Effect of fatty acids on hyphal growth in the pathogenic yeast Candida albicans

Candida albicans est une levure pathogène qui, à l’état commensal, colonise les muqueuses de la cavité orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systémiques sévères. C. albicans a la capacité de se développer sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouvées chez l’hôte (température de 37°C, pH neutre, présence de sérum) induisent la transition levure-à-hyphe (i.e. morphogenèse ou filamentation). Cette transition morphologique contribue à la pathogénicité de C. albicans, du fait que des souches présentant un défaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogenèse est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le développement d’antifongiques. En effet, il a déjà été démontré que l’inhibition de la transition levure-à-hyphe atténuait la virulence de C. albicans lors d’infections systémiques. Par ailleurs, des études ont démontré que de nombreuses molécules pouvaient moduler la morphogenèse. Parmi ces molécules, certains acides gras, dont l’acide linoléique conjugué (CLA), inhibent la formation d’hyphes. Ainsi, le CLA posséderait des propriétés thérapeutiques, du fait qu’il interfère avec un déterminant de pathogénicité de C. albicans. Par contre, avant d’évaluer son potentiel thérapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel d’étudier son mode d’action. Ce projet vise à caractériser l’activité anti-filamentation des acides gras et du CLA et à déterminer le mécanisme par lequel ces molécules inhibent la morphogenèse chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont été effectuées afin d’obtenir le profil transcriptionnel de la réponse de C. albicans au CLA. L’acide gras a entraîné une baisse des niveaux d’expression de gènes encodant des protéines hyphes-spécifiques et des régulateurs de morphogenèse, dont RAS1. Ce gène code pour la GTPase Ras1p, une protéine membranaire de signalisation qui joue un rôle important dans la transition levure-à-hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirmé que le CLA inhibait l’induction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement causé une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entraîné sa délocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit à l’activation de la voie de signalisation Ras1p-dépendante, inhibant ainsi la morphogenèse. Il est possible que le CLA altère la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en évidence le mode d’action du CLA. Le potentiel thérapeutique du CLA pourrait maintenant être évalué dans un contexte d’infection, permettant ainsi de vérifier qu’une telle approche constitue véritablement une stratégie pour le traitement des candidoses.

Phylogénomique des Archées

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées.

Évaluation de stratégies pour améliorer l'observance de la biosécurité sur les fermes avicoles au Québec

La problématique de l’observance de la biosécurité est présente dans tous les types de production. Il est essentiel de définir des stratégies pour améliorer l’application des mesures de biosécurité. Cette étude décrit l’application des mesures de biosécurité à l’entrée et à la sortie de 24 bâtiments d’élevages avicoles au Québec, Canada. L’effet des audits et de caméras visibles sur l’observance a été étudié, de même que les déterminants de l’observance. De plus, la relation entre l’observance et les profils de personnalité, l’expérience et l’éducation a été décrite. L’application des mesures de biosécurité a été évaluée à l’aide de caméras cachées. L’observance à court terme (deux premières semaines) et à moyen terme (six mois plus tard) a été déterminée. Basés sur les résultats du groupe contrôle, 44 différentes erreurs lors de l’application des mesures de biosécurité ont été observées à l’entrée et la sortie des bâtiments. La plupart étaient reliées à la délimitation des zones (propre versus contaminée). La nature et la fréquence des erreurs suggèrent un manque de compréhension des principes associés aux mesures de biosécurité. Le visionnement des vidéos a révélé 3055 visites par 277 individus différents (136 employés, 123 visiteurs, 3 superviseurs et 15 éleveurs). Les résultats ont démontré que les audits n’avaient pas d’impact sur l’observance des employés. Les caméras visibles ont eu un impact, à court terme, sur le port de bottes et le respect des zones durant la visite. Par contre, six mois plus tard, l’observance avait significativement diminué, au point de ne plus être statistiquement plus élevée que le groupe contrôle. La durée et le moment de la visite, la présence de l’éleveur ou d’un observateur, la conception de l’entrée, le nombre de bâtiments, le nombre de mesures de biosécurité exigé, le type de bottes, le genre et être membre de la famille de l’éleveur étaient significativement associés à l’observance de certaines mesures. Finalement, trois traits de la personnalité étaient associés à l’observance: responsabilité, orienté vers l’action et complexité, de même que le nombre d’années d’expérience et le niveau d’éducation. Il est nécessaire d’améliorer la formation en matière de biosécurité en fournissant du matériel de formation à tous les intervenants qui démontrent pourquoi et comment appliquer les mesures de biosécurité. La formation continue devrait également aborder les problématiques reliées aux caractéristiques de visites et de fermes. Améliorer la conception des entrées de bâtiments devrait contribuer à augmenter et à maintenir l’observance. L’identification de traits de personnalité associés à l’observance peut avoir des implications sur la sélection des candidats à l’embauche ou sur l’attribution de tâches et sur la planification des programmes de formation.

Étude génétique et fonctionnelle de variantes de la région chromosomique 3p21 associée aux maladies inflammatoires de l'intestin

Des études de liaison et d’association génétiques ont permis d’identifier certains des facteurs de risque génétiques aux maladies inflammatoires de l’intestin (MII) dans la région chromosomique 3p21. Dans cette région, le polymorphisme nucléotidique simple (SNP) codant non-synonyme du gène MST1, rs3197999, encodant pour la mutation R689C, a été associé et répliqué à la fois à la colite ulcéreuse (CU) et à la maladie de Crohn (MC). Un autre SNP, corrélé à des SNP codants non-synonymes du gène MST1R, a également été associé à la MC. Afin de déterminer si d’autres variantes des gènes MST1 et MST1R sont associés à la CU, nous avons testé pour association des SNP de ces gènes. Seul un proxy de R689C a montré un signal d’association significatif aux MII, ce qui suggère que R689C est la variante causale aux MII dans le gène MST1. En cherchant à déterminer si la région 3p21 contenait plusieurs signaux d’association mutuellement indépendants, trois SNP ont été identifiés comme possible facteurs de risque indépendants, et ont été génotypés dans des cas de CU et de MC et des témoins, puis nos résultats d’association ont été combinés à ceux provenant de trois autres cohortes indépendantes. Les trois SNP, R689C (MST1), rs6802890 et rs7629936 (CDHR4), sont associés aux MII, mais une étude d’association conditionnelle suggère qu’il existe en fait deux signaux d’association mutuellement indépendants dans la région 3p21. Le signal principal provient de R689C, une mutation de la protéine MSP. Cette protéine a un rôle dans l’inflammation chez les macrophages murins, et la migration, la cicatrisation et la survie chez les cellules épithéliales. Dans cette étude, le rôle de la MSP a été investigué dans des modèles de macrophages humains et de cellules épithéliales de côlon, et seule la phosphorylation d’AKT, un acteur dans la voie de signalisation de la survie cellulaire, a été modulée par la MSP dans nos modèles. Ce projet a donc permis d’apporter des connaissances sur les facteurs de risques génétiques aux MII dans la région 3p21, en identifiant 2 signaux d’association indépendants, et en nous informant sur le rôle de MST1, duquel provient le signal d’association principal, chez les cellules humaines.

Mass spectrometry as a tool to dissect the role of chromatin assembly factors in regulating nucleosome assembly

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones.

Antiproliferative effects of retinoic acid in breast cancer

Les rétinoïdes sont utilisés dans le traitement d’une variété de tumeurs malignes et lésions précancéreuses. Leurs effets dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs solides tel que le cancer du sein ont été étudiés extensivement. Cependant, les bénéfices dans le cancer du sein restent à date peu clairs. Ceci est probablement du à l’hétérogénéité des tumeurs mammaires et la réponse très variable aux effets antiprolifératifs de l’acide rétinoïque. Dans les lignées cellulaires cancéreuses mammaires, la réponse l’AR est fortement corrélée au niveau d’expression du récepteur aux estrogènes alpha (ERα), qui régule l’expression du gène qui encode le récepteur à l’acide rétinoïque alpha, RARA. Malgré cela, certaines lignées cellulaires ER-négatives, comme la lignée HER2-positive SK-BR-3, ont été décrites comme étant sensibles à l’AR. Dans le Chapter 2: de cette thèse, nous avons étudié les mécanismes de la signalisation ER-dépendante et ER-indépendante dans les cellules cancéreuses mammaires. Nous avons utilisé des lignées ER-négatives et ER-positives pour démontrer qu’une partie de la réponse à l’AR est indépendante de la signalisation par ER. Nous avons identifié plusieurs gènes cibles primaires de l’AR qui ont des effets similaires à l’AR quand ils sont surexprimés dans des cellules mammaires cancéreuses. Cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes complexes qui mènent à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires. Dans le Chapitre 3, nous avons regardé plus en détails la signalisation ER-indépendante par l’AR dans des cellules ayant une amplification des gènes HER2 et RARA et nous avons identifié une synergie entre l’AR et le Herceptin dans ces cellules. Nous proposons que les gènes FOXO jouent une rôle dans cette synergie. Les cellules SK BR 3, ayant une coamplification HER2/RARA, pourraient représenter une classe de tumeurs qui pourraient bénéficier d’un traitement avec des rétinoïdes, en augmentent la réponse au Herceptin et potentiellement en réduisant la résistance au Herceptin. En conclusion, les données présentées dans cette thèse aident à mieux comprendre les mécanismes menant à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires et fournissent une application potentielle pour l’utilisation de l’AR dans le traitement du cancer du sein.

Norm implementation in the enlarged European neighbourhood : justice and home affairs in Moldova and Ukraine

L’Union européenne (UE) se sert principalement d’outils normatifs pour exercer du pouvoir sur la scène internationale, notamment par la promotion de ses propres lois et standards. Le meilleur exemple est l’élargissement de l’UE, processus ayant contribué à stabiliser l'Europe et à transformer les candidats en des démocraties de marché, notamment en promouvant un rapprochement avec les normes européennes en échange d’une perspective d’adhésion à l’UE. La Politique européenne de Voisinage (PEV) utilise les mêmes mécanismes développés lors des élargissements, notamment la promotion de réformes en échange d’incitatifs financiers. Par contre, la PEV n’offre aucune perspective d’adhésion à l’UE aux États qui y participent. Ainsi, plusieurs études ont conclu que cette politique ne pourrait engendrer les réformes escomptées. Bien que la coopération au sein de la PEV ne soit pas aussi fructueuse que lors des élargissements, on remarque que certains pays plus que d’autres ont, malgré l’absence de perspective d’adhésion, fait des changements à leur législation en conformité avec les normes européennes. En comparant la coopération dans le secteur de la Justice et des affaires intérieures en Moldavie et en Ukraine, nous montrons que la différence s’explique par l’importance des facteurs internes des pays concernés, notamment l’existence d’identités nationales contestées et les batailles politiques intérieures portant sur la politique étrangère.

Regulation of lipid metabolism in adipocytes and hepatocytes by hexarelin through scavenger receptor CD36

Les sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) sont de petits peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance à partir de l’hypophyse via leur liaison au récepteur de la ghréline GHS-R1a. Le GHRP hexaréline a été utilisé afin d’étudier la distribution tissulaire de GHS-R1a et son effet GH-indépendant. Ainsi, par cette approche, il a été déterminé que l’hexaréline était capable de se lier à un deuxième récepteur identifié comme étant le récepteur scavenger CD36. Ce récepteur possède une multitude de ligands dont les particules oxLDL et les acides gras à longue chaîne. CD36 est généralement reconnu pour son rôle dans l’athérogénèse et sa contribution à la formation de cellules spumeuses suite à l’internalisation des oxLDL dans les macrophages/monocytes. Auparavant, nous avions démontré que le traitement des macrophages avec l’hexaréline menait à l’activation de PPARƔ via sa liaison à GHS-R1a, mais aussi à CD36. De plus, une cascade d’activation impliquant LXRα et les transporteurs ABC provoquait également une augmentation de l’efflux du cholestérol. Une stimulation de la voie du transport inverse du cholestérol vers les particules HDL entraînait donc une diminution de l’engorgement des macrophages de lipides et la formation de cellules spumeuses. Puisque CD36 est exprimé dans de multiples tissus et qu’il est également responsable du captage des acides gras à longue chaîne, nous avons voulu étudier l’impact de l’hexaréline uniquement à travers sa liaison à CD36. Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation du métabolisme des lipides par CD36, nous avons choisi des types cellulaires jouant un rôle important dans l’homéostasie lipidique n’exprimant pas GHS-R1a, soient les adipocytes et les hépatocytes. L’ensemble de mes travaux démontre qu’en réponse à son interaction avec l’hexaréline, CD36 a le potentiel de réduire le contenu lipidique des adipocytes et des hépatocytes. Dans les cellules adipeuses, l'hexaréline augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la mobilisation et l’oxydation des acides gras, et induit également l’expression des marqueurs thermogéniques PGC-1α et UCP-1. De même, hexaréline augmente l’expression des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale, un effet accompagné de changements morphologiques des mitochondries; des caractéristiques observées dans les types cellulaires ayant une grande capacité oxydative. Ces résultats démontrent que les adipocytes blancs traités avec hexaréline ont la capacité de se transformer en un phénotype similaire aux adipocytes bruns ayant l’habileté de brûler les acides gras plutôt que de les emmagasiner. Cet effet est également observé dans les tissus adipeux de souris et est dépendant de la présence de CD36. Dans les hépatocytes, nous avons démontré le potentiel de CD36 à moduler le métabolisme du cholestérol. En réponse au traitement des cellules avec hexaréline, une phosphorylation rapide de LKB1 et de l’AMPK est suivie d’une phosphorylation inhibitrice de l’HMG-CoA réductase (HMGR), l’enzyme clé dans la synthèse du cholestérol. De plus, la liaison d'hexaréline à CD36 provoque le recrutement d’insig-2 à HMGR, l’étape d’engagement dans sa dégradation. La dégradation de HMGR par hexaréline semble être dépendante de l’activité de PPARƔ et de l’AMPK. Dans le but d’élucider le mécanisme d’activation par hexaréline, nous avons démontré d’une part que sa liaison à CD36 provoque une déphosphorylation de Erk soulevant ainsi l’inhibition que celui-ci exerce sur PPARƔ et d’autre part, un recrutement de l’AMPK à PGC-1α expliquant ainsi une partie du mécanisme d’activation de PPARƔ par hexaréline. Les résultats générés dans cette thèse ont permis d’élucider de nouveaux mécanismes d’action de CD36 et d'approfondir nos connaissances de son influence dans la régulation du métabolisme des lipides.

Rôle du récepteur REG/EXTL3 dans l’inflammation et son implication possible dans l’ostéoarthrose (OA)

L’ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire dont l’incidence augmente avec le vieillissement de la population. Elle se caractérise par une détérioration progressive du cartilage articulaire accompagnée du remodelage de l’os sous-chondral et du changement des tissus mous de l’articulation. La douleur et le dysfonctionnement de l’articulation affectée sont généralement attribués à l’inflammation et l’épanchement de la synovie. Plusieurs évidences indiquent que l’inflammation de la membrane synoviale contribue grandement à la pathogenèse de l’OA. En effet, la synthèse et l’expression des enzymes protéolytiques qui dégradent la matrice cartilagineuse sont régulées par de nombreuses cytokines retrouvées au sein de ce foyer inflammatoire. Deux d’entre elles, l’interleukine-1 beta (IL-1β) et le «tumor necrosis factor » alpha (TNF-α), jouent un rôle majeur dans le déclenchement de l’inflammation associée à l’OA. Ces cytokines pro-inflammatoires agissent notamment sur les synoviocytes et les chondrocytes en activant NF-κB qui, à son tour, active les gènes de cytokines. Cette boucle de régulation positive amplifie et perpétue la réponse inflammatoire. Récemment, il a été rapporté que l’activation de NF-κB par TNF-α peut être potentialisée par EXTL3, un récepteur transmembranaire ; mais le mécanisme sous-jacent de cet effet demeure inconnu. Toutefois, les niveaux important d’EXTL3 et de son ligand Reg1B chez les patients arthrosiques, laissent croire que ces protéines jouent un rôle dans le développement de l’OA. Notre objectif était d’étudier le mécanisme par lequel EXTL3 amplifie l’activation de NF-κB par TNF-α et d’examiner si ce phénomène se produit aussi avec l’IL-1β. Nous avons utilisé les cellules C28/I2, une lignée cellulaire de chondrocytes, comme modèle d’étude. Les transfections transitoires avec un vecteur d’expression, les techniques d’immunofluorescence (IF), d’immunoprécipitation (IP) et d’immunobuvardage de type Western (IB); ont été utilisées dans le cadre de diverses approches expérimentales. Les résultats obtenus par transfection ont révélé que la protéine EXTL3 potentialisait l’activation de NF-κB aussi bien par IL-1β que par TNF-α. Ce résultat signifie que la potentialisation de l’activité NF-κB par EXTL3 n’est pas spécifique à TNF-α. D’autre part, l’IP avec TNFRI et TRAF2 a révélé la présence d’EXTL3 dans le complexe TNF-α/TNFRI/TRAF2 qui se forme au niveau de la membrane plasmique. De plus, ceci a été confirmé in vivo par microscopie confocale montrant la co-localisation de TNFRI-TRAF2-EXTL3 dans la membrane nucléaire, suggérant ainsi la formation d’un complexe identique au niveau des membranes plasmique et nucléaires. Toutefois, la présence du ligand Reg1B et/ou de la glucosamine inhibait la formation de ce complexe au niveau de la membrane plasmique, tout comme ils abolissaient la potentialisation de l’activité NF-κB par EXTL3. Ces résultats suggèrent non seulement que le recrutement d’EXTL3 libre dans le complexe TNF-α/TNFR1 est requis pour amplifier l’activation de NF-κB par TNF-α, mais aussi la capacité du ligand Reg1B et de la glucosamine à moduler cette activation à travers la baisse ou l’inhibition de l’interaction EXTL3-TNFR1. Les données de cette étude constituent une avancée majeure dans la compréhension des événements moléculaires qui contrôlent l’activation de NF-κB par les cytokines pro-inflammatoires. Ces résultats pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l’inflammation associée à l’OA et impliquant une activation incessante de NF-κB.

Relation entre le traitement maternel en bas âge et la régulation de la tristesse à huit ans : une étude de jumeaux

La présente étude porte sur les aspects Nature-Culture relatifs à l’émergence de variations interindividuelles quant à la capacité universelle de régulation d’une émotion primaire, la tristesse. Cette problématique représente un exemple du lien entre la conception évolutionniste d’une nature humaine universelle, innée et génétiquement prescrite, mais susceptible de variation dans son expression en fonction d’expériences individuelles liées aux processus de socialisation et d’enculturation. À l’aide du devis génétiquement informatif des jumeaux, nous nous sommes d’abord penchés sur l’étiologie gènes-environnement de la dépression à l’enfance, une dysfonction du système de régulation émotionnelle de la tristesse. Puis, nous nous sommes interrogés quant à l’influence du traitement et de l’état psychique maternels sur cet aspect du développement émotionnel de l’enfant. Nos analyses de la symptomatologie dépressive indiquent une absence d’influence génétique dans le développement de ce trouble de l’humeur. Les variations individuelles de la régulation de la tristesse reposent ainsi uniquement sur les effets de l’environnement. Nos résultats révèlent également l’existence d’une relation importante entre l’état psychique de la mère, évalué lorsque les jumeaux avaient cinq mois, et la présence de symptômes dépressifs chez ces derniers mesurés huit ans plus tard. L’état psychique de la mère est considéré comme l’un des meilleurs indicateurs de la qualité du traitement maternel en bas âge. Nos mesures directes des comportements maternels envers le nourrisson et le développement ultérieur du trouble de dépression indiquent également l’existence de tendances statistiques allant dans le sens de notre hypothèse d’un traitement maternel sous-optimal contribuant au développement de dysfonctions émotionnelles ultérieures.

Les effets d’un traitement chronique aux antipsychotiques sur la poursuite d’une récompense conditionnée

Les problèmes de toxicomanie sont très communs chez les schizophrènes. L’administration chronique d’antipsychotiques pourrait être impliquée dans cette cooccurrence en induisant une hypersensibilisation du système dopaminergique. Précédemment, nous avons démontré chez le rat qu’un traitement continu (via une mini-pompe osmotique sous-cutanée), et non pas intermittent (via des injections journalières sous-cutanées), avec l’halopéridol a augmenté la capacité de l’amphétamine à potentialiser un comportement de recherche de récompense. Dans cette étude, nous avons étudié les effets d’un antipsychotique atypique soit l’olanzapine comparé à l’halopéridol. Un traitement continu avec l’halopéridol, et non pas l’olanzapine, a augmenté la capacité de l’amphétamine de potentialiser la poursuite d’une récompense conditionnée (lumière/son préalablement associés à l’eau). De plus, un traitement continu avec l’halopéridol a augmenté l’induction par l’amphétamine de l’activité locomotrice et l’expression d’ARNm pour le c-fos (marqueur fonctionnel d’activité cellulaire) dans le caudé-putamen. Donc, un traitement continu avec un antipsychotique typique, et non pas atypique, a augmenté les caractéristiques motivationnelles attribuées à un stimulus neutre. Ceci est potentiellement lié à au développement d’un état de sensibilisation comportementale aux effets de l’amphétamine et à une augmentation de la capacité de l’amphétamine de susciter la modulation de l’activité du caudé-putamen. Ainsi, un antipsychotique typique tel que l’halopéridol semble modifier les circuits de la récompense de façon à contribuer à des comportements caractérisés par une recherche et une consommation de drogues d’abus alors qu’un antipsychotique atypique tel que l’olanzapine aurait moins tendance à le faire. Nous suggérons que les antipsychotiques atypiques pourraient être une meilleure option chez les patients schizophrènes à risque d’avoir un trouble de consommation de drogues d’abus ou de toxicomanie.

Système de recombinaison Xer chez Staphylococcus aureus

Le système de recombinaison Xer est impliqué dans la monomerisation des réplicons bactériens, comme les plasmides et les chromosomes, dans une grande variété de bactéries. Ce système est un système de recombinaison site-spécifique composé de deux tyrosine recombinases, soit XerC et XerD. Ils agissent ensemble afin de convertir les chromosomes dimériques en monomères en agissant à un site spécifique près du terminus de la réplication, appelé le site dif. Les gènes Xer et leur site d’action sont identifiés dans plusieurs bactéries gram positives et gram négatives. Staphylococcus aureus représente une bactérie gram positive qui contient un système XerCD/dif. Elle est impliqué dans plusieurs maladies humaines, tels que des infections cutanées, des gastroentérites, et le syndrome de choc toxique, pour en nommer quelques unes. Bien que les gènes codant les protéines XerC et XerD ont été identifiés, il y a beaucoup d’inconnu sur leur mode d’action au site dif. Des mutations dans XerC ont été obtenues, mais aucune dans XerD, suggérant que ce gène pourrait être essentiel pour cet organisme. Les études présentées dans ce mémoire ont permis de commencer à mieux caractériser XerD de S. aureus, en séquençant le gène et en faisant des tests de liaison à l’ADN. Elles ont montré que la recombinase XerD se lie au site dif d’Eschericia coli seul et de façon coopérative avec la recombinase XerC d’E. coli. XerD de S. aureus est, aussi, efficace dans la complémentation de XerD muté d’E. coli dans la réaction de recombinaison chromosomique. Cependant, elle ne démontre pas cette même capacité de complémentation lors de la recombinaison plasmidique aux sites cer.

Exclusion de liaison génétique au locus SPAX2 de cas canadiens-français d’ataxie spastique

Les ataxies héréditaires sont des désordres neuro-dégénératifs qui causent une ataxie comme symptôme primaire; soit une perte de coordination des mouvements volontaires, un sens de l’équilibre déficient et un trouble à la motricité. Elles forment un groupe cliniquement et génétiquement hétérogène. De ce fait, de nombreuses classifications existent basées sur différents critères. Cependant, le consensus actuel veut que le mode de transmission soit le critère premier de classement. On estime la prévalence mondiale des ataxies héréditaires à 6/100 000 bien que ce nombre diffère entre régions. C’est le cas du Québec où la structuration historique du bassin génétique canadien-français a menée à des effets fondateurs régionaux, ce qui a eu comme conséquence de hausser la prévalence régionale de certaines maladies. L’Acadie est également une région canadienne-française avec des effets fondateurs où le taux de prévalence de certaines ataxies héréditaires est plus élevé. Nous avons recruté huit familles canadiennes-françaises provenant de diverses régions du Québec, ayant un lien génétique plus ou moins rapproché avec l’Acadie, dans lesquelles nous avons observé dix cas d’une forme d’ataxie spastique autosomique récessive relativement légère qui a résistée à l’analyse des gènes d’ataxies connues. Nous avons émis l’hypothèse d’être en présence d’une nouvelle forme d’ataxie à effet fondateur pour la population canadienne-française. Afin d’identifier le gène muté responsable de cette ataxie, un criblage génomique des marqueurs SNP pour les individus recrutés fut effectué. Puis, par cartographie de l’homozygotie, une région de 2,5 Mb fut identifiée sur le chromosome 17p13 dans une famille. Une revue de la littérature nous a permis de constater, qu’en 2007, quatre familles nord-africaines atteintes d’une ataxie dénommée SPAX2 qui présentaient des manifestations cliniques semblables avaient déjà été liées au même locus sur le chromosome 17. Afin de supporter notre hypothèse que les malades étaient porteurs de deux copies de la même mutation fondatrice et de cartographier plus finement notre région d’intérêt, les haplotypes de tous les atteints de nos huit familles furent étudiés. Nous avons établie qu’un intervalle de 200 kb (70 SNP), soit du marqueur rs9900036 à rs7222052, était partagé par tous nos participants. Les deux gènes les plus prometteurs des 18 se trouvant dans la région furent séquencés. Aucune mutation ne fut trouvée dans les gènes SLC25A11 et KIF1C. Par la suite, une analyse de liaison génétique stricte avec calcul de LOD score nous a permis d’exclure ce locus de 200 kb comme étant celui porteur du gène muté causant l’ataxie dans la majorité de nos familles. Nous avons donc conclus que malgré qu’une famille soit homozygote pour une grande région du chromosome 17, l’absence d’Informativité des marqueurs SNP dans la région de 200 kb fut responsable de l’apparent partage d’haplotype homozygote. Le travail reste donc entier afin d’identifier les mutations géniques responsables de la présentation ataxique chez nos participants de souche acadienne.

Synthèse et caractérisation physicochimique de peptides de polyglutamines

Neuf maladies neurodégénératives sont le produit de l’expression de gènes mutés, dans lesquels le codon CAG est répété au-delà d’un seuil pathologique. Ceci produit des protéines mutantes dans lesquelles sont insérés des segments de polyglutamines (polyGln), qui perdent leur activité et acquièrent une nouvelle fonction, ce qui est toxique pour le neurone. Ces altérations sont attribuables aux propriétés particulières de la polyGln. En effet, ces dernières possèdent la capacité de s’assembler pour former des corps d’inclusion intracellulaires. Cette propension à l’agrégation de la polyGln rend difficile l’étude de ces pathologies. C’est ainsi que l’utilisation de peptides peut s’avérer une approche avantageuse. Toutefois, la synthèse de polyGln est associée à de nombreuses délétions et nécessite l’ajout de groupements chargés afin de permettre leur purification. Cependant, ce prérequis donne lieu à des interactions électrostatiques qui biaisent la structure et la cinétique d’agrégation de ces peptides, en plus d’interférer avec l’évaluation d’éventuels agents thérapeutiques. L’objectif du projet est de développer un système permettant l’étude de la polyGln en s’affranchissant des effets de charges. Pour ce faire, deux approches ont été explorées, la première utilise la polyGln non chargée et la seconde utilise une structure polyGln-morpholine ayant des charges labiles en fonction du pH. Ces peptides ont été produits en utilisant une approche linéaire de synthèse peptidique sur support solide avec protection maximale des chaînes latérales. La purification a été effectuée par chromatographie de haute performance en phase inverse en milieu acide. Ces stratégies ont permis de produire des peptides de polyGln de grande pureté avec des rendements acceptables. Une procédure de solubilisation des peptides alliant sonication et lyophilisation a été développée afin d’étudier chacun de ces peptides à l’aide de diverses techniques physicochimiques, telles que la diffusion de la lumière, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, Raman et UV-visible, le dichroïsme circulaire et la microscopie optique polarisée. La polyGln non chargée solubilisée dans le trifluoroéthanol-eau a montré que la taille des particules et la vitesse d’agrégation sont proportionnelles à la fraction volumique en eau. De plus, la structure secondaire en solution est à prédominance alpha et semble être peu sensible à la fraction d’eau jusqu’à un certain seuil (25%) après lequel la structure aléatoire prédomine. L’analyse des agrégats à l’état solide montre des structures hélicoïdales > aléatoires et ont les caractéristiques des fibrilles amyloïdes. Le peptide de polyGln-morpholines a un pKa de 7,3 en milieu aqueux. Il demeure en solution lorsque le pH < pKa et à faible force ionique, alors qu’il s’autoassemble lorsque ces conditions ne sont pas respectées. Ceci suggère que la répulsion électrostatique est responsable de la stabilisation du peptide en solution. La dimension fractale nous indique que le peptide forme des agrégats compacts dont les constituants ont une taille de 2,5 nm, compatibles avec une conformation aléatoire compacte, en coude bêta ou hélicoïdale. Ceci est en accord avec l’étude structurale des peptides en solution qui a montré des espèces aléatoires > bêta > alpha. De plus, en RMN, l’élargissement des signaux du 1Hγ en cours d’agrégation suggère une interaction via les chaînes latérales. Les analyses en phase solide ont plutôt montré une prédominance de structures bêta et alpha. L’inhibition de l’agrégation à pH 8 varie selon rouge de Congo > tréhalose, alors que le peptide liant la polyGln 1 et la thioflavine T ne semble pas avoir d’effet. Ces approches ont donc permis pour la première fois de s’affranchir des effets de charges auparavant inhérents à l’étude de la polyGln en solution et par conséquent d’obtenir des informations inédites quant à la solubilité, la structure et la cinétique d’agrégation. Enfin, le dispositif à charges labiles permet d’évaluer l’efficacité d’éventuels agents thérapeutiques à pH quasi physiologique.

MAST3 : facteur de risque génétique aux maladies inflammatoires de l’intestin et modulateur d’inflammation

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif qu’on regroupe sous le terme maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Les mécanismes moléculaires menant au développement des MII ne sont pas entièrement connus, mais des études génétiques et fonctionnelles ont permis de mettre en évidence des interactions entre des prédispositions génétiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale – qui contribuent au développement d’une dérégulation de la réponse immunitaire menant à l’inflammation de la muqueuse intestinale. Des études d’association pangénomiques et ciblées ont permis d’identifier plusieurs gènes de susceptibilité aux MII mais les estimations de la contribution de ces gènes à l’héritabilité suggèrent que plusieurs gènes restent à découvrir. Certains d’entre eux peuvent se trouver dans les régions identifiées par des études de liaison génétique. L’objectif de mon projet de doctorat était d’identifier un ou des facteurs de risque génétique dans la région chromosomale 19p (identifiée comme région de liaison IBD6) et de le/les caractériser au niveau fonctionnel. Nous avons d’abord entrepris une cartographie d’association de la région 19p. À la suite du génotypage successif de deux cohortes indépendantes, nous avons identifié un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localisés dans le gène microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associés aux MII. Peu d’information fonctionnelle sur MAST3 était disponible. Par contre MAST2, une protéine encodée par un gène de la même famille, régule l’activité du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirmé l’implication de MAST3 dans l’activité de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gène-rapporteur. Pour poursuivre la caractérisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non ciblée pour étudier les effets de la variation des niveaux d’expression de MAST3 sur la cellule. C’est-à-dire que nous avons créé un 1er modèle cellulaire de surexpression du gène MAST3 dans les cellules HEK293 et analysé l’expression pangénomique endogène. La validation de l’expression génique dans un 2e modèle cellulaire de knockdown et de type cellulaire différent (THP1), nous a permis d’identifier et de contrer les effets non-spécifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre étude d’expression a mené à l’identification d’un groupe de gènes dont l’expression est régulée par MAST3. Ces gènes sont majoritairement impliqués dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, régulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est régulée par NF-kappaB. Nous avons évalué l’importance du groupe de gènes régulés par MAST3 dans la présentation clinique des MII à travers des études d’expression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constaté que l’expression de ces gènes est significativement supérieure dans les régions enflammées par rapport aux régions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les résultats de nos études suggèrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans l’inflammation intestinale typique des MII. Chaque étude génétique sur les MII a le potentiel d’orienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dévoilement des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces voies permet d’augmenter les connaissances sur le développement de ces maladies vers une compréhension plus complète de la pathogenèse qui permettra d’optimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies.