Understanding the role of CAP proteins in the polarization process of C. elegans

La division cellulaire asymétrique est un processus crucial dans le développement des organismes multicellulaires puisqu’elle permet la génération de la diversité cellulaire. Les cellules qui se divisent de façon asymétrique doivent tout d’abord se polariser et correctement orienter leur fuseau mitotique pour ségréger des déterminants cellulaires en deux entités distinctes. L’embryon du nématode C. elegans est un modèle robuste et largement utilisé pour étudier la division cellulaire asymétrique. Dans cet embryon, le point d'entrée du spermatozoïde détermine l'axe de polarité antéro-postérieur. Suite à la fécondation, le cortex embryonnaire est uniformément contractile et un complexe conservé formé des protéines PAR-3, PAR-6 et PKC-3 (nommé complexe PAR-3 ci-dessous) est localisé sur l'ensemble du cortex. La complétion de la méiose maternelle induit une relaxation corticale au postétieur et un flux cortical vers l’antérieur de l’embryon. Ces contractions corticales asymétriques mènent à la formation d'un domaine antérieur contenant le complexe PAR-3, tandis que le cortex postérieur, dont le complexe PAR-3 s’est délocalisé, est enrichi avec les protéines PAR-2 et PAR-1. Par conséquent, les domaines formés par les protéines PAR définissent un pôle antérieur et un pôle postérieur dans l'embryon suite au remodelage du cytosquelette. Les protéines PAR-4 et PAR-5 restent localisées de façon uniforme dans l'embryon. Curieusement, les protéines PAR exercent une régulation par rétroaction sur la contractilité corticale. Il a été montré qu’une des protéines PAR récemment identifiée, PAR-5, est orthologue à la protéine adaptatrice 14-3-3 et joue un rôle important dans la contractilité corticale. En dépit de son rôle central dans la contractilité corticale et le processus de polarisation cellulaire, le mécanisme par lequel PAR-5 régule la contractilité corticale n’est pas bien compris. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment PAR-5 et ses interacteurs contrôlent la régulation des contractions corticales et, de ce fait, la polarité cellulaire. Dans un essai de capture de la protéine GST (GST pull-down), nous avons identifié plusieurs nouveaux interacteurs de PAR-5. Parmi ceux-ci, nous avons trouvé CAP-2 (protéine de coiffage de l'actine), qui a été identifiée dans des éxpériences de capture de 14-3-3 dans trois systèmes modèles différents. CAP-2 est un hétérodimère des protéines CAP, qui sont impliquées dans la régulation de l'actine. Nous avons trouvé que la déplétion des protéines CAP par interférence à l’ARN dans des vers de type sauvage mène à une augmentation létalité embryonnaire, ce qui suggère que ces protéines jouent un rôle important dans le développement embryonnaire. L'imagerie en temps réel d'embryons déplétés pour les protéines CAP montre qu’ils ont une diminution des contractions corticales avec un sillon de pseudoclivage mois stable, suggérant un défaut dans la régulation du cytosquelette d'actine-myosine. Ceci a également été confirmé par la diminution de la vitesse et du nombre de foci de NMY-2::GFP. En outre, ces embryons montrent une légère diminution de la taille du croissant cortical de PAR-2 lors de la phase d’établissement de la polarité. Les embryons déplétés en CAP-2 montrent également un retard dans la progression du cycle cellulaire, mais le lien entre ce phénotype et la régulation des contractions corticales reste à être précisé. La caractérisation des protéines CAP, des régulateurs du remodelage du cytosquelette, permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire, et donc la division cellulaire asymétrique.

Identification de protéines impliquées dans la localisation des ARNm au niveau de l'appareil mitotique

La localisation des ARNm au niveau des microtubules et des centrosomes laisse voir le centrosome et le fuseau mitotique comme des complexes ribonucléoprotéiques. Cependant, le mécanisme de localisation des ARNm à ces différentes structures ainsi que leurs fonctions dans la régulation de la mitose restent encore incompris. L’objectif était ici de caractériser des protéines de liaison à l’ARN (RNA Binding Proteins, RBPs) fonctionnellement impliquées dans la localisation des ARNm mitotiques chez la Drosophile et d’évaluer la conservation de la fonction de ces RBPs dans les cellules humaines. La déplétion de RBPs par RNAi générée dans des Drosophiles mutantes résulte en des phénotypes distincts de localisation anormale de l’ARNm centrosomique cen et en des défauts mitotiques différents selon le RBP ciblé, suggérant des fonctions différentes de ces RBPs. De plus, dans les jeunes embryons, les RBPs Bru-2 et Mask semblent être fonctionnellement importants pour la mitose via la régulation de l’ARNm cen, donnant un aperçu de la possible fonction mitotique de RBPs dans la régulation d’un ARN centrosomique. De plus, il a été observé dans un criblage d’immunofluorescence dans des cellules HeLa en métaphase que HNRNPUL1 colocalise au fuseau et aux centrosomes. HNRNPUL1 pourrait être impliqué dans la régulation de l’ARNm CDR2 (orthologue de cen) puisque la déplétion de l’orthologue de HNRNPUL1 dans la Drosophile, CG30122, résulte en une localisation anormale de l’ARNm centrosomique cen.

Centrioles: active players or passengers during mitosis?

No funding agencies or grants indicated in the publication.

Climate Adaptation Finance Mechanisms: New Frontiers For Familiar Tools

Demands for mechanisms to pay for adaptation to climate risks have multiplied rapidly as concern has shifted from greenhouse gas mitigation alone to also coping with the now-inevitable impacts. A number of viable approaches to how to pay for those adjustments to roads, drainage systems, lifeline utilities and other basic infrastructure are emerging, though untested at the scale required across the nation, which already has a trillion-dollar deferred maintenance and replacement problem. There are growing efforts to find new ways to harness private financial resources via new market arrangements to meet needs that clearly outstrip public resources alone, as well as to utilize and combine public resources more effectively. To date, mechanisms are often seen through a specific lens of scale, time, and method, for example national versus local and public versus market-based means. The purpose here is to integrate a number of those perspectives and also to highlight the following in particular. Current experience with seemingly more pedestrian needs like stormwater management funding is in fact a learning step towards new approaches for broader adaptation needs, using re-purposed but existing fiscal tools. The resources raised from new large-scale market approaches for using catastrophe- and resiliency-bond-derived funds will have their use embodied and operationalized in many separate local and state projects. The invention and packaging of innovative projects—the pre-development phase—will be pivotal to better using fiscal resources of many types. Those efforts can be greatly aided or hindered by larger national and especially state government policy, regulatory and capital market arrangements. Understanding the path to integration of effort across these scales deserves much more attention. Examples are given of how federal, state and local roles are each dimensions of that frontier, how existing tools can apply in new ways and how smart project creation plays a role.

Improving safety and establishing episomal maintenance of Adeno-associated viral vectors

Adeno-associated viral (AAV) vectors are among the most widely used gene transfer systems in basic and pre-clinical research and have been employed in more than 160 clinical trials. AAV vectors are commonly produced in producer cell lines like HEK293 by co-transfection with a so-called vector plasmid and one (in this work) or two so-called helper plasmids. The vector plasmid contains the transgene cassette of interest (TEC) flanked by AAV’s inverted terminal repeats (ITRs) which serve as packaging signals, whereas the helper plasmid provides the required AAV and helper virus functions in trans. A pivotal aspect of AAV vectorology is the manufacturing of AAV vectors free from impurities arising during the production process. These impurities include AAV vector preparations that contain capsids containing prokaryotic sequences, e.g. antibiotic resistance genes originating from the producer plasmids. In the first part of the thesis we aimed at improving the safety of AAV vectors. As we found that encapsidated prokaryotic sequences (using the ampicillin resistance gene as indicator) cannot be re-moved by standard purification methods we investigated whether the producer plasmids could be replaced by Minicircles (MCs). MCs are circular DNA constructs which contain no functional or coding prokaryotic sequences; they only consist of the TEC and a short sequence required for production and purification. MC counterparts of a vector plasmid encoding for enhanced green fluorescent (eGFP) protein and a helper plasmid encoding for AAV serotype 2 (AAV2) and helper Adenovirus (Ad) genes were designed and produced by PlasmidFactory (Bielefeld, Germany). Using all four possible combinations of plasmid and MCs, single-stranded AAV2 vectors (ssAAV) and self-complementary AAV vectors (scAAV) were produced and characterized for vector quantity, quality and functionality. The analyses showed that plasmids can be replaced by MCs without decreasing the efficiency of vector production and vector quality. MC-derived scAAV vector preparations even exceeded plasmid-derived preparations, as they displayed up to 30-fold improved transduction efficiencies. Using MCs as tools, we found that the vector plasmid is the main source of encapsidated prokaryotic sequences. Remarkably, we found that plasmid-derived scAAV vector preparations contained a much higher relative amount of prokaryotic sequences (up to 26.1 %, relative to TEC) compared to ssAAV vector preparations (up to 2.9 %). By replacing both plasmids by MCs the amount of functional prokaryotic sequences could be decreased to below the limit of quantification. Additional analyses for DNA impurities other than prokaryotic sequences showed that scAAV vectors generally contained a higher amount of non-vector DNA (e.g. adenoviral sequences) than ssAAV vectors. For both, ssAAV and scAAV vector preparations, MC-derived vectors tended to contain lower amounts of foreign DNA. None of the vectors tested could be shown to induce immunogenicity. In summary we could demonstrate that the quality of AAV vector preparations could be significantly improved by replacing producer plasmids by MCs. Upon transduction of a target tissue, AAV vector genomes predominantly remain in an episomal state, as duplex DNA circles or concatemers. These episomal forms mediate long-term transgene expression in terminally differentiated cells, but are lost in proliferating cells due to cell division. Therefore, in the second part of the thesis, in cooperation with Claudia Hagedorn and Hans J. Lipps (University Witten/Herdecke) an AAV vector genome was equipped with an autonomous replication element (Scaffold/matrix attachment region (S/MAR)). AAV-S/MAR encoding for eGFP and a blasticidin resistance gene and a control vector with the same TEC but lacking the S/MAR element (AAV-ΔS/MAR) were produced and transduced into highly proliferative HeLa cells. Antibiotic pressure was employed to select for cells stably maintaining the vector genome. AAV-S/MAR transduced cells yielded a higher number of colonies than AAV-ΔS/MAR-transduced cells. Colonies derived from each vector transduction were picked and cultured further. They remained eGFP-positive (up to 70 days, maximum cultivation period) even in the absence of antibiotic selection pressure. Interestingly, the mitotic stability of both AAV-S/MAR and control vector AAV-ΔS/MAR was found to be a result of episomal maintenance of the vector genome. This finding indicates that, under specific conditions such as the mild selection pressure we employed, “common” AAV vectors persist episomally. Thus, the S/MAR element increases the establishment frequency of stable episomes, but is not a prerequisite.

A catástrofe pós-colonial: ler António Lobo Antunes «à rebours»

Le roman As Naus (Le retour des Caravelles) d’António Lobo Antunes propose une révision du passé historique portugais, en offrant une relecture de la Révolution du 25 avril 1974 comme événement traumatique et catastrophique. En effet, sur fond de guerre et de décolonisation africaine, l’auteur nous transmet une vision dysphorique du contexte révolutionnaire portugais, ceci en adoptant le point de vue des « retornados », ex-colons fuyant l’Afrique, revenant vers la mère Patrie : le Portugal. Nous assistons ainsi à une « navigation à contre-courant », celle où les « héros de jadis », relégués aux marges de la société portugaise, se transforment en personnages nomadiques et « border-line ». Dans ces conditions, l’espace des marges représente « l’envers du décor » de la société portugaise, un monde sens dessus dessous, où règnent la sauvagerie et l’abjection. C’est à travers ces motifs apocalyptiques que l’auteur touche à l’un des fondements de l’identité portugaise, à savoir, celle d’une grande Nation au centre d’un Empire.

Influencia del interés geopolítico de China en sus relaciones bilaterales con Camboya

La presente investigación tiene como objetivo analizar cómo las relaciones bilaterales entre China y Camboya son afectadas por el interés geopolítico chino, con el fin de demostrar que éste genera un fortalecimiento de sus relaciones puesto que además de suplir necesidades alimenticias, hídricas y en mano de obra barata, es el único país de la región del Sudeste Asiático que le permite a China tener acceso militar al Golfo de Tailandia y al Mar de China Meridional, donde se encuentra en desventaja con Estados Unidos. Así, se indica que la potencia asiática formula sus acuerdos bilaterales creando relaciones de dependencia por parte de países como Camboya para que este le entregue “obligatoriamente” lo que necesita. Esta investigación se llevará a cabo por medio de una monografía con un enfoque realista. Se utilizará el método de investigación cualitativo, que se servirá de fuentes primarias como los acuerdos bilaterales entre ambos Estados.

Entre el terrorismo y el terrorismo en red, un debate a propósito de los lobos solitarios en Estados Unidos (2001-2014)

El interés de esta disertación es otorgar una respuesta a la fenomenología del Lobo Solitario, que se alza como amenaza frente a los Estados, y es necesaria su correcta comprensión para poder contrarrestar sus efectos sobre la sociedad. De esta manera, se propone un debate entre los conceptos de terrorismo expuesto por un lado por Bruce Hoffman, y por el otro por Luis de la Corte Ibáñez, quienes aportarán herramientas de análisis para lograr entender la fenomenología. Para terminar proponiendo la teoría de redes, expuesta por Arquilla y Ronfeldt y Charles Perrow, como mecanismo de solución a la brecha conceptual existente, definiendo a los lobos solitarios a nivel operacional como nodos sin red, y a nivel de adoctrinamiento como redes de débil acople.

Contribución de la misión de naciones unidas en Guatemala – Minugua, a la promoción, defensa y garantía de los derechos de la población indígena guatemalteca (1994 a 2004)

El conflicto armado en Guatemala se originó por el abuso de poder, la desigualdad, la exclusión y la profunda discriminación, sobre todo hacia la población indígena, a la que se le han desconocido históricamente sus derechos y que fue la más afligida durante el conflicto. Lo que desembocó en el nacimiento de grupos al margen de la ley, cuyo propósito fue reivindicar los derechos de la población, así como la equidad y justicia social. El conflicto se caracterizó por la formación de grupos paramilitares, la violación al Derecho Internacional Humanitario, el elevado número de víctimas del conflicto, mayoritariamente indígenas y porque más del 85% de las violaciones a los derechos humanos fueron perpetradas por el Estado. Gracias a la voluntad política, al respaldo de la comunidad internacional, especialmente de la Organización de Naciones Unidas -ONU, y a los buenos oficios de la Comisión Nacional de Reconciliación – CNR, se lograron firmar los Acuerdos de Paz y dar fin a este cruento conflicto de más de 36 años. Las partes firmantes vieron la necesidad de que un ente autónomo e imparcial de Naciones Unidas, verificara el cumplimiento de La Misión de Naciones Unidas en Guatemala - MINUGUA contribuyó a la promoción, defensa y garantía de los derechos de la población indígena guatemalteca. Específicamente, incidió en el cumplimiento de los compromisos contenidos en el Acuerdo sobre Identidad y Derechos de los Pueblos Indígenas guatemaltecos –AIDPI, que fue suscrito el 31 de marzo de 1995, asimismo, contribuyó a la garantía del derecho a la justicia de la población indígena, lo que se evidenció en las acciones y el papel que desempeñó en los componentes de verdad, justicia y reparación.

A complexity-based diagnostic on the democratic unity roundtable mud: problems and alternatives (2008-2016)

Este trabajo exploratorio estudia al movimiento político Mesa de la Unidad Democrática (MUD), creada con el fin de oponerse la Gobierno socialista existente en venezuela. La crítica que este documento realiza, parte desde el punto de vista de la Ciencia de la Complejidad. Algunos conceptos clave de sistemas complejos han sido utilizados para explicar el funcionamiento y organización de la MUD, esto con el objetivo de generar un diagnóstico integral de los problemas que enfrenta, y evidenciar las nuevas percepciones sobre comportamientos perjudiciales que el partido tiene actualmente. Con el enfoque de la complejidad se pretende ayudar a comprender mejor el contexto que enmarca al partido y, para, finalmente aportar una serie de soluciones a los problemas de cohesión que presen

City & Spectacle: A Vision of Lisbon Before the 1755 Great Earthquake

City & Spectacle: a vision of pre-earthquake Lisbon consists of a virtual recrea on of the city of Lis- bon on the eve of the great earthquake of 1 November 1755, giving shape to a laboratory model for research into the city’s history. As its star ng point the project has the virtual recrea on of one the most emblema c of spaces from 18th century Lisbon, the Royal Opera House, which disappeared during the 1755 earthquake. The recrea on of the Opera House was developed in the scope of the commemora- ons of the 250th anniversary of the 1755 catastrophe as an a empt to restore this space of the highest ar s c quality to memory and to return it to the inventory of the Portuguese heritage of architectural history.1 Using Second Life® technology it was possible to put forward a model of both the struc- ture and interiors of the Opera House as well as its anima on combined with a small piece of the opera presented at the inaugura on of the building in April 1755. The public presenta on of this virtual model at the conference 1755: Catástrofe, memória e arte (1755: catastrophe, memory and art), which took place at the Centro de Estudos Compara- stas, Universidade de Lisboa, led to a debate on the study and cri cal analysis of documentary sources and their selec on and applica on on recrea ons using virtual world technology. It also emphasized the need to extend the research on pre-earthquake Lisbon.