Caracterización de la actividad de los receptores nucleares LXR en la activación y migración de células dendríticas

Programa de doctorado: Clínica e investigación terapéutica

Selezione e processazione di cellule Natural Killer da donatore aploidentico "KIR-ligand" incompatibile per l'immunoterapia adottiva di pazienti con Leucemia Acuta Mieloblastica ad alto rischio

The effector function of natural killer (NK) cells is regulated by activating and inhibitory receptors, termed killer immunoglobulin-like receptors (KIRs). In haploidentical T-cell depleted transplantation the donor/recipient KIR mismatch significantly impacts on NK-mediated tumor cell killing, particularly in acute myeloid leukaemia (AML). Thirty-four high risk AML patients entered a phase I-II study of adoptive NK-cell based immunotherapy and were screened for the availability of one haploidentical KIR ligand mismatched donor. Thirteen of them resulted as having one suitable donor. NK cells were enriched from steady-state leukaphereses by using a double-step immunomagnetic separation system, consisting in depletion of CD3+ T cells followed by positive selection of CD56+ NK cells. CD56+ cells were enriched from 7,70% (1,26-11,70) to 93,50% (66,41-99,20) (median recovery 53,05% (30,97-72,85), median T-depletion 3,03 log (2,15-4,52) viability >92%) and their citotoxic activity was inalterate. All patients (4 progressions, 1 partial remission and 8 complete remissions) received NK cell infusion which was preceeded by immunosuppressive chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) and followed by interleukin 2 injections. The median number of reinfused NK cells was 2,74x10(e)6/kg(1,11-5,00) and contamining CD3+ T cells were always less than 1x10(e)5/kg. The procedure was well-tolerated and no significant toxicity, including GvHD, related to NK cell infusion was observed. The donor NK cells were demonstrated in 5/10 patients. Among the 8 patients in complete remission 5 patients are stable after 18, 15, 4, 2 months of follow-up. Three other patients relapsed after 2 and 7 months. The patient in partial remission obtained a complete remission, which lasted for 6 months. The 4 patients with active/progressive disease showed the persistence of disease. This clinical observation may be correlated with in vitro studies, indicating that AML cells are capable to induce NK cell apoptosis in a dose-depend manner. In summery, a two-step enrichment of CD56+ NK cells allows the collection of a suitable number of target cells to be used as adoptive immunotherapy in AML patients. Infusion of NK cells is feasible and safe and adoptively transferred NK cells can be detected after infusion.

Studio di marcatori biologici prognostici nel linfoma di Hodgkin

Recent reports showed that early-interim PET-scan is the only tool predicting treatment outcome in advanced-stage classical Hodgkin lymphoma (asCHL). We evaluated the prognostic impact of a series of immunohistochemical markers, mentioned in literature as prognostic factors, on tissue microarrays assembled from biopsies of 220 patients: STAT1, SAP, TOP2A, PCNA and CD20, both in neoplastic (HRSC) and microenvironment cells (MC); RRM2, MAD2, CDC2, BCL2, P53, BCL11A and EBER in HRSC; ALDH1A1, TIA-1, granzyme B, perforin, FOXP3, and PD-1 in MC. All patients had been treated with standard ABVD ± Rx therapy. Interim-PET after 2 ABVD courses was evaluated according to the criteria indicated by Gallamini in his study (Journal of Clinical Oncology, 2007). The survival analysis has been performed in a subset of 138 patients whose complete clinical information were available: the mean age was 33.3 years (14-79), the stage III-IVB in 98 and IIB in 40, and the mean follow-up 38.1 months (7.6-71.9). Histopathology review showed: NS-I 75, NS-II 22, MC 20, DL 3, and CHL/nos 18 cases. Interim-PET was positive in 30 patients, while treatment failure was recorded in 32. In univariate analysis the factors related to treatment outcome were BCL2 on HRSC (cut-off value 50%), STAT1/SAP on MC, and PET (Log-rank 6.9, 7.9 and 93.9 respectively). The combined expression of STAT1 and SAP was scored in three levels depending on the architectural pattern: score 0 for expression of both with a diffuse/rosetting pattern; score 1 for discordant combination of diffuse/rosetting and scattered patterns; score 2 for both markers with a scattered pattern; the 3y-PFS were 87.4%, 69.9% and 61.9% respectively. In multivariate analysis PET, BCL2 and STAT1/SAP remained significant (HR: 24.8, 4.6, 7.5 and 5.6, respectively; p<.01). The proposed model is able to predict treatment response in AsCHL, even if with a lower efficacy than PET. However, unlike PET, it can be applied upfront therapy.

Ruolo della proteina arginin-metiltrasferasi-5 (PRMT5) nella linfomagenesi B: implicazioni terapeutiche

Numerosi studi hanno mostrato come i meccanismi epigenetici di regolazione della cromatina svolgano un ruolo centrale nel controllare la trascrizione genica. E’ stato infatti dimostrato che complessi inibitori come SWI/SNF e gli enzimi ad esso associati quali istone deacetilasi (HDAC) e protein arginin-metiltrasferasi (PRMT), siano coinvolti nel controllo della crescita, differenziazione e proliferazione cellulare. Diversi studi hanno mostrato come i meccanismi epigenetici di controllo della trascrizione genica svolgano un ruolo di primo piano nel promuovere la sopravvivenza cellulare in leucemie/linfomi di derivazione dai linfociti B come la leucemia linfatica cronica, il linfoma mantellare ed i linfomi associati al virus di Epstein-Barr (EBV). Tuttavia, molto poco e’ conosciuto circa i meccanismi epigenetici di controllo della trascrizione che divengono operativi e che contribuiscono al processo di trasformazione dei linfociti B. PRMT5 e’ un enzima che di-metila specificamente residui argininici sugli istoni (H) 3 (H3R8) ed 4 (H4R3). PRMT5 ed HDAC lavorano in concerto per reprimere la trascrizione di specifici geni oncosoppressori. In questo progetto sono stati studiati i meccanismi e le conseguenze dell’iperespressione di PRMT5 durante il processo di trasformazione dei linfociti B indotto da EBV, e’ stata dimostrata l’importanza di questo enzima nel processo di trasformazione, e sono stati studiati nuovi metodi per inibirne l’espressione/attivita’. In particolare si e’ dimostrato che l’espressione di PRMT5 e’ ridotta o assente in linfociti B normali (o attivati da stimoli fisiologici) ed elevata in linee cellulari linfoblastoidi immortalizzate o completamente trasformate. Elevati livelli citosolici di PRMT5 sono detectabili dopo 4 giorni dall’infezione di linfociti B normali con EBV, PRMT5 e’ detectabile a livello nucleare, dove esercita la sua funzione repressoria la trascrizione, a partire dal giorno 8. L’utilizzo di specifici small interference RNAs (siRNA) in linee cellulari linfoblastoidi ha permesso di dimostrare la riduzione dell’espressione di PRMT5, la riduzione della metilazione degli istoni target di PRMT5, inibizione della proliferazione cellulare e abbassamento della soglia di sensibilita’ cellulare a stimoli pro-apoptotici. Esperimenti di co-immunoprecipitazione cromatinica hanno permesso di evidenziare che in queste cellule PRMT5 e’ parte di un complesso proteico a funzione inibitoria e che questo complesso si lega alla regione promotrice di specifici geni oncosoppressori quali ST7, GAS e NM23, inibendone la trascrizione. Si e’ inoltre provveduto a sviluppare una categoria di inibitori allosterici di PRMT5: l’attivita’ terapeutica/la specificita’ in vitro e la modalita’ di somministrazione ottimale in modelli murini di linfoma non-Hodgkin, sono in corso di valutazione.

Il Nilotinib nella terapia di prima linea della leucemia mieloide cronica

Background: Nilotinib is a potent and selective BCR-ABL inhibitor. The phase 3 ENESTnd trial demonstrated superior efficacy nilotinib vs imatinib, with higher and faster molecular responses. After 24 months, the rates of progression to accelerated-blastic phase (ABP) were 0.7% and 1.1% with nilotinib 300mg and 400mg BID, respectively, significantly lower compared to imatinib (4.2%). Nilotinib has been approved for the frontline treatment of Ph+ CML. With imatinib 400mg (IRIS trial), the rate of any event and of progression to ABP were higher during the first 3 years. Consequently, a confirmation of the durability of responses to nilotinib beyond 3 years is extremely important. Aims: To evaluate the response and the outcome of patients treated for 3 years with nilotinib 400mg BID as frontline therapy. Methods: A multicentre phase 2 trial was conducted by the GIMEMA CML WP (ClinicalTrials.gov.NCT00481052). Minimum 36-month follow-up data for all patients will be presented. Definitions: Major Molecular Response (MMR): BCR-ABL/ABL ratio <0,1%IS; Complete Molecular Response (CMR): undetectable transcript levels with ≥10,000 ABL transcripts; failures: according to the revised ELN recommendations; events: failures and treatment discontinuation for any reason. All the analysis has been made according to the intention-to-treat principle. Results: 73 patients enrolled: median age 51 years; 45% low, 41% intermediate and 14% high Sokal risk. The cumulative incidence of CCgR at 12 months was 100%. CCgR at each milestone: 78%, 96%, 96%, 95%, 92% at 3, 6, 12, 18 and 24 months, respectively. The overall estimated probability of MMR was 97%, while the rates of MMR at 3, 6, 12, 18 and 24 months were 52%, 66%, 85%, 81% and 82%, respectively. The overall estimated probability of CMR was 79%, while the rates of CMR at 12 and 24 months were 12% and 27%, respectively. No patient achieving a MMR progressed to AP. Only one patient progressed at 6 months to ABP and subsequently died (high Sokal risk, T315I mutation). Adverse events were mostly grade 1 or 2 and manageable with appropriate dose adaptations. During the first 12 months, the mean daily dose was 600-800mg in 74% of patients. The nilotinib last daily dose was as follows: 800mg in 46 (63%) patients, 600mg in 3 (4%) patients and 400mg in 18 (25%), 6 permanent discontinuations. Detail of discontinuation: 1 patient progressed to ABP; 3 patients had recurrent episodes of amylase and/or lipase increase (no pancreatitis); 1 patient had atrial fibrillation (unrelated to study drug) and 1 patient died after 32 months of mental deterioration and starvation (unrelated to study drug). Two patients are currently on imatinib second-line and 2 on dasatinib third-line. With a median follow-up of 39 months, the estimated probability of overall survival, progression-free survival and failure-free survival was 97%, the estimated probability of event-free survival was 91%. Conclusions: The rate of failures was very low during the first 3 years. Responses remain stable. The high rates of responses achieved during the first 12 months are being translated into optimal outcome for most of patients.

Espressione dell'Enzima ad Azione Immunoregolatoria Indoleamina 2,3-Diossigenasi nella Leucemia Mieloide Acuta dell'Adulto: correlazioni Clinico-Biologiche

L’enzima IDO interviene nella via di degradazione del triptofano, essenziale per la vita cellulare; l’iperespressione di IDO favorisce la creazione di un microambiente immunotollerante. Nelle LAM IDO è funzionalmente attivo nelle cellule blastiche e determina l’acquisizione di un fenotipo regolatorio da parte delle cellule T alloreattive; l’espressione della proteina aumenta in modo consensuale con l’evoluzione clinica della patologia. Scopo della Tesi è indagare l’esistenza di una correlazione tra l’iperespressione di IDO da parte delle cellule leucemiche, le caratteristiche di rischio alla diagnosi e l’outcome dei pazienti. Sono stati esaminati 45 pazienti adulti affetti da LAM afferiti all’Istituto di Ematologia di Bologna. I pazienti sono stati stratificati a seconda di: età di insorgenza della leucemia, secondarietà a Mielodisplasia o radio chemioterapia, iperleucocitosi, citogenetica, biologia molecolare (sono state valutate le alterazioni a carico dei geni FLT3 ed NPM). I pazienti sono stati analizzati per l’espressione del gene IDO mediante RT-PCR, seguita da Western Blot, allo scopo di stabilire la presenza di una proteina attiva; successivamente si è proceduto a verificare l’esistenza di una correlazione tra l’espressione di IDO e le caratteristiche di rischio alla diagnosi per identificare una relazione tra l’espressione del gene ed un subset di pazienti a prognosi favorevole o sfavorevole. Dei 45 pazienti adulti affetti da LAM il 28,9% è risultato negativo per l’espressione di IDO, mentre il rimanente 71,1% è risultato positivo ed è stato suddiviso in tre ulteriori categorie, in base ai livelli di espressione. I dati non sembrano al momento suggerire l’esistenza di una correlazione tra l’espressione di IDO e le caratteristiche di rischio alla diagnosi. Nel gruppo di pazienti ad elevata espressione di IDO si riscontra un rate di resistenza alla chemioterapia di induzione più elevato, con una quota di pazienti resistenti pari al 71,4%, contro il 23,1% nel gruppo di pazienti IDO-negativi.

Identificazione di un profilo molecolare di rischio nei pazienti pediatrici affetti da Linfoma di Hodgkin

Obiettivi: nonostante i miglioramenti nel trattamento, circa il 30% dei pazienti pediatrici affetti da Linfoma di Hodgkin (LH) in stadio avanzato recidiva o muore per progressione di malattia e i correnti metodi predittivi biologico-clinici non consentono di individuare tali pazienti. L’obiettivo dello studio è stato quello di definire un profilo molecolare di rischio che correli con l’outcome in questi pazienti. Materiali e metodi: studio retrospettico condotto su pazienti pediatrici affetti da LH omogeneamente trattati dal 2004 in poi. Su tali pazienti è stato intrapreso uno studio di validazione di marcatori molecolari già identificati in studi esplorativi precedenti. 27 geni sono stati analizzati in RT PCR su campioni di tessuto istologico prelevato alla diagnosi fissato in formalina e processato in paraffina relativi a una coorte di 37 pazienti, 12 ad outcome sfavorevole e 25 ad outcome favorevole. Risultati: dall’analisi univariata è emerso che solo l’espressione di CASP3 e CYCS, appartenenti al pathway apoptotico, è in grado di influenzare l’EFS in modo significativo nella nostra coorte di pazienti. Lo studio delle possibili combinazioni di questi geni ha mostrato l’esistenza di 3 gruppi di rischio che correlano con l’EFS: alto rischio (down regolazione di entrambi i geni), rischio intermedio (down regolazione di uno solo dei 2 geni), basso rischio (up regolazione di entrambi i geni). Dall’analisi multivariata è emerso che CASP3 è l’unica variabile che mantiene la sua indipendenza nell’influenzare la prognosi con un rischio di eventi di oltre il doppio di chi ha un’espressione bassa di questo gene. Conclusioni: i risultati ottenuti sulla nostra coorte di pazienti pediatrici affetti da LH confermano l’impatto sulla prognosi di due marcatori molecolari CASP3 e CYCS coinvolti nel patwhay apoptotico. La valutazione del profilo di espressione di tali geni, potrebbe pertanto essere utilizzata in corso di stadiazione, come criterio di predittività.

Caratterizzazione citogenetico-molecolare alla diagnosi di pazienti con leucemia mieloide cronica in fase cronica trattati con inibitori delle tirosinchinasi: ruolo prognostico.

L’applicazione della citogenetica convenzionale e molecolare può identificare: Ph-negatività, traslocazioni t(9;22) varianti e alterazioni citogenetiche addizionali (ACA) al cromsoma Ph in pazienti con LMC alla diagnosi. Prima dell’introduzione della terapia con Imatinib, esse mostravano un impatto prognostico negativo o non chiaro. Nel nostro studio, 6 casi di LMC Ph- erano trattati con Imatinib. La FISH identificava 4 casi con riarrangiamento BCR/ABL sul der(9q), 1 sul der(22q) e 1 su entrambi i derivativi. Quattro pazienti (66,7%) raggiungevano la RCgC, 2 fallivano il trattamento e 1 sottoposto a TMO. A causa dello scarso numero di casi, non era possibile nessuna correlazione con la prognosi. Nell’ambito di studi prospettici multicentrici del GIMEMA-WP, abbiamo valutato: traslocazioni varianti e ACA. Dei 559 pazienti arruolati, 30(5%) mostravano traslocazioni varianti, 24 valutabili in FISH: 18(75%) mostravano meccanismo 1-step, 4(16,7%) meccanismo 2-step e 2(8,3%) meccanismo complesso. Abbiamo confermato che le varianti non influenzano la risposta e la sopravvivenza dei pazienti trattati con Imatinib. Dei 378 pazienti valutabili alla diagnosi con citogenetica convenzionale, 21(5,6%) mostravano ACA: 9(43%) avevano la perdita del cromosoma Y, 3(14%) trisomia 8, 2(10%) trisomia 19, 6(28%) altre singole anomalie e 1 cariotipo complesso. La presenza di ACA influenzava la risposta: le RCgC e RMolM erano significativamente più basse rispetto al gruppo senza ACA e le curve di sopravvivenza EFS e FFS non erano significativamente diverse. Le curve di PFS e OS erano sovrapponibili nei due gruppi, per il basso numero di eventi avversi oppure perché alcuni raggiungevano la risposta con TKI di seconda generazione. Le anomalie “major route” mostravano decorso clinico peggiore, ma non è stato possibile determinare l’impatto prognostico in relazione al tipo di alterazione. Pertanto, le ACAs alla diagnosi rivestono un ruolo negativo nella prognosi dei pazienti trattati con Imatinib, che quindi rappresentano una categoria più a rischio per la risposta.

Leucemia Acuta Mieloide e signaling purinergico: possibili sviluppi terapeutici

I nucleotidi trifosfato sono, dal punto di vista evoluzionistico, tra le molecole più antiche e conservate tra le specie. Oltre al ruolo che ricoprono nella sintesi degli acidi nucleici e nel metabolismo energetico della cellula, negli ultimi anni è emerso sempre di più il loro coinvolgimento nella regolazione di numerose funzioni cellulari. Questi importanti mediatori cellulari sono presenti nel microambiente e cambiamenti nella loro concentrazione extracellulare possono modulare la funzionalità cellulare. I nucleotidi trifosfato ATP e UTP, presenti nel microambiente midollare, sono dei potenti stimolatori dei progenitori emopoietici. Essi stimolano la proliferazione e l’attecchimento delle cellule staminali emopoietiche, così come la loro capacità migratoria, attraverso l’attivazione di specifici recettori di membrana, i recettori purinergici (P2R). In questo studio abbiamo dimostrato che ATP e UTP esercitano un effetto opposto sul compartimento staminale leucemico di leucemia acuta mieloide (LAM). Abbiamo dimostrato che le cellule leucemiche esprimono i recettori P2 funzionalmente attivi. Studi di microarray hanno evidenziato che, a differenza di ciò che avviene nelle CD34+, la stimolazione di cellule leucemiche con ATP induce la down-regolazione dei geni coinvolti nella proliferazione e nella migrazione, mentre up-regola geni inibitori del ciclo cellulare. Abbiamo poi confermato a livello funzionale, mediante test in vitro, gli effetti osservati a livello molecolare. Studi di inibizione farmacologica, ci hanno permesso di capire che l’attività inibitoria dell’ATP sulla proliferazione si esplica attraverso l’attivazione del recettore P2X7, mentre i sottotipi recettoriali P2 prevalentemente coinvolti nella regolazione della migrazione sono i recettori P2Y2 e P2Y4. Esperimenti di xenotrapianto, hanno evidenziato che l’esposizione ad ATP e UTP sia dei blasti leucemici sia delle cellule staminali leucemiche CD38-CD34+ diminuisce la loro capacità di homing e di engraftment in vivo. Inoltre, il trattamento farmacologico con ATP, di topi ai quali è stata indotta una leucemia umana, ha diminuito lo sviluppo della leucemia in vivo.

Septic mucormycosis in acute t-cell leucemia – pathogen detection in skin lesions

We report on a 43-year old patient with an acute T-Cell Leucemia, currently in Aplasia after Chemotherapy, showing five targetoid bluish skin lesions. Due to a three weeks history of septic symptoms he was under treatment with antibiotics and antifungals. Multiple septic foci were localized (N. caudatus, liver, kidneys, lung, spine and right psoas). Microbiology analyses of various blood cultures and of the aspirate of the psoas abscess showed initially negative results. Clinically the skin lesions were suspected to be of septic or thrombogenic origin. A 5 mm punch biopsy was performed and separated for microbiological diagnostic and conventional histology. Surprisingly large fungal agents in mostly intravascular distribution were seen histologically and identified as Lichtheimia corymbifera (syn. Absidia corymbifera) by PCR. Cultures remained negative. The patient died on the following day. Lichtheimia corymbifera is a fungus belonging to the family of mucormycosis. Aspergillosis and mucormycosis are the most common mold infections in patients with hematological malignancies, clinically often indistinguishable. However, the true incidence of mucormycosis is not known and probably underestimated because of difficulties in diagnosis. Mucormycosis typically causes acute, aggressive, and frequently angioinvasive infections presenting with solitary local skin necrosis. The fact that the pathogenic fungus was isolated from a very discrete skin lesion but was not detected in blood cultures, and only later in the PCR of the aspirate of the psoas abscess, makes this case exceptional.