Padrões isoenzimáticos e morfologia de isolados de Alternaria spp. patogênicos a Senna obtusifolia

Isolados de Alternaria spp. patogênicos ao fedegoso (Senna obtusifolia) foram estudados quanto aos aspectos morfológicos e padrões isoenzimáticos, em gel de poliacrilamida. Com base nas características culturais, morfologia de colônias e morfometria de conídios, verificou-se que 11 dos 13 isolados pertenciam à espécie A. cassiae e os outros dois à A. alternata. Os resultados da análise eletroforética corroboraram as informações obtidas por meio de critérios morfológicos. Portanto, esta técnica tem potencial para ser usada na separação destas espécies de Alternaria. A ocorrência de mais de uma espécie deste gênero fúngico em S. obtusifolia foi constatada, ampliando o número de patógenos a serem avaliados no programa de desenvolvimento de um bioherbicida para esta espécie de planta daninha.

Inoculação artificial de colmos de milho em diferentes idades e concentrações de inóculo e sua relação com a expressão da resistência a fusarium moniliforme

A podridão do colmo de milho (Zea mays) causada por Fusarium moniliforme tem ocorrência generalizada nas regiões produtoras do Brasil. Visando obter informações sobre o comportamento da doença, foram conduzidos dois experimentos em campo, um inoculando-se artificialmente colmo de plantas aos 30, 55 e 80 dias após a semeadura, e outro testando-se diferentes concentrações de inóculo, 1x10(4), 5x10(5) e 1x10(7) conídios/ml, aplicadas aos 55 dias após a semeadura. Nesses experimentos utilizou-se o delineamento de blocos ao acaso, com respectivamente, quatro e cinco repetições, sendo cada parcela constituída de 50 plantas. As inoculações foram feitas no centro do segundo entrenó alongado acima do solo. A avaliação da doença foi realizada aos 120 dias após a semeadura, com base na sintomatologia interna do colmo, utilizando uma escala de notas variando de 1 a 9. Por ocasião da colheita foram avaliados o número de plantas acamadas e a produção de grãos. Procedeu-se também a análise do teor de lignina e tanino da casca e da parte interna do entrenó inoculado nos diferentes tratamentos. Todas as concentrações de inóculo testadas permitiram diferenciar os níveis de resistência dos híbridos, sendo estes decrescentes a partir do Cargill 333 para o Cargill 901, tendo o Dina 766 um comportamento intermediário. Por outro lado, não houve diferenças significativas para as inoculações em diferentes épocas. Os teores de taninos não foram significativamente diferentes entre os híbridos, já o teor de lignina foi significativamente relacionado com o nível de resistência dos três híbridos avaliados.

Variabilidade genética de isolados do complexo Colletotrichum associados a sementes de algodoeiro, por meio de técnicas moleculares e inoculação em plantas

A antracnose e a ramulose são doenças do algodoeiro (Gossypium hirsutum) causadas, respectivamente, por Colletotrichum gossypii e C. gossypii var. cephalosporioides, sendo a ramulose a mais importante sob o ponto de vista de prejuízos causados. Por se tratarem de fungos transmitidos por sementes, de difícil diferenciação por métodos convencionais, o desenvolvimento de metodologia usando técnicas moleculares é uma opção que se dispõe na busca de maior precisão e rapidez. O presente trabalho objetivou associar informações do teste de patogenicidade com marcadores bioquímicos e moleculares de DNA/RAPD, visando a identificação e diferenciação do complexo Colletotrichum. Foram usados dez isolados, sendo três classificados como causadores de antracnose e sete de ramulose, pelo teste de patogenicidade. Os marcadores bioquímicos não se mostraram eficientes para a distinção dos isolados causadores da ramulose e da antracnose. Na análise de RAPD, o valor de similaridade encontrado para os dois grupos foi de 51,7%, confirmando a potencialidade da técnica para diferenciar tais fungos.

Virulência, atividade enzimática e padrões de isoesterases de isolados de Pyrenophora chaetomioides, agente etiológico da mancha de grãos e folhas de aveia

A complexidade da população de Pyrenophora chaetomioides, principal agente causal da mancha da folha e do grão de aveia (Avena sativa) no Sul do Brasil, é pouco conhecida. Deste modo, estudos envolvendo a variabilidade da população do patógeno embasarão o desenvolvimento de variedades resistentes. Para a realização deste trabalho, foram selecionados oito isolados de P. chaetomioides a partir de sementes de aveia dos três estados do sul do Brasil. Para testar a virulência, os isolados foram inoculados em seis variedades de aveia, avaliando-se a severidade e o tipo de lesão. Todas as variedades de aveia testadas foram suscetíveis aos isolados, embora variações na intensidade de doença tenham sido observadas. Os isolados foram avaliados quanto às suas características amilolíticas, proteolíticas e lipolíticas, utilizando-se meios sólidos para análise destes complexos enzimáticos. O estudo da caracterização enzimática dos isolados revelou a associação de uma alta atividade enzimática com os isolados mais virulentos. Já a análise dos padrões isoenzimáticos de alfa e beta esterases mostrou alta variabilidade entre os isolados com sete perfis distintos identificados mas sem relação com a virulência em plântulas de aveia.

Uso de marcadores RAPD na classificação de isolados de Phytophthora spp. causadores da podridão parda do cacaueiro no Brasil

Objetivou-se neste trabalho propor uma metodologia para a utilização de marcadores RAPD como uma ferramenta auxiliar na classificação de isolados de Phytophthora spp. causadores da podridão-parda do cacaueiro (Theobroma cacao) no Brasil. Existe uma necessidade constante de monitorar populações de Phytophthora spp. nas regiões cacaueiras do Brasil e a tarefa de classificação dos isolados é difícil e demorada. Com base em estudos de diversidade genética de isolados de Phytophthora capsici, P. palmivora e P. citrophthora por meio de marcadores RAPD, foram escolhidos três isolados de cada espécie como padrões e dois "primers" decâmeros mais informativos na diferenciação das espécies (OPA 13 e OPH 18). O DNA genômico dos isolados padrões e de três isolados não classificados foi extraído e amplificado, utilizando-se os dois "primers" decâmeros mais informativos. Os padrões de marcadores RAPD obtidos permitiram uma diferenciação visual clara dos isolados de cada espécie e mostraram-se úteis na classificação de isolados de Phytophthora spp. A metodologia proposta já está sendo utilizada no Centro de Pesquisas do Cacau, solucionando eventuais dúvidas resultantes da caracterização morfológica dos isolados.

Herança da resistência genética do caupi à cercosporiose

A cercosporiose do caupi (Vigna unguiculata), causada por Cercospora cruenta, constitui importante problema sanitário para a cultura e o seu controle é mais eficiente com o uso da resistência genética. Portanto, o conhecimento do tipo de herança é essencial para o melhoramento visando resistência a esta doença. O trabalho foi realizado em condições de campo, utilizando-se a linhagem resistente L101000-1 e a cultivar suscetível IPA 206. A hibridação foi efetuada entre plantas dos dois genótipos e através da técnica de emasculação de flores, foram obtidas as populações F1, F2 e F3. As gerações paternais e segregantes foram plantadas e inoculadas três vezes, as inoculações foram realizadas aos 20, 27 e 34 dias do plantio. A suspensão contendo 4x10³ con/ml do fungo foi preparada a partir da coleta de conídios em lesões de folhas infetadas. A avaliação dos sintomas, em plantas individuais, foi realizado aos 75 dias após o plantio, com base na reação de resistência ou suscetibilidade. As plantas da linhagem L101000-1 e a população F1 comportaram-se como resistentes, enquanto que as da cultivar IPA 206 apresentaram sintomas típicos da cercosporiose. Na geração F2, das 132 plantas observadas, 105 foram resistentes e 27 suscetíveis e na geração F3, das 90 plantas avaliadas, 70 foram resistentes e 20 suscetíveis. Estes resultados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado e sugerem que a herança da resistência a C. cruenta, na cultivar L101000-1, é do tipo monogênica e dominante.

Diversidade genética de isolados de Phytophthora capsici de diferentes hospedeiros com base em marcadores RAPD, patogenicidade e morfologia

Phytophthora capsici é uma espécie onívora com vários hospedeiros cultivados na Bahia. Variações morfológicas ocorrem entre isolados de cacaueiro (Theobromae cacao), seringueira (Hevea brasiliensis) e pimenta-do-reino (Piper nigrum), todos classificados como P. capsici. Utilizaram-se marcadores RAPD e reações de patogenicidade para estudar a diversidade genética dentro desta espécie. Foram analisados 22 isolados sendo, oito de cacau, oito de seringueira, três de pimentão (Capsicum annuum) (dois antigos e um recente), um de abóbora (Cucurbita moschata), um de tomate (Lycopersicon esculentum) e um de pimenta-do-reino. Os isolados de pimentão, abóbora e tomate foram obtidos em Minas Gerais, o de pimenta-do-reino no Pará e, os demais, na Bahia e Espírito Santo. O DNA genômico de cada isolado foi extraído e amplificado utilizando-se oito primers decâmeros, os quais geraram 123 marcadores RAPD. Distâncias genéticas e análises de agrupamento permitiram a diferenciação de três grupos: o primeiro formado por isolados de cacaueiro, o segundo por sete dos oito isolados de seringueira e o terceiro por dois isolados de pimentão (antigos). Os isolados de tomate, pimenta-do-reino, pimentão (recente), o de abóbora e um de seringueira mostraram-se distantes geneticamente dos demais. Inoculações em frutos de cacau, seringueira, tomate e pimentão, com e sem ferimento, mostraram que o isolado de seringueira que não agrupou com os demais foi o menos virulento dos isolados testados, não causando lesões em frutos de seringueira sem ferimento. Frutos de pimentão só foram infetados por isolados de tomate e pimentão, enquanto os frutos de cacau foram infetados por todos os isolados testados. A manutenção de todos os grupos dentro de P. capsici é discutida.

Expressão em Escherichia coli da proteína capsidial do Watermelon mosaic virus e produção de anti-soro

Um anti-soro policlonal específico para Watermelon mosaic virus (WMV) foi produzido por meio da imunização de coelhos com proteína capsidial purificada, expressa in vitro em células de Escherichia coli. O gene cp foi amplificado via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, a partir de RNA viral extraído de preparações virais concentradas. O fragmento amplificado foi clonado em pBLUESCRIPT KS+ e completamente seqüenciado para confirmação de sua identidade e integridade. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-A. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína capsidial em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni+-NTA, a partir de proteínas totais extraídas de E. coli. Uma vez purificada, a proteína foi quantificada e utilizada para imunização dos coelhos. O anti-soro foi testado quanto a sua especificidade e sensibilidade em testes de Western blot, DAS-ELISA, imunodifusão e ELISA indireto. Todos os testes demonstraram que o anti-soro produzido a partir da expressão in vitro da proteína capsidial é altamente específico para a detecção do WMV em extratos foliares, não tendo sido observada nenhuma reação heteróloga interespecífica.

Caracterização e diversidade genética de isolados de Phytophthora spp. do cacaueiro com base em marcadores RAPD

Objetivou-se neste trabalho estudar a diversidade genética entre isolados das três principais espécies do gênero Phytophthora causadoras da podridão-parda do cacaueiro (Theobroma cacao) no Brasil, utilizando marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados 22 isolados de Phytophthora spp., sendo oito de P. capsici, cinco de P. palmivora e nove de P. citrophthora. DNA genômico de cada isolado foi extraído e amplificado utilizando-se sete "primers" decâmeros, os quais geraram 191 marcadores RAPD. Distâncias genéticas e análises de agrupamento realizadas com base nestes marcadores permitiram uma diferenciação clara dos isolados de cada espécie e mostraram diferentes níveis de diversidade intra-específica. Ficou evidente o potencial dos marcadores RAPD como uma ferramenta auxiliar na classificação dos isolados e, também, em estudos de diversidade genética intra-específica.

Marcadores morfofisiológicos e isoenzimáticos na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas. Este fator dificulta sua diferenciação em sementes, particularmente quando ocorrem simultaneamente. A análise de isoenzimas tem possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos no diagnóstico de fitopatógenos em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho (Zea mays), provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras por meio da análise de nove marcadores morfofisiológicos e de cinco sistemas isoenzimáticos (aldolase, esterase, fosfatase ácida, fosfatase alcalina e malato desidrogenase). Objetivou-se ainda diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio das técnicas citadas. A eletroforese de isoenzimas forneceu um total de 28 bandas polimórficas. Aspectos como pigmentação da colônia, velocidade e taxa de crescimento, produção de massa e densidade miceliais, e a análise isoenzimática tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 0% e 89,5%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade fenotípica com a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Análise da variabilidade genética de duas cultivares Raminad Str. 3 utilizadas como diferenciadoras de raças de Pyricularia grisea

O conhecimento sobre a ocorrência e distribuição de raças do fungo Pyricularia grisea é um importante aspecto a ser considerado em programas de melhoramento genético de arroz (Oryza sativa). No entanto, para que a identificação das raças seja correta e passível de comparações com outros levantamentos é necessário que os genótipos utilizados apresentem as mesmas características genéticas. O presente trabalho foi realizado com os objetivos de comparar a variação genética entre dois genótipos identificados como pertencentes à cultivar Raminad Str. 3, que é uma das oito cultivares utilizadas como direnciadoras de raças de P. grisea, e examinar a composição de raças deste fungo no estado do Rio Grande do Sul. Constatou-se a amplificação de fragmentos polimórficos em 20 dos 39 marcadores microssatélites utilizados para verificar a pureza genética de dois genótipos de arroz identificados como sendo a cultivar Raminad Str. 3. A identificação das raças baseou-se na reação das oito cultivares diferenciadoras de raças submetidas à inoculação com 85 isolados monospóricos de P. grisea, provenientes de 14 municípios produtores de arroz no Rio Grande do Sul. A avaliação do grau de infecção foi realizada de acordo com a escala preconizada pelo sistema internacional de avaliação de doenças do arroz, 14 dias após a inoculação.

Marcadores RAPD na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas, o que dificulta sua diferenciação em sementes de milho (Zea mays), particularmente quando ocorrem simultaneamente. Técnicas moleculares de análise do DNA têm possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis eespecíficos no diagnóstico de fitopatógenos, em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho, provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras, por meio da análise do DNA genômico (RAPD). Objetivou-se ainda, diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio da técnica citada. Pela análise do DNA, 25 primers Operon geraram polimorfismos, os quais tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 3,4% e 44,4%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade genotípica e a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Distribuição do elemento transponível impala em isolados de fusarium oxysporum patogênicos e não-patogênicos ao feijoeiro

A variabilidade genética de 20 isolados de Fusarium oxysporum, nove não-patogênicos e 11 patogênicos ao feijoeiro (Phaseouls vulgaris), foi determinada com base na distribuição do elemento transponível impala. A presença de impala das subfamílias D e E foi determinada por experimentos de PCR, empregando oligonucleotídeos específicos para cada subfamília. Foi observada a presença de representantes das duas subfamílias na maioria dos isolados, sugerindo, portanto, que impala é um antigo componente do genoma de F. oxysporum f. sp. phaseoli. A hibridização do DNA total de cada isolado, clivado com a enzima EcoRI, com um fragmento do elemento impala da subfamíla E, mostrou uma variação nos padrões de bandas dos isolados não-patogênicos, indicando a possível atividade desses elementos. No entanto, no caso dos isolados patogênicos, foram observados padrões de bandas mais homogêneas e alguns isolados apresentaram o mesmo perfil de bandas, indicando que se trata de cópias de impala que, possivelmente, não são mais capazes de sofrer transposição. Estas cópias inativas são excelentes marcadores genéticos. Um dos isolados patogênicos, Fus4, não apresentou cópias endógenas de impala, o que torna esse isolado um candidato para experimentos de mutagênese insercional usando o vetor pNI160, que possui o elemento impala ativo interrompendo o gene niaD, que codifica a enzima nitrato redutase.

Expressão da resistência de variedades de banana à Sigatoka-amarela

A Sigatoka-amarela, causada por Mycosphaerella musicola / Pseudocercospora musae, continua sendo um grande problema para a bananicultura brasileira, com o agravante do agente causal apresentar alta variabilidade patogênica entre os isolados do fungo. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um tipo de reação que tem sido observado entre as variedades de banada (Musa spp.) resistentes à Sigatoka-amarela. Os trabalhos vêm sendo conduzidos em condições de telado com inoculação artificial de diferentes isolados de M. musicola sobre um grupo de variedades, composto por Pacovan, Prata Anã, Thap Maeo, Caipira, Grande Naine, Terra e Pioneira. Em inoculações realizadas nessas variedades, envolvendo cerca de 38 isolados de M. musicola, apenas a variedade Terra, não teve seu mecanismo de resistência superado por alguns deles. Parte desses isolados foi também inoculada nos genótipos JV03-15, PV03-44, FHIA-01 e FHIA-18. Observando a reação das variedades Caipira, Thap Maeo, Pioneira, Terra, JV03-15 e PV03-44, resistentes à maioria dos isolados, percebe-se um comportamento muito similar. Em todas elas, a reação pós-inoculação tem mostrado a formação de lesões em forma de pontos ou estrias pouco perceptíveis. A reação apresentada é semelhante a uma resposta hipersensível, havendo formação de lesão local, todavia de visualização tardia. O fenótipo apresentado tem características de uma resposta qualitativa, envolvendo um mecanismo de hipersensibilidade.

Diversidade genética de isolados de Rhizoctonia solani coletados em feijão-caupi no Estado de Roraima

O feijão-caupi (Vigna unguiculata) é uma das principais fontes de proteína para a população de baixa renda, principalmente nas Regiões Norte e Nordeste do Brasil. Esta leguminosa é suscetível a várias doenças incluindo a mela ou murcha-da-teia-micélica, cujo agente causal é o fungo Rhizoctonia solani (teleomorfo: Thanatephorus cucumeris). Embora Rhizoctonia solani seja um agente causal de doença muito importante, no Brasil inexiste qualquer informação sobre as características de seus isolados associados ao feijão-caupi. O objetivo do presente estudo foi avaliar, utilizando-se das técnicas Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) e RFLP-ITS (Internal Transcribed Spacer), a diversidade genética de isolados de R. solani coletados de plantas de feijão-caupi oriundas da região de cerrado e de mata do Estado de Roraima. Pelos resultados obtidos pode-se concluir que existe diversidade genética em R.. solani coletada de feijão-caupi e que os dois métodos moleculares utilizados foram eficientes em avaliar a divergência genética deste patógeno.