Technology market transfer plan launch of DELIVES to E.U. Market©

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

In vitro evaluation of quinidine sensitivity in brazilian Plasmodium falciparum isolates: comparative analysis to quinine and chloroquine

Falciparum malaria represents a serious and an increasing world public health problem due to the acquired parasite's resistance to the most available drugs. In some endemic areas, quinidine, a diastereoisomer of the antimalarial quinine, has been employed for replacing the latter. In order to evaluate the use of quinidine as an alternative to the increasing loss of quinine effectiveness in Brazilian P. falciparum strains, as has been observed in the Amazon area, we have assayed quinidine, quinine and chloroquine. The in vitro microtechnique was employed. All isolates showed to be highly resistant to chloroquine. Resistance to quinine was not noted although high MIC (minimal inhibitory concentration) values have been observed. These data corroborate the decreasing sensitivity to quinine in strains from Brazil. Quinidine showed IC50 from 0.053 to 4.577 mumol/L of blood while IC50 from 0.053 to 8.132 mumol/L of blood was estimated for quinine. Moreover, clearance of the parasitemia was observed in concentrations lower than that used for quinidine in antiarrhythmic therapy, confirming our previous data. The results were similar to African isolate.

The role of complex chromosome translocations in leukemia

Resumo A tumorigénese é um processo de transformação celular que se desenrola tipicamente em várias etapas. Os diferentes níveis de evolução tumoral resultam da acumulação sucessiva de mutações genéticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutações podem manifestar-se sob a forma de alterações nucleotídicas pontuais ao nível da sequência de DNA, levando a uma desregulação da função proteíca ou à formação de proteínas não-funcionais, ou através de alterações cromossómicas numéricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes híbridos que resultam de translocações cromossómicas desempenham um importante papel no processo tumorigénico. Estes genes são transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fusão, o qual é traduzido numa proteína híbrida com função oncogénica. Frequentemente, os subtipos de doença leucémica estão associados com translocações cromossómicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e específicos. É disto exemplo a leucemia mielóide crónica, em que uma translocação recíproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz à formação de um gene de fusão BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doença, existe também uma pequena proporção de casos que apresenta translocações cromossómicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizações genómicas além das que estão implicadas na formação dos genes de fusão. Por vezes, os pontos de quebra estão também associados a delecções extensas de material genético que se pensa terem uma função importante na tumorigénese. No entanto, o papel destas regiões genómicas no desenvolvimento tumoral não tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertação foi o de determinar o potencial papel tumorigénico de alterações génicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocações cromossómicas complexas. Para a prossecução do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossómicos distintos associados com diferentes tipos de doença hematológica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblástica aguda de células B (2 casos), leucemia mielóide aguda, neoplasma mieloproliferativo e síndrome mielodisplásico/neoplasma ieloproliferativo, não classificável. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridação fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informação inicial da análise citogenética. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita às funções de controlo da proliferação celular e de regulação transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocações complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocação dicêntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de delecções extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocações estavam associadas com a presença de genes de fusão recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocações t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblástica aguda de células B e a leucemia mielóide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Através da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequência de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocação. Além dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequência de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo à sua haplo-insuficiência nas células com t(9;11;19). Através de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificámos que o gene CCDC94 é expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A análise informática da sequência prevista da proteína CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminoácidos com a proteína cwf16, envolvida na regulação do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Através da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expressão, e após a transfecção destes em culturas de linhas celulares in vitro, observámos que este gene codifica uma proteína de localização exclusivamente nuclear. A expressão ectópica da proteína CCDC94 diminuiu a progressão do ciclo celular e a proliferação das células em cultura. Inversamente, a supressão do transcrito do gene CCDC94 através de interferência de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferação celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferação e a progressão do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocações cromossómicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficiência de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a acção das proteínas de fusão para proporcionar ao clone leucémico uma proliferação celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados não foram identificados genes de fusão. Ao invés, todos aqueles apresentaram delecções de extensão variável associadas com os pontos de quebra cromossómicos. No caso com t(12;6;15), identificámos uma delecção de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminação de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrição que é essencial para a formação das diferentes linhagens hematopoiéticas na medula óssea, enquanto CDKN1B é traduzido numa proteína responsável por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferação celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultânea de ETV6 e de CDKN1B, através de uma translocação cromossómica complexa, constituiu uma acção cooperativa na leucemogénese. A mesma noção pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrição importantes na linhagem hematopoiética, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossómico. Dado que o factor de transcrição PAX5 regula negativamente a expressão do gene FLT3, que desempenha uma função pró-proliferativa, é expectável que a haplo-insuficiência de PAX5 no caso com dic(9;12) terá tido como consequência uma elevação dos níveis de expressão de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferação celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitémia essencial (TE), uma doença que está intimamente relacionada com alterações de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, através da utilização de um array genómico, identificámos a presença de pequenas delecções associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a delecção tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam proteínas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiéticas. Dado que NFATC2 se localiza numa região que constitui um alvo frequente de delecções em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitémia essencial,efectuámos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferação megacariocítica e na regulação da expressão de uma citocina hematopoiética (GM-CSF), implicada na maturação das diferentes linhagens mielóides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitémia essencial, verificámos que a supressão do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferência de RNA, estava associada com um aumento da proliferação celular. Em concordância, o bloqueio da activação da proteína NFATC2 através de um inibidor específico da sua interacção com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferação celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produção do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrição NFATC2 pode regular negativamente a expressão de GM-CSF em células de trombocitémia essencial. No geral, estes resultados mostram que a redução dos níveis fisiológicos do transcrito NFATC2, ou a redução da respectiva actividade proteica, estão relacionados com a proliferação de megacariocitos através do aumento da produção de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificámos que as células dos doentes com TE apresentam níveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a população normal. Dado que o factor de transcrição MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, é plausível que a haplo-insuficiência dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossómico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patogénese da trombocitémia essencial através da alteração do padrão normal de expressão das citocinas hematopoiéticas. Em síntese, efectuámos nesta dissertação um estudo citogenético de 4 translocações cromossómicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocação dicêntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematológicos. Em casos seleccionados efectuámos também um estudo molecular detalhado das regiões dos pontos de quebra. Esta análise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficiência pode promover o aumento da proliferação celular das células leucémicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noções principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocações complexas associadas com a formação de genes de fusão, podem ter como consequência a desregulação de genes controladores da proliferação celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocações complexas caracterizadas pela ausência de genes de fusão recorrentes poderão estar preferencialmente associadas com a presença de delecções, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situações, serão necessários pelo menos 2 genes com funções celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemogénese. Nestes termos, o modelo de alterações genéticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substituído por um modelo em que vários genes-alvo são simultaneamente desregulados pela formação de uma translocação cromossómica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrência de alterações genéticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.

Identification of Cryptosporidium spp. oocysts in fecal smears stained with Heidenhain's iron hematoxylin

There is no paucity of methods for diagnosing Cryptosporidium spp. infection. The merits of immunoassays notwithstanding, microscopic identification of Cryptosporidium spp. oocysts in fecal samples remains an important diagnostic procedure. It owes the persistence of its use to such characteristics as dispensing with expensive equipment and kits, requiring only basic laboratory facilities, and having a low probability of false positive results when permanent slides are prepared, which can be re-examined in case of doubt. Cryptosporidium spp. oocysts can be readily identified in fecal smears prepared according to a regressive iron hematoxylin staining technique. The number of steps and their duration, as well as costs, were reduced to a minimum without loss of image quality and permanence of the preparations.

Presence of Leishmania amastigotes in peritoneal fluid of a dog with leishmaniasis from Alagoas, Northeast Brazil

The goal of this short communication is to report the uncommon presence of intracellular amastigotes of Leishmania in peritoneal fluid of a dog with leishmaniasis from Alagoas State, Brazil. Physical examination of an adult male rottweiler suspected to be suffering of leishmaniasis revealed severe loss of weight, ascitis, splenomegaly, moderately enlarged lymph nodes, onychogryphosis, generalized alopecia, skin ulcers on the posterior limbs, and conjunctivitis. Samples of bone marrow, popliteal lymph node, skin ulcer, and peritoneal fluid were collected and smears of each sample were prepared and stained with hematoxylin and eosin. Numerous amastigotes were detected in bone marrow, popliteal lymph node, and skin ulcer smears. Smears of peritoneal fluid revealed the unusual presence of several free and intracellular amastigotes of Leishmania. Future studies are needed to determine whether the cytology of ascitic fluid represents a useful tool for diagnosis Leishmania infection in ascitic dogs, particularly in those living in areas where canine leishmaniasis is enzootic.

Occurrence of antibodies against Leptospira spp. in horses of the urban area of Londrina, Paraná, Brazil

A total of 320 horses were studied in this paper, both male and female, between two and 17 years of age, which were used for traction of wagons in the urban area of the municipality of Londrina (PR). These animals were kept, after their daily work, in abandoned areas or plots, in the outskirts of the urban area of the city. When these animals were attended by the veterinarians, between 1996 and 2005, none of them presented symptoms suggesting leptospirosis. The most frequent reasons for the visit were loss of weight, unwillingness for work, parasitism, laminess, and wounds. Microscopic Seroagglutination Test (SAM), with 22 Leptospira serovars, was performed in sera sample from all these animals. The aim of this study was to investigate the occurrence of antibodies against Leptospira spp. in horses from the urban area of Londrina (PR). From the samples tested, 214 (66.88%) were considered positive, with titers between 100 and 3200, being that 49 (22.90%) presented antibodies against a single serovar of Leptospira, and 165 (77.10%) samples presented antibodies against two or more serovars simultaneously, where in 88 (53.33%) it was possible to characterize the most likely probable serovar. Antibodies against the serovar Icterohaemorrhagiae were detected in 32 (23.36%) animals.

Use of a fluorescence-based approach to assess short-term responses of the alga Pseudokirchneriella subcapitata to metal stress

This work explores the use of fluorescent probes to evaluate the responses of the green alga Pseudokirchneriella subcapitata to the action of three nominal concentrations of Cd(II), Cr(VI), Cu(II) and Zn(II) for a short time (6 h). The toxic effect of the metals on algal cells was monitored using the fluorochromes SYTOX Green (SG, membrane integrity), fluorescein diacetate (FDA, esterase activity) and rhodamine 123 (Rh123, mitochondrial membrane potential). The impact of metals on chlorophyll a (Chl a) autofluorescence was also evaluated. Esterase activity was the most sensitive parameter. At the concentrations studied, all metals induced the loss of esterase activity. SG could be used to effectively detect the loss of membrane integrity in algal cells exposed to 0.32 or 1.3 μmol L−1 Cu(II). Rh123 revealed a decrease in the mitochondrial membrane potential of algal cells exposed to 0.32 and 1.3 μmol L−1 Cu(II), indicating that mitochondrial activity was compromised. Chl a autofluorescence was also affected by the presence of Cr(VI) and Cu(II), suggesting perturbation of photosynthesis. In conclusion, the fluorescence-based approach was useful for detecting the disturbance of specific cellular characteristics. Fluorescent probes are a useful diagnostic tool for the assessment of the impact of toxicants on specific targets of P. subcapitata algal cells.

Impact of multi-metals (Cd, Pb and Zn) exposure on the physiology of the yeast Pichia kudriavzevii

Metal contamination of the environment is frequently associated to the presence of two or more metals. This work aimed to study the impact of a mixture of metals (Cd, Pb and Zn) on the physiology of the non-conventional yeast Pichia kudriavzevii. The incubation of yeast cells with 5 mg/l Cd, 10 mg/l Pb and 5 mg/l Zn, for 6 h, induced a loss of metabolic activity (assessed by FUN-1 staining) and proliferation capacity (evaluated by a clonogenic assay), with a small loss of membrane integrity (measured by trypan blue exclusion assay). The staining of yeast cells with calcofluor white revealed that no modification of chitin deposition pattern occurred during the exposure to metal mixture. Extending for 24 h, the exposure of yeast cells to metal mixture provoked a loss of membrane integrity, which was accompanied by the leakage of intracellular components. A marked loss of the metabolic activity and the loss of proliferation capacity were also observed. The analysis of the impact of a single metal has shown that, under the conditions studied, Pb was the metal responsible for the toxic effect observed in the metal mixture. Intracellular accumulation of Pb seems to be correlated with the metals' toxic effects observed.

Responses of the alga Pseudokirchneriella subcapitata to long-term exposure to metal stress

The green alga Pseudokirchneriella subcapitata has been widely used in ecological risk assessment, usually based on the impact of the toxicants in the alga growth. However, the physiological causes that lead algal growth inhibition are not completely understood. This work aimed to evaluate the biochemical and structural modifications in P. subcapitata after exposure, for 72 h, to three nominal concentrations of Cd(II), Cr(VI), Cu(II) and Zn(II), corresponding approximately to 72 h-EC10 and 72 h-EC50 values and a high concentration (above 72 h-EC90 values). The incubation of algal cells with the highest concentration of Cd(II), Cr(VI) or Cu(II) resulted in a loss of membrane integrity of ~16, 38 and 55%, respectively. For all metals tested, an inhibition of esterase activity, in a dose-dependent manner, was observed. Reduction of chlorophyll a content, decrease of maximum quantum yield of photosystem II and modification of mitochondrial membrane potential was also verified. In conclusion, the exposure of P. subcapitata to metals resulted in a perturbation of the cell physiological status. Principal component analysis revealed that the impairment of esterase activity combined with the reduction of chlorophyll a content were related with the inhibition of growth caused by a prolonged exposure to the heavy metals.

Process engineering of liver cells for drug testing applications

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Bioengenharia

Is Intrauterine Growth Appropriate to Monitor Postnatal Growth of Preterm Neonates?

When using the useful 2013 Fenton Chart, data should be interpreted with caution taking into account two aspects: the physiologic loss of body water after birth for the weight curves, and the questionable accuracy of the birth length curves considering the heterogeneity and reliability of the methods used in the original measurements.

ULTRASTRUCTURAL CHANGES IN Schistosoma mansoni MALE WORMS AFTER in vitro INCUBATION WITH THE ESSENTIAL OIL OF Mentha x villosa Huds

Introduction: The essential oil Mentha x villosa (MVEO) has a wide range of actions, including antibacterial, antifungal, antiprotozoal and schistosomicidal actions. The present study aimed to investigate the ultrastructural changes of MVEO on the tegument of adult Schistosoma mansoni. Materials and Methods: Different concentrations of MVEO were tested on S. mansoni adult worms in vitro. Ultrastructural changes on the tegument of these adult worms were evaluated using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Results: The MVEO caused the death of all worms at 500 μg mL-1 after 24 h. After 24h of 500 μg mL-1 MVEO treatment, bubble lesions were observed over the entire body of worms and they presented loss of tubercles in some regions of the ventral portion. In the evaluation by TEM, S. mansoni adult worms treated with MVEO, 500 μg mL-1, presented changes in the tegument and vacuoles in the syncytial matrix region. Glycogen granules close to the muscle fibers were visible. Conclusion: The ability of MVEO to cause extensive ultrastructural damage to S. mansoni adult worms correlates with its schistosomicidal effects and confirms earlier findings with S. mansoni.

Post-Treated Prostate Cancer: Normal Findings and Signs of Local Relapse on Multiparametric Magnetic Resonance Imaging

The use of multiparametric magnetic resonance imaging (mp-MRI) for prostate cancer has increased over recent years, mainly for detection, staging, and active surveillance. However, suspicion of recurrence in the set of biochemical failure is becoming a significant reason for clinicians to request mp-MRI. Radiologists should be able to recognize the normal post-treatment MRI findings. Fibrosis and atrophic remnant seminal vesicles after prostatectomy are often found and must be differentiated from local relapse. Moreover, brachytherapy, external beam radiotherapy, cryosurgery, and hormonal therapy tend to diffusely decrease the signal intensity of the peripheral zone on T2-weighted images (T2WI) due to the loss of water content, consequently mimicking tumor and hemorrhage. The combination of T2WI and functional studies like diffusion-weighted imaging and dynamic contrast-enhanced improves the identification of local relapse. Tumor recurrence tends to restrict on diffusion images and avidly enhances after contrast administration either within or outside the gland. The authors provide a pictorial review of the normal findings and the signs of local tumor relapse after radical prostatectomy, external beam radiotherapy, brachytherapy, cryosurgery, and hormonal therapy.

Molecular mechanisms of sexual development in basidiomycetes: exploring connections with lifestyles

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Protectionism and the productivity of the automotive industry in Brazil

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Economics from the NOVA – School of Business and Economics