Molecular characterization of the human gut microbiota: the effect of aging

Age-related physiological changes in the gastrointestinal tract, as well as modification in lifestyle, nutritional behaviour, and functionality of the host immune system, inevitably affect the gut microbiota. The study presented here is focused on the application and comparison of two different microarray approaches for the characterization of the human gut microbiota, the HITChip and the HTF-Microb.Array, with particular attention to the effects of the aging process on the composition of this ecosystem. By using the Human Intestinal Tract Chip (HITChip), recently developed at the Wageningen University, The Netherland, we explored the age-related changes of gut microbiota during the whole adult lifespan, from young adults, through elderly to centenarians. We observed that the microbial composition and diversity of the gut ecosystem of young adults and seventy-years old people is highly similar but differs significantly from that of the centenarians. After 100 years of symbiotic association with the human host, the microbiota is characterized by a rearrangement in the Firmicutes population and an enrichment of facultative anaerobes. The presence of such a compromised microbiota in the centenarians is associated with an increased inflammation status, also known as inflamm-aging, as determined by a range of peripheral blood inflammatory markers. In parallel, we overtook the development of our own phylogenetic microarray with a lower number of targets, aiming the description of the human gut microbiota structure at high taxonomic level. The resulting chip was called High Taxonomic level Fingerprinting Microbiota Array (HTF-Microb.Array), and was based on the Ligase Detection Reaction (LDR) technology, which allowed us to develop a fast and sensitive tool for the fingerprint of the human gut microbiota in terms of presence/absence of the principal groups. The validation on artificial DNA mixes, as well as the pilot study involving eight healthy young adults, demonstrated that the HTF-Microb.Array can be used to successfully characterize the human gut microbiota, allowing us to obtain results which are in approximate accordance with the most recent characterizations. Conversely, the evaluation of the relative abundance of the target groups on the bases of the relative fluorescence intensity probes response still has some hindrances, as demonstrated by comparing the HTF.Microb.Array and HITChip high taxonomic level fingerprints of the same centenarians.

Rag2-/-;gammac-/- immunodeficient mice, a new preclinical model to study antitumor approaches

Animal models have been relevant to study the molecular mechanisms of cancer and to develop new antitumor agents. Anyway, the huge divergence in mouse and human evolution made difficult the translation of the gained achievements in preclinical mouse based studies. The generation of clinically relevant murine models requires their humanization both concerning the creation of transgenic models and the generation of humanized mice in which to engraft a functional human immune system, and reproduce the physiological effects and molecular mechanisms of growth and metastasization of human tumors. In particular, the availability of genotypically stable immunodepressed mice able to accept tumor injection and allow human tumor growth and metastasization would be important to develop anti-tumor and anti-metastatic strategies. Recently, Rag2-/-;gammac-/- mice, double knockout for genes involved in lymphocyte differentiation, had been developed (CIEA, Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki, Japan). Studies of human sarcoma metastasization in Rag2-/-; gammac-/- mice (lacking B, T and NK functionality) revealed their high metastatic efficiency and allowed the expression of human metastatic phenotypes not detectable in the conventionally used nude murine model. In vitro analysis to investigate the molecular mechanisms involved in the specific pattern of human sarcomas metastasization revealed the importance of liver-produced growth and motility factors, in particular the insulin-like growth factors (IGFs). The involvement of this growth factor was then demonstrated in vivo through inhibition of IGF signalling pathway. Due to the high growth and metastatic propensity of tumor cells, Rag2-/-;gammac-/- mice were used as model to investigate the metastatic behavior of rhabdomyosarcoma cells engineered to improve the differentiation. It has been recently shown that this immunodeficient model can be reconstituted with a human immune system through the injection of human cord blood progenitor cells. The work illustrated in this thesis revealed that the injection of different human progenitor cells (CD34+ or CD133+) showed peculiar engraftment and differentiation abilities. Experiments of cell vaccination were performed to investigate the functionality of the engrafted human immune system and the induction of specific human immune responses. Results from such experiments will allow to collect informations about human immune responses activated during cell vaccination and to define the best reconstitution and experimental conditions to create a humanized model in which to study, in a preclinical setting, immunological antitumor strategies.

Genetic variability and structuring of deep Corallium rubrum (Linnaeus, 1758) populations

ABSTRACT Given the decline of shallow-water red coral populations resulting from over-exploitation and mass mortality events, deeper populations below 50 metres depth (mesophotic populations) are currently the most harvested; unfortunately, very little is known about their biology and ecology. The persistence of these populations is tightly linked to their adult density, reproductive success, larval dispersal and recruitment. Moreover, for their conservation, it is paramount understand processes such as connectivity within and among populations. Here, for the first time, genetic variability and structuring of Corallium rubrum populations collected in the Tyrrhenian Sea ranging from 58 to 118 metres were analyzed using ten microsatellite loci and two mitochondrial markers (mtMSH and MtC). The aims of the work were 1) to examine patterns of genetic diversity within each geographic area (Elba, Ischia and Praiano) and 2) to define population structuring at different spatial scales (from tens of metres to hundreds of kilometres). Based on microsatellite data set, significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium due to elevated heterozygote deficiencies were detected in all samples, probably related to the presence of null alleles and/or inbreeding, as was previously observed in shallow-water populations. Moreover, significant levels of genetic differentiation were observed at all spatial scale, suggesting a recent isolation of populations. Biological factors which act at small spatial scale and/or abiotic factors at larger scale (e.g. summer gyres or absence of suitable substrata for settlement) could determine this genetic isolation. Using mitochondrial markers, significant differences were found only at wider scale (between Tuscany and Campania regions). These results could be related to the different mutation rate of the molecular makers or to the occurrence of some historical links within regions. A significant isolation by distance pattern was then observed using both data sets, confirming the restricted larval dispersal capability of the species. Therefore, the hypothesis that deeper populations may act as a source of larvae helping recovery of threatened shallow-water populations is not proved. Conservation strategies have to take into account these results, and management plans of deep and currently harvested populations have to be defined at a regional or sub regional level, similarly to shallow-water populations. Nevertheless, further investigations should be needed to understand better the genetic structuring of this species in the mesophotic zone, e.g. extending studies to other Mediterranean deep-water populations.

Cross-Talk tra Bifidobacterium e intestino umano: impatto sulle attività health promoting

Bifidobacteria constitute up to 3% of the total microbiota and represent one of the most important healthpromoting bacterial groups of the human intestinal microflora. The presence of Bifidobacterium in the human gastrointestinal tract has been directly related to several health-promoting activities; however, to date, no information about the specific mechanisms of interaction with the host is available. The first health-promoting activities studied in these job was the oxalate-degrading activity. Oxalic acid occurs extensively in nature and plays diverse roles, especially in pathological processes. Due to its highly oxidizing effects, hyper absorption or abnormal synthesis of oxalate can cause serious acute disorders in mammals and be lethal in extreme cases. Intestinal oxalate-degrading bacteria could therefore be pivotal in maintaining oxalate homeostasis, reducing the risk of kidney stone development. In this study, the oxalate-degrading activity of 14 bifidobacterial strains was measured by a capillary electrophoresis technique. The oxc gene, encoding oxalyl-CoA decarboxylase, a key enzyme in oxalate catabolism, was isolated by probing a genomic library of B. animalis subsp. lactis BI07, which was one of the most active strains in the preliminary screening. The genetic and transcriptional organization of oxc flanking regions was determined, unravelling the presence of other two independently transcribed open reading frames, potentially responsible for B. animalis subsp. lactis ability to degrade oxalate. Transcriptional analysis, using real-time quantitative reverse transcription PCR, revealed that these genes were highly induced in cells first adapted to subinhibitory concentrations of oxalate and then exposed to pH 4.5. Acidic conditions were also a prerequisite for a significant oxalate degradation rate, which dramatically increased in oxalate pre-adapted cells, as demonstrated in fermentation experiments with different pH-controlled batch cultures. These findings provide new insights in the characterization of oxalate-degrading probiotic bacteria and may support the use of B. animalis subsp. lactis as a promising adjunct for the prophylaxis and management of oxalate-related kidney disease. In order to provide some insight into the molecular mechanisms involved in the interaction with the host, in the second part of the job, we investigated whether Bifidobacterium was able to capture human plasminogen on the cell surface. The binding of human plasminogen to Bifidobacterium was dependent on lysine residues of surface protein receptors. By using a proteomic approach, we identified six putative plasminogen-binding proteins in the cell wall fraction of three strain of Bifidobacterium. The data suggest that plasminogen binding to Bifidobactrium is due to the concerted action of a number of proteins located on the bacterial cell surface, some of which are highly conserved cytoplasmic proteins which have other essential cellular functions. Our findings represent a step forward in understanding the mechanisms involved in the Bifidobacterium-host interaction. In these job w studied a new approach based on to MALDI-TOF MS to measure the interaction between entire bacterial cells and host molecular target. MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight)—mass spectrometry has been applied, for the first time, in the investigation of whole Bifidobacterium cells-host target proteins interaction. In particular, by means of this technique, a dose dependent human plasminogen-binding activity has been shown for Bifidobacterium. The involvement of lysine binding sites on the bacterial cell surface has been proved. The obtained result was found to be consistent with that from well-established standard methodologies, thus the proposed MALDI-TOF approach has the potential to enter as a fast alternative method in the field of biorecognition studies involving in bacterial cells and proteins of human origin.

Gli obiettivi "rinnovabili" nella pianificazione energetica regionale

Il concetto fondante e le motivazioni alla base di questo lavoro di tesi sono costituiti dalla volontà di analizzare a fondo la problematica energetica ed ambientale, focalizzando l‟indagine sul ruolo delle Fonti Energetiche Rinnovabili e contestualizzandola nel contesto “locale” relativo alla Regione Emilia Romagna: questo lavoro di tesi, infatti, è stato sviluppato nell‟ambito di un progetto di collaborazione stipulato tra Università e Regione Emilia Romagna e si è svolto all‟interno dell‟Assessorato alle Attività Produttive della Regione, lavorando con il “Servizio Politiche Energetiche” emiliano-romagnolo. La crisi energetica (e, contestualmente, la crisi ambientale) rappresenta una problematica al centro del dibattito globale da oltre mezzo secolo, affrontata finora in maniera non organica e realmente efficace dalle nazioni e dagli organismi sovranazionali coinvolti in tale dibattito. Tale tematica è divenuta ancora più pregnante (e la ricerca di una “soluzione” al riguardo, ancora più pressante) negli ultimi anni, in seguito alla deflagrazione di una crisi globale –economica e sociale- che ha intaccato i modelli di crescita e sviluppo (anche tecnologico) conosciuti finora, ponendo di fronte agli occhi dell‟umanità la necessità impellente di ridefinire politiche economiche, ambientali e, conseguentemente, energetiche, caratterizzate da una maggiore sostenibilità globale. La continua crescita della popolazione e il progressivo incremento generalizzato (e disomogeneo) degli standard di vita alimentano con ritmi esponenziali la domanda –e la conseguente produzione- di energia, inevitabilmente correlata (proprio a causa dei modelli di sviluppo seguiti finora) ad un drammatico incremento delle emissioni climalteranti, che continuano a nuocere irreversibilmente alla salubrità del nostro fragile ecosistema. Oltre alla problematica ambientale si aggiunge, con impellenza sempre più marcata, quella relativa alla disponibilità delle principali fonti energetiche (quelle fossili), che si profilano in esaurimento entro lassi temporali che potrebbero divenire drammaticamente prossimi: il “rischio reale” connesso alla prosecuzione di politiche energetiche poggiate sullo sfruttamento intensivo di tali fonti non è tanto connesso all‟eventuale esaurimento assoluto delle risorse stesse, quanto ad una loro progressiva riduzione, tale da renderle viepiù costose e sempre meno convenienti economicamente. Uno scenario di questo tipo si tradurrebbe inevitabilmente in una condizione per la quale solamente i Paesi più ricchi potrebbero usufruire di tali risorse, estremamente costose, mentre i Paesi meno evoluti economicamente rischierebbero di trovarsi nell‟impossibilità di approvvigionarsi, andando incontro a condizioni di deficit energetico: uno scenario inquietante, che però non appare così “ipotetico”, se si tiene conto di come –già ora- siano in aumento segnali di allarme e di conflitto, attivati da localizzate insufficienze energetiche. In un quadro globale di questo tipo le strade risolutive finora riconosciute e percorse dal mondo scientifico, politico ed economico sono sostanzialmente due: - L‟implementazione del risparmio energetico, in un‟ottica di drastica riduzione dei consumi globali; - La “conversione” della produzione energetica (attualmente fondata sulle fonti convenzionali, ossia quelle fossili) verso le cosiddette “Fonti Energetiche Alternative”. Questa seconda direttrice di marcia sembra poter essere quella in grado di reindirizzare verso un orizzonte di maggiore sostenibilità l‟attuale sistema energetico globale, e in quest‟ottica assumono quindi enorme importanza strategica le tecnologie alternative e, prime tra tutte, le Fonti Energetiche Rinnovabili (FER). Queste consentirebbero infatti sia di ridurre l‟impatto ambientale connesso alla produzione energetica da fonti convenzionali, che di implementare politiche di autosufficienza energetica per quei Paesi che attualmente, dal punto di vista del bilancio energetico interno, dipendono in misura marcata dall‟importazione di combustibili fossili dall‟estero. La crisi energetica e il conseguente ruolo chiave delle Fonti Energetiche Rinnovabili è quindi il punto di partenza di questa tesi, che ha voluto confrontarsi con tale problematica globale, misurandosi con le azioni e con i provvedimenti intrapresi al riguardo a livello locale, focalizzando l‟attenzione sulla realtà e sugli sviluppi delle Fonti Energetiche Rinnovabili nella Regione Emilia Romagna. Per sviluppare il lavoro si è proceduto definendo prima di tutto un quadro complessivo della situazione, in termini di problematica energetica e di stato attuale delle Fonti Energetiche Rinnovabili, scendendo progressivamente nel dettaglio: partendo da una fotografia a livello mondiale, quindi europeo, successivamente italiano (basandosi sui dati di pubblicazioni italiane ed estere, di enti competenti in materia come Terna, il GSE o l‟Enea per l‟Italia, e l‟IEA, l‟EIA, l‟UE per l‟Europa e il resto del mondo). Nella terza parte della tesi si è scesi al dettaglio di questo stato attuale delle Fonti Energetiche Rinnovabili a livello Regionale (Emiliano-Romagnolo) e Provinciale (le nove Province della Regione): per procedere alla definizione di questo quadro la “tecnica operativa” è consistita in una raccolta dati effettuata in collaborazione con il ”Servizio Politiche Energetiche” della Regione Emilia Romagna, estesa alle 9 Province e ai 348 Comuni del territorio emiliano-romagnolo. La richiesta di dati avanzata è stata relativa agli impianti alimentati da fonte energetica rinnovabile in esercizio e a quelli in fase di valutazione sul territorio afferente all‟Ente considerato. Il passo successivo è consistito nell‟aggregazione di questi dati, nella loro analisi e nella definizione di un quadro organico e coerente, relativo allo stato attuale (Ottobre 2010) delle Fonti Energetiche Rinnovabili sul territorio emiliano-romagnolo, tale da permettere di realizzare un confronto con gli obiettivi definiti per le FER all‟interno dell‟ultimo Piano Energetico Regionale e con lo stato delle FER nelle altre Regioni italiane. Sono stati inoltre realizzati due “Scenari”, relativi all‟evoluzione stimata del parco “rinnovabile” emiliano-romagnolo, definiti al 2012 (“Breve Termine”) e al 2015 (“Medio Termine”). I risultati ottenuti hanno consentito di verificare come, nell‟orizzonte “locale” emiliano-romagnolo, il sistema globale connesso alle Fonti Energetiche Rinnovabili abbia attecchito e si sia sviluppato in misura marcata: gli obiettivi relativi alle FER definiti nel precedente Piano Energetico Regionale sono infatti stati sostanzialmente raggiunti in toto. Dalla definizione degli “Scenari” previsionali è stato possibile stimare l‟evoluzione futura del parco “rinnovabile” emilianoromagnolo, verificando come questo risulti essere in continua crescita e risulti “puntare” su due fonti rinnovabili in maniera particolare: la fonte fotovoltaica e la fonte a biocombustibili. Sempre dall‟analisi degli “Scenari” previsionali è stato possibile stimare l‟evoluzione delle singole tecnologie e dei singoli mercati rinnovabili, verificando limiti allo sviluppo (come nel caso della fonte idroelettrica) o potenziali “espansioni” molto rilevanti (come nel caso della fonte eolica). Il risultato finale di questo lavoro di tesi è consistito nel poter definire dei nuovi obiettivi, relativi alle differenti Fonti Energetiche, da potersi inserire all‟interno del prossimo Piano Energetico Regionale: l‟obiettivo “complessivo” individua –avendo il 2015 come orizzonte temporale- una crescita incrementale delle installazioni alimentate da FER pari a 310 MWe circa. Questo lavoro di tesi è stato ovviamente organizzato in più “Parti”, ciascuna ulteriormente suddivisa in “Capitoli”. Nella “Prima Parte”, costituita dai primi 4 Capitoli, si è proceduto ad introdurre la problematica energetica e il contesto in cui si muovono le decisioni e le politiche (comunitarie, nazionali e sovra-nazionali) destinate a trovare soluzioni e risposte: Il Primo Capitolo, introduttivo, definisce prima di tutto gli “strumenti” e i concetti che verranno successivamente richiamati più volte nel resto della Tesi, partendo dal concetto di “energia”, definito sia “concettualmente” che attraverso le unità di misura utilizzate per quantificarlo. Il passo successivo è stato quello di contestualizzare l‟evoluzione dello sfruttamento di questa “risorsa”, in relazione allo sviluppo delle tecnologie e delle stesse condizioni di vita umane, così da definire un background storico per le considerazioni introdotte nel Capitolo successivo. Il Secondo Capitolo, infatti, introduce la problematica attuale (ma mutuata dal background storico evidenziato in precedenza) della “crisi energetica” e della “crisi ambientale” ad essa correlata, considerandone gli aspetti prima di tutto globali, connessi a considerazioni di natura sociale, demografica e –conseguentemente economica e sociale: all‟interno di questa analisi, vengono citati anche gli scenari previsionali elaborati da numerosi enti di ricerca e istituzioni, coinvolti su più livelli nell‟ottica di riuscire ad individuare una “risposta” alle problematiche sollevate dallo sfruttamento intensivo della risorsa energetica per vie convenzionali. Tale risposta è rappresentata dalle normative sovranazionali, europee e italiane varate nell‟ottica di attuare una “transizione etica” in materia di sviluppo sostenibile, impatto ambientale e sfruttamento energetico: un presupposto imprescindibile per la transizione energetica sostenibile è proprio l‟impegno a livello locale (quindi anche e prima di tutto di istituzioni quali, in Italia, le Regioni, le Province e i Comuni), senza il quale difficilmente si potranno raggiungere traguardi avanzati, che implicano anche un sostanziale cambio di mentalità. Nell‟ottica di approfondire ulteriormente il contesto all‟interno del quale vengono adottate azioni e intrapresi provvedimenti utili a concretizzare risposte a livello italiano –nazionale e locale- il Terzo Capitolo introduce il tema delle “politiche energetiche sostenibili”, partendo dalla definizione dell‟attuale condizione Italiana (in termini di inquinamento atmosferico e di sfruttamento intensivo della risorsa energetica, nonché di scenari previsionali), per definire successivamente le politiche nazionali per le fonti rinnovabili, per il settore dei trasporti, del riscaldamento e del raffreddamento, della pianificazione energetica e della generazione distribuita. Il Capitolo introduce anche il tema degli interventi in ambito di fiscalità energetica (“Certificati Verdi”, “Certificati Bianchi” e il “Conto Energia”). Proprio per definire al meglio i meccanismi di incentivazione, il Quarto Capitolo esplicita (facendo riferimento alla documentazione pubblicata da enti quali GSE, Terna, GRTN) il meccanismo del cosiddetto “mercato elettrico” e degli scambi che vi avvengono, in modo tale da comprendere come i metodi di incentivazione alle fonti alternative che si appoggiano su interventi di fiscalità energetica, riescano ad avere –o meno- presa sul sistema. La “Seconda Parte” (costituita dai Capitoli dal 5° al 13°) è invece dedicata al necessario approfondimento sullo stato delle Fonti Energetiche Rinnovabili (FER): in ogni capitolo è stato infatti approfondita la condizione attuale delle principali FER (fonte a Biocombustibili, Eolica, Geotermica, Idraulica, Solare Fotovoltaica, Solare Termica, Solare Termodinamica). Tale approfondimento è stato condotto in termini di sviluppo della tecnologia, incidenza e contributo della singola FER sui bilanci elettrici (considerando prima il quadro mondiale, quindi quello europeo, per scendere infine al dettaglio italiano). Nella parte finale di ogni capitolo sono state riportate anche le principali criticità riscontrate per ogni fonte presa in considerazione, oltre che gli scenari previsionali stimati considerandone i potenziali sviluppi, in un‟ottica di medio termine e di lungo termine. La “Terza Parte” (comprendente i Capitoli dal 14° al 22°) di questa Tesi raccoglie invece il lavoro svolto e i risultati ottenuti e permette di definire lo stato attuale e gli scenari previsionali (a breve termine e a medio termine) per le Fonti Energetiche Rinnovabili nella Regione Emilia Romagna, con un livello di dettaglio sia Regionale che Provinciale. Il lavoro, come detto, è consistito nella raccolta dati effettuata presso gli enti di “governo territoriale” emiliano-romagnoli (la Regione, le 9 Province e i 348 Comuni) e nella successiva aggregazione, elaborazione e interpretazione di questi stessi dati. I Capitoli dal 15° al 19° definiscono lo stato attuale (all‟Ottobre 2010) e gli scenari previsionali (a breve termine e medio termine) per le differenti FER (rispettivamente, Biocombustibili, Eolica, Fotovoltaica, Geotermica e Idroelettrica), prima a livello Provinciale, quindi a livello Regionale. Nella conclusione di ogni Capitolo è contenuto un confronto con lo stato della FER presa in considerazione relativo agli anni precedenti, oltre che il confronto con gli obiettivi definiti per la tecnologia al 2010 dal precedente Piano Energetico Regionale. Questi Capitoli si chiudono con l‟analisi del trend storico della Fonte Energetica Rinnovabile considerata e con la conseguente individuazione dei potenziali obiettivi al 2012 e al 2015 da inserire nel prossimo Piano Energetico Regionale. E‟ presente anche l‟evoluzione stimata del “mercato” della singola FER presa in considerazione, oltre che della “tipologia tecnologica” sulla quale gli installatori e gli investitori tenderanno ad orientarsi sia nel breve che nel medio termine. I Capitoli 20°, 21° e 22° contengono invece lo stato “riassuntivo” delle Fonti Energetiche Rinnovabili, definite per il panorama emiliano-romagnolo (anche in questo caso, prima a livello Provinciale, successivamente a livello regionale) sotto un‟ottica temporale differente: il Capitolo 20° riassume lo stato attuale del parco “rinnovabile” complessivo emiliano-romagnolo, definendone l‟evoluzione storica e confrontandolo con gli obiettivi fissati al 2010 dal precedente Piano Energetico regionale, permettendo così di verificare –nel complesso- se le stime del 2004 erano state corrette. Il Capitolo 21° definisce l‟evoluzione del parco “rinnovabile” complessivo emiliano-romagnolo al 2012, sia a livello Provinciale che Regionale, definendone in questo modo un trend stimato di crescita e dei conseguenti obiettivi di breve termine, riferiti alle singole FER. Il Capitolo 22° definisce infine l‟evoluzione del parco “rinnovabile” complessivo emiliano-romagnolo al 2015 (ancora una volta, sia a livello Provinciale che Regionale) permettendo così di ricavare un trend stimato di crescita e, soprattutto, gli obiettivi di medio termine -riferiti alle singole FER- da inserire all‟interno del prossimo Piano Energetico Regionale. La conclusione permette di chiudere sinteticamente il lavoro svolto in precedenza, traendo le indicazioni più rilevanti dai dati e dalle considerazioni pregresse: come si evincerà, l‟Emilia Romagna risulta una Regione in cui gli obiettivi rinnovabili (e di “conversione energetica”) sono stati sostanzialmente raggiunti e, in alcuni casi, perfino superati. Il mercato rinnovabile è in crescita e le politiche locali e sovra locali evidenziano una marcata volontà di puntare prevalentemente su settori e tecnologie quali quella della biomassa e quella solare fotovoltaica. Nonostante questo, si evidenzia anche la necessità di lavorare a livello di enti regionali e provinciali, per omogeneizzare ulteriormente la distribuzione energetica “rinnovabile” sul territorio (implementando lo sviluppo di determinate fonti su distretti territoriali al momento non ancora raggiunti da tali mercati) e per provvedere ad una riduzione dei consumi energetici che consenta alle FER di avere una maggiore incidenza sui bilanci energetici ed elettrici, locali e regionali. Si ricorda che la “costruzione” di questa tesi è stata sviluppata parallelamente ad un‟attività di stage presso il settore Politiche energetiche dell‟Assessorato alle Attività Produttive della Regione Emilia – Romagna, che in questa fase sta procedendo alla definizione del nuovo Piano Energetico Regionale, e alla conseguente individuazione d

Dealogenazione riduttiva dei policlorobifenili (PCB) in sedimenti anaerobici marini della laguna di Venezia: arricchimento e identificazione dei microrganismi dealogenanti

I policlorobifenili (PCB) sono inquinanti tossici e fortemente recalcitranti che contaminano suoli e sedimenti di acqua dolce e marini. Le tecnologie attualmente impiegate per la loro rimozione (dragaggio e trattamento chimoco-fisico o conferimento in discarica) sono molto costose, poco efficaci o ad alto impatto ambientale. L’individuazione di strategie alternative, di natura biologica, consentirebbe lo sviluppo di un processo alternativo più sostenibile. Nel processo di declorurazione riduttiva i congeneri di PCB a più alto grado di clorurazione, che sono i più tossici, recalcitranti e maggiormente tendenti al bioaccumulo, vengono utilizzati da alcuni microrganismi anaerobici come accettori finali di elettroni nella catena respiratoria e bioconvertiti in congeneri a minor grado di clorurazione, meno pericolosi, che possono essere mineralizzati da parte di batteri aerobi. La declorurazione riduttiva dei PCB è stata spesso studiata in colture anaerobiche di arricchimento in terreno minerale ottenute a partire da sedimenti di acqua dolce; questi studi hanno permesso di dimostrare che batteri del phylum dei Chloroflexi e appartenenti al genere Dehalococcoides o filogeneticamente facenti parte del gruppo dei Dehalococcoides-like sono i decloruranti. Sono tuttavia scarse le informazioni riguardanti l'occorrenza della declorurazione dei PCB in ambienti marini, nei quali l'alta salinità e concentrazione di solfati influenzano diversamente l'evoluzione delle popolazioni microbiche. In sedimenti contaminati della laguna di Venezia è stata osservata declorurazione sia dei PCB preesistenti che di congeneri esogeni; questi studi hanno permesso l'ottenimento di colture di arricchimento fortemente attive nei confronti di 5 congeneri di PCB coplanari. In questa tesi, a partire dalle colture capaci di declorurare i PCB coplanari, sono stati allestiti nuovi passaggi di arricchimento su Aroclor®1254, una miscela di PCB più complessa e che meglio rappresenta la contaminazione ambientale. Le colture sono state allestite come microcosmi anaerobici in fase slurry, preparati risospendendo il sedimento nell'acqua superficiale, ricreando in tal modo in laboratorio le stesse condizioni biogeochimiche presenti in situ; gli slurry sterili sono stati inoculati per avviare le colture. Per favorire la crescita dei microrganismi decloruranti e stimolare così la decloruraazione dei PCB sono stati aggiunti inibitori selettivi di metanogeni (Bromoetansulfonato o BES) e solfato-riduttori (molibdato), sono state fornite fonti di carbonio ed energia (eD), quali acidi grassi a corta catena e idrogeno, utilizzate di batteri decloruranti noti, e per semplificare la comunità microbica sono stati aggiunti antibiotici cui batteri decloruranti del genere Dehalococcoides sono resistenti. Con questo approccio sono stati allestiti passaggi di arricchimento successivi e le popolazioni microbiche delle colture sono state caratterizzate con analisi molecolari di fingerprinting (DGGE). Fin dal primo passaggio di arricchimento nei microcosmi non ammendati ha avuto luogo un'estesa declorurazione dell'Aroclor®1254; nei successivi passaggi si è notato un incremento della velocità del processo e la scomparsa della fase di latenza, mentre la stessa stereoselettività è stata mantenuta a riprova dell’arricchimento degli stessi microrganismi decloruranti. Le velocità di declorurazione ottenute sono molto alte se confrontate con quelle osservate in colture anaerobiche addizionate della stessa miscela descritte in letteratura. L'aggiunta di BES o molibdato ha bloccato la declorurazione dei PCB ma in presenza di BES è stata riscontrata attività dealogenante nei confronti di questa molecola. La supplementazione di fonti di energia e di carbonio ha stimolato la metanogenesi e i processi fermentativi ma non ha avuto effetti sulla declorurazione. Ampicillina e vancomicina hanno incrementato la velocità di declorurazione quando aggiunte singolarmente, insieme o in combinazione con eD. E' stato però anche dimostrato che la declorurazione dei PCB è indipendente sia dalla metanogenesi che dalla solfato-riduzione. Queste attività respiratorie hanno avuto velocità ed estensioni diverse in presenza della medesima attività declorurante; in particolare la metanogenesi è stata rilevata solo in dipendenza dall’aggiunta di eD alle colture e la solfato-riduzione è stata inibita dall’ampicillina in microcosmi nei quali un’estesa declorurazione dei PCB è stata osservata. La caratterizzazione delle popolazioni microbiche, condotte mediante analisi molecolari di fingerprinting (DGGE) hanno permesso di descrivere le popolazioni batteriche delle diverse colture come complesse comunità microbiche e di rilevare in tutte le colture decloruranti la presenza di una banda che l’analisi filogenetica ha ascritto al batterio m-1, un noto batterio declorurante in grado di dealogenare un congenere di PCB in colture di arricchimento ottenute da sedimenti marini appartenente al gruppo dei Dehalococcoides-like. Per verificare se la crescita di questo microrganismo sia legata alla presenza dei PCB, l'ultimo passaggio di arricchimento ha previsto l’allestimento di microcosmi addizionati di Aroclor®1254 e altri analoghi privi di PCB. Il batterio m-1 è stato rilevato in tutti i microcosmi addizionati di PCB ma non è mai stato rilevato in quelli in cui i PCB non erano presenti; la presenza di nessun altro batterio né alcun archebatterio è subordinata all’aggiunta dei PCB. E in questo modo stato dimostrato che la presenza di m-1 è dipendente dai PCB e si ritiene quindi che m-1 sia il declorurante in grado di crescere utilizzando i PCB come accettori di elettroni nella catena respiratoria anche in condizioni biogeochimiche tipiche degli habitat marini. In tutte le colture dell'ultimo passaggio di arricchimento è stata anche condotta una reazione di PCR mirata alla rilevazione di geni per dealogenasi riduttive, l’enzima chiave coinvolto nei processi di dealogenazione. E’ stato ottenuto un amplicone di lughezza analoga a quelle di tutte le dealogenasi note in tutte le colture decloruranti ma un tale amplificato non è mai stato ottenuto da colture non addizionate di PCB. La dealogenasi ha lo stesso comportamento di m-1, essendo stata trovata come questo sempre e solo in presenza di PCB e di declorurazione riduttiva. La sequenza di questa dealogenasi è diversa da tutte quelle note sia in termini di sequenza nucleotidica che aminoacidica, pur presentando due ORF con le stesse caratteristiche e domini presenti nelle dealogenasi note. Poiché la presenza della dealogenasi rilevata nelle colture dipende esclusivamente dall’aggiunta di PCB e dall’osservazione della declorurazione riduttiva e considerato che gran parte delle differenze genetiche è concentrata nella parte di sequenza che si pensa determini la specificità di substrato, si ritiene che la dealogenasi identificata sia specifica per i PCB. La ricerca è stata condotta in microcosmi che hanno ricreato fedelmente le condizioni biogeochimiche presenti in situ e ha quindi permesso di rendere conto del reale potenziale declorurante della microflora indigena dei sedimenti della laguna di Venezia. Le analisi molecolari condotte hanno permesso di identificare per la prima volta un batterio responsabile della declorurazione dei PCB in sedimenti marini (il batterio m-1) e una nuova dealogenasi specifica per PCB. L'identificazione del microrganismo declorurante permette di aprire la strada allo sviluppo di tecnologie di bioremediation mirata e il gene della dealogenasi potrà essere utilizzato come marker molecolare per determinare il reale potenziale di declorurazione di miscele complesse di PCB in sedimenti marini.

Molecular analysis of special type breast carcinomas

The project was developed into three parts: the analysis of p63 isoform in breast tumours; the study of intra-tumour eterogeneicity in metaplastic breast carcinoma; the analysis of oncocytic breast carcinoma. p63 is a sequence-specific DNA-binding factor, homologue of the tumour suppressor and transcription factor p53. The human p63 gene is composed of 15 exons and transcription can occur from two distinct promoters: the transactivating isoforms (TAp63) are generated by a promoter upstream of exon 1, while the alternative promoter located in intron 3 leads to the expression of N-terminal truncated isoforms (ΔNp63). It has been demonstrated that anti-p63 antibodies decorate the majority of squamous cell carcinomas of different organs; moreover tumours with myoepithelial differentiation of the breast show nuclear p63 expression. Two new isoforms have been described with the same sequence as TAp63 and ΔNp63 but lacking exon 4: d4TAp63 and ΔNp73L, respectively. Purpose of the study was to investigate the molecular expression of N-terminal p63 isoforms in benign and malignant breast tissues. In the present study 40 specimens from normal breast, benign lesions, DIN/DCIS, and invasive carcinomas were analyzed by immunohistochemistry and RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) in order to disclose the patterns of p63 expression. We have observed that the full-length isoforms can be detected in non neoplastic and neoplastic lesions, while the short isoforms are only present in the neoplastic cells of invasive carcinomas. Metaplastic carcinomas of the breast are a heterogeneous group of neoplasms which exhibit varied patterns of metaplasia and differentiation. The existence of such non-modal populations harbouring distinct genetic aberrations may explain the phenotypic diversity observed within a given tumour. Intra-tumour morphological heterogeneity is not uncommon in breast cancer and it can often be appreciated in metaplastic breast carcinomas. Aim of this study was to determine the existence of intra-tumour genetic heterogeneity in metaplastic breast cancers and whether areas with distinct morphological features in a given tumour might be underpinned by distinct patterns of genetic aberrations. 47 cases of metaplastic breast carcinomas were retrieved. Out of the 47 cases, 9 had areas that were of sufficient dimensions to be independently microdissected. Our results indicate that at least some breast cancers are composed of multiple non-modal populations of clonally related cells and provide direct evidence that at least some types of metaplastic breast cancers are composed of multiple non-modal clones harbouring distinct genetic aberrations. Oncocytic tumours represent a distinctive set of lesions with typical granular cytoplasmatic eosinophilia of the neoplastic cells. Only rare example of breast oncocytic carcinomas have been reported in literature and the incidence is probably underestimated. In this study we have analysed 33 cases of oncocytic invasive breast carcinoma of the breast, selected according to morphological and immunohistochemical criteria. These tumours were morphologically classified and studied by immunohistochemistry and aCGH. We have concluded that oncocytic breast carcinoma is a morphologic entity with distinctive ultrastructural and histological features; immunohistochemically is characterized by a luminal profile, it has a frequency of 19.8%, has not distinctive clinical features and, at molecular level, shows a specific constellation of genetic aberration.

Progettazione sensibile al contesto dell'adeguamento dell'asse viario esistente nel parco naturale dell'isola dell'Asinara(SS)

lo scopo della presente tesi di laurea è stato quello di redigere un progetto per l’adeguamento funzionale della strada ubicata nel Parco Nazionale dell’ Asinara, tenendo quindi in particolare considerazione le caratteristiche ambientali del territorio, ma garantendo, allo stesso tempo, caratteristiche prestazionali migliorative e una maggiore sicurezza per il traffico veicolare.

Evaluation of glycoconjugate antigens as vaccine candidates against group A Streptococcus and human immunodeficiency virus infections

This PhD thesis discusses the rationale for design and use of synthetic oligosaccharides for the development of glycoconjugate vaccines and the role of physicochemical methods in the characterization of these vaccines. The study concerns two infectious diseases that represent a serious problem for the national healthcare programs: human immunodeficiency virus (HIV) and Group A Streptococcus (GAS) infections. Both pathogens possess distinctive carbohydrate structures that have been described as suitable targets for the vaccine design. The Group A Streptococcus cell membrane polysaccharide (GAS-PS) is an attractive vaccine antigen candidate based on its conserved, constant expression pattern and the ability to confer immunoprotection in a relevant mouse model. Analysis of the immunogenic response within at-risk populations suggests an inverse correlation between high anti-GAS-PS antibody titres and GAS infection cases. Recent studies show that a chemically synthesized core polysaccharide-based antigen may represent an antigenic structural determinant of the large polysaccharide. Based on GAS-PS structural analysis, the study evaluates the potential to exploit a synthetic design approach to GAS vaccine development and compares the efficiency of synthetic antigens with the long isolated GAS polysaccharide. Synthetic GAS-PS structural analogues were specifically designed and generated to explore the impact of antigen length and terminal residue composition. For the HIV-1 glycoantigens, the dense glycan shield on the surface of the envelope protein gp120 was chosen as a target. This shield masks conserved protein epitopes and facilitates virus spread via binding to glycan receptors on susceptible host cells. The broadly neutralizing monoclonal antibody 2G12 binds a cluster of high-mannose oligosaccharides on the gp120 subunit of HIV-1 Env protein. This oligomannose epitope has been a subject to the synthetic vaccine development. The cluster nature of the 2G12 epitope suggested that multivalent antigen presentation was important to develop a carbohydrate based vaccine candidate. I describe the development of neoglycoconjugates displaying clustered HIV-1 related oligomannose carbohydrates and their immunogenic properties.

Analisi e confronto di sistemi informatici per la programmazione operativa dei lavori: il caso del "People Mover" di Bologna

l’analiticità del metodo adottato ha permesso di ottenere una precisa e puntuale conoscenza del processo costruttivo, ottimo esempio per poter analizzare e confrontare i due programmi, Ms-Project 2007 e Primavera Project Planner P6.0, oggetto della presente trattazione; per comprendere quale software aiuta il Project Manager a gestire le complessità di un progetto per soddisfare i bisogni dei clienti, ad avere un controllo più stretto sulle strutture di progetto e sui suoi requisiti di rendicontazione, nonché la comprensione di tutto ciò che può ostacolare il corretto avanzamento del programma. Quale programma aiuta le aziende a pianificare e gestire sia i singoli progetti sia il programma complessivo, a implementare e monitorare i livelli di performance necessari e valutare agevolmente l’impatto delle modifiche di programma sui piani di lavoro, sui budget, sull’utilizzazione delle risorse. Un’efficace visione d’insieme dell’intero programma, combinata con la continua verifica delle metriche di produttività, consente ai program manager di mitigare proattivamente i rischi e ottenere come risultato il puntuale rispetto dei tempi e del budget.

The immunogenicity of chemically derived zwitterionic polysaccharides

Bacterial capsular polysaccharides (PS) which naturally contain zwitterionic charge motifs (ZPS) possess specific immunostimulatory activity, leading to direct activation of antigen-presenting cells (APCs) through Toll-like receptor 2 (TLR2) and of T cells in co-culture systems. When administered intraperitoneally, ZPS and bacteria expressing them are involved in the induction or regulation of T-cell dependent inflammatory processes such as intra-abdominal abscess formation. Moreover it has been published that ZPSs are processed to low molecular weight carbohydrates and presented to T cells through a pathway similar to that used for protein antigens. These findings were in contrast with the paradigm according to which polysaccharides are T-independent antigens unable to be presented in association with MHC class II molecules and unable to induce a protective immune response. For this reason in glycoconjugate vaccines polysaccharides often need to be conjugated to a carrier protein to induce protection. The aim of our work was to generate vaccine candidates with antigen and adjuvant properties in one molecule by the chemical introduction of a positive charge into naturally anionic PS from group B streptococcus (GBS). The resulting zwitterionic PS (ZPS) has the ability to activate human and mouse APCs, and in mixed co-cultures of monocytes and T cells, ZPS induce MHC II-dependent T-cell proliferation and up-regulation of activation markers. TLR2 transfectants show reporter gene transcription upon incubation with ZPS and these stimulatory qualities can be blocked by anti-TLR2 mAbs or by the destruction of the zwitterionic motif. However, in vivo, ZPS used alone as vaccine antigen failed to induce protection against GBS challenge, a result which does not confirm the above mentioned postulate that ZPS are T-cell dependent Ags by virtue of their charge motif. Thus to make ZPS visible to the immune system we have conjugated ZPS with a carrier protein. ZPS-glycoconjugates induce higher T cell and Ab responses to carrier and PS, respectively, compared to control PS-glycoconjugates made with the native polysaccharide form. Moreover, protection of mothers or neonate offspring from lethal GBS challenge is better when mothers are immunized with ZPS-conjugates compared to immunization with PS-conjugates. In TLR2 knockout mice, ZPS-conjugates lose both their increased immunogenicity and protective effect after vaccination. When ZPS are co-administered as adjuvants with unconjugated tetanus toxoid (TT), they have the ability to increase the TT-specific antibody titer. In conclusion, glycoconjugates containing ZPS are potent vaccines. They target Ag to TLR2-expressing APCs and activate these APCs, leading to better T cell priming and ultimately to higher protective Ab titers. Thus, rational chemical design can generate potent novel PS-adjuvants with wide application, including glycoconjugates and co-administration with unrelated protein Ags.

Un piano territoriale per la riduzione della concentrazione di CO2 nell'atmosfera e la produzione energetica da fonti rinnovabili per mezzo della filiera delle biomasse

Il progetto propone uno studio per verificare la fattibilita' di un piano territoriale (ideato per il bacino del Po ma di fatto estendibile a tutti i bacini fluviali) per la creazione di una filiera di colture bioenergetiche (biomasse) che, trasportate per mezzo della navigazione fluviale (uno dei mezzi di trasporto a minore emissione di CO2), alimentino una o piu' centrali a nuova tecnologia che associno alla produzione di calore (teleriscaldamento e raffreddamento) e di energia la separazione dei fumi. La CO2 catturata dalla crescita delle biomasse e recuperata dalla combustione, puo' quindi essere segregata nel sottosuolo di aree costiere subsidenti contrastando il fenomeno dell’abbassamento del suolo. Ricavando benefici in tutti i passaggi di attuazione del piano territoriale (lancio dell'agricoltura bioenergetica, rilancio della navigazione a corrente libera, avvio di una economia legata alla logistica del trasporto e dello stoccaggio delle biomasse, generazione di energia pulita, lotta alla subsidenza) il progetto, di fatto, consente di catturare ingenti quantitativi di CO2 dall'atmosfera e di segregarli nel sottosuolo, riducendo l'effetto serra. Nel corso del Dottorato e' stata sviluppata una metodologia di valutazione della sostenibilita' economica ed ambientale del progetto ad un bacino fluviale, che consta di una modulistica di raccolta dei dati di base e di una procedura informatizzata di analisi.

Droga, alcol e lavoro: La prevenzione come promozione della salute

Lo scopo di questa dissertazione è quello di costruire un modello di promozione della salute nel contesto di lavoro in relazione al consumo di sostanze psicoattive fra lavoratori, attraverso il confronto tra la situazione italiana e inglese. L’ipotesi di fondo rimanda all’idea che i luoghi di lavoro possano rappresentare setting d’elezione per i progetti di prevenzione non solo perché alcuni studi dimostrano l’esistenza di fattori di rischio connessi alla mansione rispetto alle condotte relative allo stile di vita, ma anche perché il consumo di alcol e droghe è altamente diffuso tra i lavoratori e questo comporta rischi per la sicurezza e la salute personale nonché quella dei colleghi di lavoro. Si tratta quindi di indagare il rapporto tra contesto lavorativo e utilizzo di sostanze al fine di suggerire  alla luce degli studi internazionali in materia e delle riflessioni condotte dai soggetti coinvolti nella ricerca che si andrà a presentare  linee guida e indicazioni operative per la realizzazione di interventi di promozione alla salute nei contesti professionali. A tal fine, saranno analizzati gli esiti di 13 focus group che hanno coinvolto esperti italiani e 6 interviste somministrate a esperti inglesi volti a definire la situazione attuale in Italia e Gran Bretagna in materia di prevenzione del consumo di alcol e droghe nei luoghi di lavoro. In particolare, l’analisi verterà sulle seguenti aree: - Percezione circa la diffusione dei consumi nei luoghi di lavoro - Presentazione delle politiche adottate, in logica comparativa, tra i due paesi. - Analisi critica degli interventi e problematiche aperte. L’analisi del materiale empirico permette di delineare due modelli costruiti sulla base dei focus group e delle interviste: - in Italia si può affermare che prevalga il cd. modello della sicurezza: di recente trasformazione, questo sistema enfatizza la dimensione del controllo, tanto che si parla di sorveglianza sanitaria. É orientato alla sicurezza concepita quale rimozione dei fattori di rischio. Il consumo di sostanze (anche sporadico) è inteso quale espressione di una patologia che richiede l’intervento sanitario secondo modalità previste dal quadro normativo: una procedura che annulla la discrezionalità sia del datore di lavoro sia del medico competente. Si connota inoltre per contraddizioni interne e trasversali rispetto alle categorie lavorative (i controlli non si applicano alle professioni associate a maggiore prestigio sociale sebbene palesemente associate a rischio, come per esempio i medici) e alle sostanze (atteggiamento repressivo soprattutto verso le droghe illegali); - in Gran Bretagna, invece, il modello si configura come responsabilità bilaterale: secondo questo modello, se è vero che il datore di lavoro può decidere in merito all’attuazione di misure preventive in materia di alcol e droghe nei luoghi di lavoro, egli è ritenuto responsabile della mancata vigilanza. D’altro canto, il lavoratore che non rispetta quanto previsto nella politica scritta può essere soggetto a licenziamento per motivi disciplinari. Questo modello, particolarmente attento al consumo di tutte le sostanze psicoattive (legali e illegali), considera il consumo quale esito di una libera scelta individuale attraverso la quale il lavoratore decide di consumare alcol e droghe così come decide di dedicarsi ad altre condotte a rischio. Si propone di ri-orientare le strategie analizzate nei due paesi europei presi in esame attraverso la realizzazione di un modello della promozione della salute fondato su alcuni punti chiave: – coinvolgimento di tutti i lavoratori (e non solo coloro che svolgono mansioni a rischio per la sicurezza) al fine di promuovere benessere secondo un approccio olistico di salute, orientato ad intervenire non soltanto in materia di consumo di sostanze psicoattive (legali e illegali), ma più in generale sulle condotte a rischio; – compartecipazione nelle diverse fasi (programmazione, realizzazione e valutazione del progetto) del lavoratore, datore di lavoro e medico competente secondo una logica di flessibilità, responsabilizzazione condivisa fra i diversi attori, personalizzazione e co-gestione dell’intervento; – azione volta a promuovere i fattori di protezione agendo simultaneamente sul contrasto dei fattori di rischio (stress, alienazione, scarso riconoscimento del ruolo svolto), attraverso interventi che integrano diverse strategie operative alla luce delle evidenze scientifiche (Evidence-Based Prevention); – ricorso a strumenti di controllo (drug testing) subordinato all’esigenza di tutelare l’incolumità fisica del lavoratore e dei colleghi, da attuarsi sempre e comunque attraverso prassi che non violino la privacy e attraverso strumenti in grado di verificare l’effettivo stato di alterazione psico-fisica sul luogo di lavoro; – demedicalizzazione delle situazioni di consumo che non richiedono un intervento prettamente sanitario, ma che al contrario potrebbero essere affrontate attraverso azioni incentrate sul care anziché la cure; – messa a disposizione di servizi ad hoc con funzione di supporto, counselling, orientamento per i lavoratori, non stigmatizzanti e con operatori di formazione non solamente sanitaria, sull’esempio degli EAPs (Employee Assistence Programs) statunitensi. Si ritiene che questo modello possa trasformare i contesti di lavoro da agenzie di controllo orientate alla sicurezza a luoghi di intervento orientati al benessere attraverso un’azione sinergica e congiunta volta a promuovere i fattori di protezione a discapito di quelli di rischio in modo tale da intervenire non soltanto sul consumo di sostanze psicotrope, ma più in generale sullo stile di vita che influenza la salute complessiva.