bases moléculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de révéler les mécanismes conduisant au lymphome.

Altérations du métabolisme cardiaque associées à des désordres génétiques de l’oxydation des acides gras à chaîne longue chez la souris

Bien que le changement dans le choix des substrats énergétiques des acides gras (AGs) vers les glucides soit considéré comme bénéfique pour le cœur insuffisant, il n’est pas clair à savoir pourquoi les patients atteints de désordres de la β-oxydation (β-OX) des AGs à chaîne longue (AGCLs) développent des troubles du rythme et des cardiomyopathies. De plus, le traitement actuel ne permet pas de prévenir l’apparition du phénotype clinique chez tous les patients, spécifiquement en condition de jeûne ou de stress. Ainsi, plusieurs modèles de souris déficientes pour des enzymes impliquées dans l’oxydation des acides gras ont été développés de manière à améliorer les connaissances de la maladie ainsi que les traitements offerts aux patients. À cet égard, cette étude vise à évaluer le phénotype métabolique et fonctionnel des cœurs de souris déficientes pour le récepteur activé de la prolifération des peroxysomes-α (PPARα), un facteur de transcription des gènes impliqués notamment dans la β-OX des AGs, et pour la déshydrogénase des acyl-CoA à très longue chaîne (very-long chain acyl-CoA dehydrogenase, VLCAD), le déficit de l’oxydation des AGCLs le plus commun chez l’humain. L’approche expérimentale utilisée comprend plusieurs techniques dont (i) la perfusion ex vivo de cœur de souris au travail combinée à l’utilisation de substrats marqués au carbone 13 (13C) et à l’analyse par chromatographie gazeuse-spectrométrie de masse (GCMS), (ii) l’analyse de l’expression génique par qPCR et (iii) l’analyse de l’activité électrique du cœur in vivo par télémétrie. De manière inattendue, les résultats de cette étude menée chez la souris ont permis de mettre en évidence que des déficits pour des protéines impliquées dans l’oxydation des AGCLs sont associés à des altérations du métabolisme (i) des glucides, (ii) des AGs polyinsaturés (AGPIs), et (iii) mitochondrial, incluant l’anaplérose, en plus d’être liés à des désordres de la fonction électrique du cœur, à savoir une prolongation du segment QTc. Pris dans leur ensemble, les résultats de cette thèse pourraient servir à l’élaboration de nouvelles interventions métaboliques destinées à améliorer les traitements possibles et donc, la qualité de vie des patients atteints de désordres héréditaires de la β-OX des AGCLs.

Identification du gène Anoctamine 5 responsable d'une nouvelle forme récessive de dystrophie musculaire des ceintures

Les dystrophies musculaires des ceintures (ou limb-girdle muscular dystrophy, LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires chez l’adulte et sont définies par une atrophie et une faiblesse progressive qui surviennent dans les muscles proximaux. Chez une cohorte canadienne-française, nous avons précédemment décrit une nouvelle forme récessive, désignée LGMD2L et marquée par une atrophie asymétrique du quadriceps, que nous avions cartographiée au chromosome 11p12-p13 grâce à des analyses de liaison. L’objectif de ce projet de thèse était de raffiner l’intervalle candidat, puis d’identifier et de caractériser le gène muté responsable de la LGMD2L. Grâce à une cartographie par homozygotie de polymorphismes de nucléotide simple (SNPs) réalisée sur une grande famille consanguine, nous avons redéfini l’intervalle candidat à une région du chromosome 11p14.3-p15.1. Par séquençage de l’ADN génomique et complémentaire au gène Anoctamine 5 (ANO5) inclus dans cet intervalle, nous avons identifié trois mutations, chez autant de familles: une substitution créant un site d’épissage aberrant, une insertion d’un nucléotide et une mutation faux-sens. Les deux premières mutations étaient associées à une hausse de la dégradation de l’ARN messager médiée par une troncation prématurée. Nous avons également identifié des mutations ANO5 chez une seconde dystrophie musculaire de type distal cartographiant au même locus que la LGMD2L, nommée MMD3, et dont la manifestation initiale était une faiblesse des mollets, mais qui pouvait progresser vers une atrophie des quadriceps. Une réparation membranaire défective avait été observée chez les fibroblastes de deux patients MMD3, suggérant un rôle pour ANO5 dans ce mécanisme. La localisation et la fonction d’ANO5 dans le muscle sont inconnues, mais cette protéine fait partie d’une famille conservée de protéines à huit domaines transmembranaires, les Anoctamines, dont certains membres sont des transporteurs chloriques activés par le calcium. Les résultats de nos études d’immunofluorescence suggèrent qu’ANO5 se localise peu au sarcolemme, mais plutôt à une structure intracellulaire qui suit la ligne Z des myofibrilles. De façon étonnante, cette localisation était préservée chez un patient LGMD2L porteur homozygote de la mutation d’épissage, en dépit du fait que cette dernière était considérée comme une mutation nulle. Néanmoins, nous avons identifié un épissage alternatif de l’exon 15 qui se produisait sur une proportion des transcrits porteurs de la mutation d’épissage, ce qui rétablirait le cadre de lecture, soulignant la complexité de la régulation de l’épissage d’ANO5 et laissant croire que la LGMD2L pourrait être causée par une perte de fonction partielle, et non complète, d’ANO5. Des études subséquentes par des groupes européens ont montré que les anoctaminopathies 5 sont une cause fréquente de dystrophies musculaires des ceintures chez l’adulte. Notre découverte de mutations au gène Anoctamine 5 a mis en évidence une nouvelle classe de protéines importantes pour la biologie du muscle et a ouvert la voie à de nouvelles pistes pour étudier les mécanismes par lesquels un défaut de réparation membranaire progresse en une dystrophie musculaire.

Effet de l’Ocytocine sur les paramètres métaboliques et cardiovasculaires des rats Sprague-Dawley et des rats Spontanément Hypertendus

réalisé avec la codirection de Marek Jankowski

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

Contribution de l'intimité à l'effet du soutien social dans la relation entre l'alexithymie et la dépression

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Identification de gènes impliqués dans le développement du tissu adipeux et caractérisation de PON3 et de son impact sur divers paramètres de production chez le porc

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal