Real-Time Imaging of the Axonal Transport of Granules Containing a Tissue Plasminogen Activator/Green Fluorescent Protein Hybrid

A hybrid protein, tPA/GFP, consisting of rat tissue plasminogen activator (tPA) and green fluorescent protein (GFP) was expressed in PC12 cells and used to study the distribution, secretory behavior, and dynamics of secretory granules containing tPA in living cells with a neuronal phenotype. High-resolution images demonstrate that tPA/GFP has a growth cone-biased distribution in differentiated cells and that tPA/GFP is transported in granules of the regulated secretory pathway that colocalize with granules containing secretogranin II. Time-lapse images of secretion reveal that secretagogues induce substantial loss of cellular tPA/GFP fluorescence, most importantly from growth cones. Time-lapse images of the axonal transport of granules containing tPA/GFP reveal a surprising complexity to granule dynamics. Some granules undergo canonical fast axonal transport; others move somewhat more slowly, especially in highly fluorescent neurites. Most strikingly, granules traffic bidirectionally along neurites to an extent that depends on granule accumulation, and individual granules can reverse their direction of motion. The retrograde component of this bidirectional transport may help to maintain cellular homeostasis by transporting excess tPA/GFP back toward the cell body. The results presented here provide a novel view of the axonal transport of secretory granules. In addition, the results suggest that tPA is targeted for regulated secretion from growth cones of differentiated cells, strategically positioning tPA to degrade extracellular barriers or to activate other barrier-degrading proteases during axonal elongation.

Real-time quantitative measurement of autocrine ligand binding indicates that autocrine loops are spatially localized

Autocrine ligands are important regulators of many normal tissues and have been implicated in a number of disease states, including cancer. However, because by definition autocrine ligands are synthesized, secreted, and bound to cell receptors within an intrinsically self-contained “loop,” standard pharmacological approaches cannot be used to investigate relationships between ligand/receptor binding and consequent cellular responses. We demonstrate here a new approach for measurement of autocrine ligand binding to cells, using a microphysiometer assay originally developed for investigating cell responses to exogenous ligands. This technique permits quantitative measurements of autocrine responses on the time scale of receptor binding and internalization, thus allowing investigation of the role of receptor trafficking and dynamics in cellular responses. We used this technique to investigate autocrine signaling through the epidermal growth factor receptor by transforming growth factor alpha (TGFα) and found that anti-receptor antibodies are far more effective than anti-ligand antibodies in inhibiting autocrine signaling. This result indicates that autocrine-based signals can operate in a spatially restricted, local manner and thus provide cells with information on their local microenvironment.

Cytoskeletal microdifferentiation: A mechanism for organizing morphological plasticity in dendrites

Experimental evidence suggests that microfilaments and microtubules play contrasting roles in regulating the balance between motility and stability in neuronal structures. Actin-containing microfilaments are associated with structural plasticity, both during development when their dynamic activity drives the exploratory activity of growth cones and after circuit formation when the actin-rich dendritic spines of excitatory synapses retain a capacity for rapid changes in morphology. By contrast, microtubules predominate in axonal and dendritic processes, which appear to be morphologically relatively more stable. To compare the cytoplasmic distributions and dynamics of microfilaments and microtubules we made time-lapse recordings of actin or the microtubule-associated protein 2 tagged with green fluorescent protein in neurons growing in dispersed culture or in tissue slices from transgenic mice. The results complement existing evidence indicating that the high concentrations of actin present in dendritic spines is a specialization for morphological plasticity. By contrast, microtubule-associated protein 2 is limited to the shafts of dendrites where time-lapse recordings show little evidence for dynamic activity. A parallel exists between the partitioning of microfilaments and microtubules in motile and stable domains of growing processes during development and between dendrite shafts and spines at excitatory synapses in established neuronal circuits. These data thus suggest a mechanism, conserved through development and adulthood, in which the differential dynamics of actin and microtubules determine the plasticity of neuronal structures.

A loop-loop "kissing" complex is the essential part of the dimer linkage of genomic HIV-1 RNA.

RNA-RNA interactions govern a number of biological processes. Several RNAs, including natural sense and antisense RNAs, interact by means of a two-step mechanism: recognition is mediated by a loop-loop complex, which is then stabilized by formation of an extended intermolecular duplex. It was proposed that the same mechanism holds for dimerization of the genomic RNA of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), an event thought to control crucial steps of HIV-1 replication. However, whereas interaction between the partially self-complementary loop of the dimerization initiation site (DIS) of each monomer is well established, formation of the extended duplex remained speculative. Here we first show that in vitro dimerization of HIV-1 RNA is a specific process, not resulting from simple annealing of denatured molecules. Next we used mutants of the DIS to test the formation of the extended duplex. Four pairs of transcomplementary mutants were designed in such a way that all pairs can form the loop-loop "kissing" complex, but only two of them can potentially form the extended duplex. All pairs of mutants form heterodimers whose thermal stability, dissociation constant, and dynamics were analyzed. Taken together, our results indicate that, in contrast with the interactions between natural sense and antisense RNAs, no extended duplex is formed during dimerization of HIV-1 RNA. We also showed that 55-mer sense RNAs containing the DIS are able to interfere with the preformed HIV-1 RNA dimer.

Toward an outline of the topography of a realistic protein-folding funnel.

Experimental information on the structure and dynamics of molten globules gives estimates for the energy landscape's characteristics for folding highly helical proteins, when supplemented by a theory of the helix-coil transition in collapsed heteropolymers. A law of corresponding states relating simulations on small lattice models to real proteins possessing many more degrees of freedom results. This correspondence reveals parallels between "minimalist" lattice results and recent experimental results for the degree of native character of the folding transition state and molten globule and also pinpoints the needs of further experiments.

Un modelo para comprender la dinámica de los territorios rurales. El caso de la Argentina

Los territorios rurales de América Latina, y de la Argentina en particular, han sufrido cambios profundos en las últimas décadas producto de transformaciones en materia productiva, demográfica y social. Los cambios son complejos y han dado lugar a una multiplicidad de miradas y de enfoques sobre la nueva realidad. Frente a esta creciente complejidad, se plantea la construcción de un modelo interpretativo de la realidad rural de la Argentina que bien puede contribuir también para abordar las realidades de otros mundos rurales latinoamericanos. El modelo conceptual que se ofrece se construyó a partir del análisis empírico de numerosos casos de territorios rurales de la Argentina. Dicho modelo permite comprender los complejos procesos de organización y la dinámica rural, además de constituirse en una herramienta de prognosis para la definición de políticas públicas acordes que alienten nuevas dinámicas de desarrollo rural en la Argentina

Colaboração interprofissional na Estratégia Saúde da Família e a produção do cuidado em saúde durante o pré-natal

Introdução: Uma das mudanças mais importantes na produção do cuidado à saúde é a reorganização do processo de trabalho para a atuação de equipes multiprofissionais com abordagens interdisciplinares. A colaboração interprofissional tem sido apontada como um recurso que pode ser mobilizado para elevar a efetividade dos sistemas de saúde, e como estratégia inovadora, ela pode desempenhar um importante papel para enfrentar problemas do modelo de atenção e da força de trabalho em saúde. Objetivo: Descrever as percepções e atitudes de profissionais de saúde da Estratégia de Saúde da Família sobre as relações interprofissionais na atenção ao pré-natal, construir coletivamente e testar um protocolo de atenção à gestante para impulsionar as competências no trabalho colaborativo com vistas ao incremento da qualidade do cuidado. Métodos: Para isso, realizou-se previamente um estudo observacional descritivo para seleção de duas unidades de saúde. Na sequência foi realizado um estudo de intervenção do tipo antes e depois, com um grupo de controle pós-teste, incluindo métodos mistos. A população do estudo compreendeu oito profissionais de saúde (médicos, dentistas, enfermeiros e técnicos em saúde bucal) e 60 gestantes cadastradas em duas unidades de saúde da família do município de Uberlândia, sendo 36 incluídas no grupo intervenção e 24 no grupo controle. Dados numéricos, narrativas provenientes de entrevistas e registros de diário de campo foram usados para identificar mudanças na autoavaliação da saúde bucal, na qualidade de vida relacionada à saúde bucal medida pelo OHIP-14, na percepção das gestantes sobre o trabalho em equipe e nas práticas profissionais. Testes estatísticos para detectar diferenças de significância e análise temática de conteúdo foram empregados para interpretar os desfechos. Resultados: Em geral, observou-se percepção/atitude favorável dos profissionais em relação à colaboração interprofissional. Diferenças entre as categorias profissionais podem representar uma barreira subjetiva à implementação de protocolos que demandariam maior grau de trabalho colaborativo. Diferenças entre as unidades de atenção primária mostraram que a interação entre membros das equipes multiprofissionais pode sobrepujar dificuldades decorrentes do modo isolado e distinto no qual cada categoria profissional é formada. Foi produzido um Protocolo de Atenção à Gestante abrangendo o fluxo e a dinâmica dos processos de trabalho dentro de uma perspectiva de colaboração interprofissional. Segundo os profissionais, a intervenção apesar do seu caráter desafiador, estimulou o comprometimento da equipe para reorientar o processo de trabalho resultando em maior interação profissional colaborativa. Em relação às gestantes, a maioria era jovem (menos de 26 anos de idade) e tinha ensino médio incompleto ou completo sem diferenças significativas entre os grupos teste e controle. Gestantes do grupo intervenção perceberam que os profissionais trabalhavam mais em equipe do que as gestantes do grupo controle. De modo geral, as gestantes avaliaram que a saúde bucal e a qualidade de vida decorrente da saúde bucal melhoraram após a intervenção. Conclusões: Concluiu-se que apesar da percepção geral dos profissionais favorável à colaboração interprofissional, recursos formais e organizacionais não estavam sendo empregados. O método ZOPP se mostrou flexível e adequado para o desenvolvimento de competências para o trabalho colaborativo e para a construção de um protocolo de organização de serviços na atenção primária à saúde. O Protocolo de Atenção à Gestante testado provocou tensões e produziu efeitos positivos na colaboração interprofissional e na qualidade de vida relacionada à saúde bucal contribuindo para qualificar a atenção ao pré-natal oferecido.

Sistema migratório Brasil-Portugal: hierarquias geográficas e dinâmicas dos fluxos e contrafluxos populacionais no limiar do século XXI

As migrações constituem um dos pilares da relação entre Brasil e Portugal. Com esta premissa este estudo tem por objetivo compreender a formação, a sustentação no tempo e a configuração atual do sistema migratório luso-brasileiro. Partindo da Geografia da População, dialoga-se tanto com os demais campos da própria ciência geográfica, especialmente a Geografia Política e a Geografia Econômica, como com as demais ciências humanas e sociais, dentre outras a Sociologia e a Antropologia. Adota- se uma periodização que busca articular as migrações e as imaginações geográficas produzidas e produtoras das ordens geopolíticas. Esta perspectiva diacrônica tem como ponto de partida a formação do estado territorial português e, posteriormente, do estado territorial brasileiro. Enfatiza-se, em especial, como homens e mulheres imigrantes brasileiros e portugueses participam das transformações recentes de Portugal e do Brasil, respectivamente. Desde o final da década de 2000 há uma situação em que fluxos e contrafluxos migratórios praticamente se equivalem. Dados quantitativos e qualitativos foram utilizados para demonstrar que portugueses no Brasil e brasileiros em Portugal imigrados a partir de 2000 possuem perfis diferentes quanto à idade, sexo, nível de instrução e inserção no mercado laboral. A análise das semelhanças e divergências entre estes grupos de imigrantes levou à consideração de que enfrentam barreiras e desafios distintos, mas têm em comum sua contribuição para ressignificação de uma relação pretérita e assimétrica, marcada pelo compartilhar de uma população luso-brasileira.

Contribuições de experiências de estágio em CAPS III para a formação interdisciplinar em Saúde Mental na perspectiva da Reforma Psiquiátrica

Introdução: A formação dos profissionais da área da saúde é fundamental para a transformação das práticas de cuidado e consolidação dos princípios e diretrizes do Sistema Único de Saúde (SUS). Sendo um desafio do SUS, esta questão também está presente no campo da Saúde Mental e é necessária para a consolidação da Reforma Psiquiátrica e construção e fortalecimento da Rede de Atenção Psicossocial. Proposição: Investigar e refletir sobre as experiências dos estudantes que realizaram estágio no Centro de Atenção Psicossocial (CAPS) III Itaim Bibi entre 2009 e 2014, no tocante à formação profissional em Saúde Mental na perspectiva da Reforma Psiquiátrica. Materiais e Métodos: Estudo qualitativo, com construção dos dados a partir da leitura de relatórios dos estudantes e de questionários com perguntas referentes à experiência dos estágios, que foram apresentadas aos participantes conforme orientações do método Delphi. As questões abordaram: motivos; expectativas; forma e qualidade de participação nas atividades; temas e estudos; trabalho em equipe; situações vivenciadas; influência na atuação profissional; apresentação do estágio e sugestões de alterações. As informações foram trabalhadas por meio de Análise de Conteúdo Temática. Resultados: Dos 52 convidados, 28 participaram da primeira rodada (53,85%), sendo: 14 terapeutas ocupacionais, 9 enfermeiros, 3 psicólogos e 2 estudantes de Serviço Social. O segundo questionário foi composto por afirmativas presentes nas respostas recebidas para que os participantes as avaliassem conforme grau de concordância da escala Likert. Nesta fase foram recebidas 26 respostas. Conclusões: Apesar das dificuldades vivenciadas, avaliou-se que a maior parte das experiências dos estágios foi positiva e possibilitou aprendizagens significativas sobre o modelo de atenção psicossocial, o funcionamento e dinâmica da instituição, o trabalho em equipe interdisciplinar e as produções de convivência, principalmente aos sujeitos que realizaram estágios com maior carga horária. Identificaram como importantes aprendizados as experiências de acompanhamento individual e grupal dos usuários, a construção de Projeto Terapêutico Singular e de redes, o trabalho territorial e intersetorial. A participação em reuniões, supervisões clínico-institucionais, multiprofissionais e em oficinas de reflexão com as docentes das Universidades foi considerada importante para a formação. O aprendizado de manejo de situações de crise e de conflitos e de técnicas de contenção foi considerado superficial. Identificou-se que modelo de gestão e o trabalho da equipe influenciam no desenvolvimento de autonomia e protagonismo dos estagiários. O fortalecimento da integração ensino-serviço-comunidade é necessário e a flexibilização das propostas instituídas poderia facilitar a construção conjunta dos planos de estágios. Como produtos desta pesquisa foram elaboradas propostas de modificações para melhor organização dos estágios no CAPS e para a integração ensino-serviço e de Plano de Estágio Supervisionado em Terapia Ocupacional para os estágios extracurriculares. Realizou-se também uma Revisão Integrativa das publicações científicas brasileiras sobre a formação de estudantes de graduação em Saúde Mental na perspectiva da Reforma Psiquiátrica. Por fim, compreendeu-se que as experiências ressoam nas práticas profissionais dos graduados de modo positivo. Os participantes que não atuam neste campo, disseram levar consigo a experiência do trabalho em equipe e de formas éticas e humanizadas de cuidado.

Dinâmica molecular de sistemas iônicos poliatômicos: modelos polarizável e não-polarizável

Simulações de sais de carbonato fundidos pelo método de Dinâmica Molecular (MD) foram efetuadas com o modelo polarizável de cargas flutuantes (FC). O modelo de cargas flutuantes implementa os efeitos de polarização pelo método de Lagrangiano estendido, onde as variáveis extras são as próprias cargas parciais do íon poliatômico. O modelo FC foi parametrizado por meio de cálculos ab inito, aplicado ao ânion carbonato. Cálculos de Química Quântica ab initio foram utilizados para corroborar o modelo proposto para o ânion carbonato. Os sistemas investigados consistem em misturas de carbonatos alcalinos fundidos, Li2CO3/K2CO3, os quais são utilizados como eletrólitos em células a combustível. As simulações MD foram utilizadas para verificar o efeito da polarização dos ânions sobre a estrutura e dinâmica do líquido. Estudamos o efeito da inclusão de polarização sobre a condutividade do eletrólito.

Avaliação do erro estático da ferramenta de uma máquina fresadora com arquitetura paralela.

Os mecanismos amplamente utilizados em aplicações industriais são de tipo serial, porém há algum tempo vem sendo desenvolvidos estudos sobre as vantagens que os mecanismos de arquitetura paralela oferecem em contraposição com os seriais. Rigidez, precisão, altas frequências naturais e velocidade são algumas características que os mecanismos paralelos atribuem a máquinas já consolidadas na indústria, destinadas principalmente nas operações de manipulação (pick and place). Nesse sentido, é relevante o estudo sobre a funcionalidade em outros tipos de operação como a usinagem e, particularmente o fresamento. Para isto, devem-se ainda explorar e desenvolver as capacidades dos mecanismos paralelos em relação à rigidez e à precisão nas operações mencionadas. Foi desenvolvido previamente o projeto e montagem do protótipo de uma máquina fresadora de arquitetura paralela. Também aracterizado pela redundância na atuação para o posicionamento da ferramenta. Com este intuito, pretende-se no trabalho atual, avaliar o erro estático de posicionamento da ferramenta por métodos experimentais, quantificar os deslocamentos, realizar um mapeamento experimental em diversas configurações dos membros. Por outro lado, pretende-se adaptar um modelo numérico simplificado que possa prever as deformações elásticas em diversas configurações, que contemple o efeito de juntas lineares flexíveis e que de alguma forma ajude a identificar as principais fontes de erro. Para tal, foram elaboradas rotinas de programação que através da cinemática inversa e o uso do método dos elementos finitos tentem prever o que de fato acontece nos experimentos. Foi proposta também uma implementação alternativa para o controle do mecanismo através de um software CNC e a conversão de coordenadas cartesianas em coordenadas dos atuadores, isto ajudaria na geração do código G. Finalmente, foram elaboradas algumas trajetórias que tentam avaliar a exatidão e repetitividade do mecanismo além de descrever outras trajetórias livres.

Contribution à l’étude de la thérophytisation des matorrals des versants sud des monts de Tlemcen (Algérie occidentale)

La zone sur laquelle porte notre contribution est localisée dans le Nord-Ouest Algérien. Cette étude est consacrée à l’analyse de la diversité biologique et la dynamique des formations végétales des matorrals des versants sud des monts de Tlemcen. L’utilisation de la méthode aire-espèce de Braun Blanquet nous a permis de dégager une liste de 149 espèces à partir de 150 relevés fl oristiques effectués sur l’ensemble des stations d’étude. 4,69 % des espèces appartiennent aux for mations forestières et pré-forestières, avec une hauteur n’excédant pas 2 mètres; 13,42 % aux matorrals et 81,87 % aux pelouses. La conjugaison des facteurs de dégradation a entrainé une perturbation des écosystèmes locaux accompagnée d’une régression des aires de répartition de nombreux taxons. Deux facteurs majeurs peuvent être évoqués : – amplifi cation de l’impact humain lié à l’utilisation anarchique des écosystèmes (défrichement; coupe; surpâturages; bois de chauffe), – péjorations climatiques. L’analyse statistique des spectres biologiques nous a permis de mettre en évidence les modifications de la flore le long d’un gradient dynamique: forêt – pré forêt – matorral – pelouse. Plus des 3/4 des espèces recensées dans la zone d’étude appartiennent aux thérophytes et aux hemicryptophytes.

Children Exposed to Intimate Partner Violence Against Women in Spain. A Quantitative Analysis

A growing number of authors have been suggesting the necessary incorporation of children in the analysis of gender violence and, specifically, in the analysis of intimate partner violence against women (IPV). Such incorporation would be relevant not only for reducing children's invisibility and vulnerability, but also for achieving a better understanding of the characteristics and dynamics of IPV. Based on these considerations, we present in this paper the results of a secondary analysis applied to the data obtained in the last Spanish Survey on Violence Against Women. The available information allows us to analyze: 1) the presence of children exposed to IPV, 2) the relationship between this presence and the probability of reporting the violence, and 3) women's perception about the parental role of the aggressors.

Infancia y violencia de género: cuantificación y percepciones

Cada vez más autores destacan la necesaria incorporación de la infancia en el estudio de la violencia de género y, en concreto, de la violencia contra la mujer por parte del compañero íntimo (VCI). Tal incorporación puede facilitar no sólo una menor invisibilidad y desprotección de niños y niñas, sino también una mejor comprensión de la propia violencia, sus características y dinámicas. Partiendo de estas consideraciones, en este artículo se presentan los resultados de un análisis secundario de los datos obtenidos en la última macroencuesta sobre violencia contra las mujeres en España. La información disponible permite analizar: 1) la presencia de menores expuestos a VCI; 2) la posible relación entre esta presencia y la formulación de denuncias; y 3) la percepción que tienen las mujeres víctimas de VCI en torno al rol parental de los agresores.

Gaia-ESO Survey: Analysis of pre-main sequence stellar spectra

Context. The Gaia-ESO Public Spectroscopic Survey is obtaining high-quality spectroscopy of some 100 000 Milky Way stars using the FLAMES spectrograph at the VLT, down to V = 19 mag, systematically covering all the main components of the Milky Way and providing the first homogeneous overview of the distributions of kinematics and chemical element abundances in the Galaxy. Observations of young open clusters, in particular, are giving new insights into their initial structure, kinematics, and their subsequent evolution. Aims. This paper describes the analysis of UVES and GIRAFFE spectra acquired in the fields of young clusters whose population includes pre-main sequence (PMS) stars. The analysis is applied to all stars in such fields, regardless of any prior information on membership, and provides fundamental stellar atmospheric parameters, elemental abundances, and PMS-specific parameters such as veiling, accretion, and chromospheric activity. Methods. When feasible, different methods were used to derive raw parameters (e.g. line equivalent widths) fundamental atmospheric parameters and derived parameters (e.g. abundances). To derive some of these parameters, we used methods that have been extensively used in the past and new ones developed in the context of the Gaia-ESO survey enterprise. The internal precision of these quantities was estimated by inter-comparing the results obtained by these different methods, while the accuracy was estimated by comparison with independent external data, such as effective temperature and surface gravity derived from angular diameter measurements, on a sample of benchmarks stars. A validation procedure based on these comparisons was applied to discard spurious or doubtful results and produce recommended parameters. Specific strategies were implemented to resolve problems of fast rotation, accretion signatures, chromospheric activity, and veiling. Results. The analysis carried out on spectra acquired in young cluster fields during the first 18 months of observations, up to June 2013, is presented in preparation of the first release of advanced data products. These include targets in the fields of the ρ Oph, Cha I, NGC 2264, γ Vel, and NGC 2547 clusters. Stellar parameters obtained with the higher resolution and larger wavelength coverage from UVES are reproduced with comparable accuracy and precision using the smaller wavelength range and lower resolution of the GIRAFFE setup adopted for young stars, which allows us to provide stellar parameters with confidence for the much larger GIRAFFE sample. Precisions are estimated to be ≈120 K rms in Teff, ≈0.3 dex rms in log g, and ≈0.15 dex rms in [Fe/H] for the UVES and GIRAFFE setups.