CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE PEDÚNCULOS DE CAJUEIRO PARA COMERCIALIZAÇÃO IN NATURA

Com o objetivo de selecionar pedúnculos de cajueiro-anão precoce (Anacardium occidentale L. var. nanum) para comercialização in natura, foram avaliados 09 clones selecionados a partir de um experimento de competição sob irrigação, no município de Mossoró-RN. O clone CCP 76 foi utilizado como testemunha. Os cajus foram colhidos em agosto de 1997 e avaliados quanto às seguintes características: textura, tamanho (diâmetros apical e basal e comprimento), formato, coloração (carta de cores e pigmentos) e peso (total e pedúnculo). Dentre os materiais avaliados, apenas o CCP 09 apresentou cor inferior à testemunha, sendo que os clones CAP 6 (500), END 157, END 189 e END 329 destacaram-se com coloração mais intensa que a mesma. Além da testemunha, apenas os clones END 157, 183 e 189 apresentaram pedúnculos que podem ser classificados como tipo 4 (de maior valor comercial), enquanto, com relação à forma, apenas os clones CAP 6 (500), END 157 e END 183 apresentaram formato piriforme. O clone END 157 apresentou as melhores características para comercialização in natura, inclusive quando comparado à testemunha. Os clones END 183 e 189 apresentaram resultados semelhantes à testemunha, com exceção da cor para o 183 e do formato para o 189.

PROPAGAÇÃO DO UMEZEIRO (Prunus mume Sieb & Zucc.) POR ESTAQUIA HERBÁCEA

A utilização do umezeiro ou damasqueiro-japonês (Prunus mume Sieb & Zucc.) como porta-enxerto de Prunus sp. vem despertando grande interesse em função de sua rusticidade, resistência a pragas e doenças, adaptação e, principalmente, por reduzir o porte de pessegueiros e nectarineiras. Este trabalho foi conduzido no Departamento de Produção Vegetal da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal-SP, e teve por objetivo estudar a propagação vegetativa desta espécie. Para tanto, utilizaram-se estacas herbáceas com 12cm de comprimento dos Clones 02; 05; 10 e 15, provenientes do Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico de Campinas, submetidas às concentrações de 0 e 2000mg.L-1 de AIB, por cinco segundos. O experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com 4 repetições de 20 estacas por parcela, esquema fatorial 4 x 2, sendo o fator clone em 4 níveis (Clones 02; 05; 10 e 15) e AIB em 2 níveis (0 e 2000mg.L-1). De acordo com os resultados, verificou-se diferença entre os clones quanto à porcentagem de enraizamento, sendo o Clone 15 significativamente superior ao Clone 02 (93,75% e 78,13%, respectivamente). Os Clones 05 (85,0%) e 10 (83,13%) comportaram-se como intermediários, não diferindo dos demais. Não houve diferença entre os clones testados quanto à formação de calo, raízes por estaca, comprimento de raízes e porcentagem de estacas brotadas. O ácido indolbutírico na concentração de 2000mg.L-1 favoreceu a emissão de raízes adventícias e aumentou o comprimento das raízes, mas não teve influência na brotação das estacas. Não houve efeito da interação entre os fatores testados para as variáveis analisadas.

Targeting Cytokines: Production and Characterization of Anti-TNF-α scFvs by Phage Display Technology.

The antibody display technology (ADT) such as phage display (PD) has substantially improved the production of monoclonal antibodies (mAbs) and Ab fragments through bypassing several limitations associated with the traditional approach of hybridoma technology. In the current study, we capitalized on the PD technology to produce high affinity single chain variable fragment (scFv) against tumor necrosis factor-alpha (TNF- α), which is a potent pro-inflammatory cytokine and plays important role in various inflammatory diseases and malignancies. To pursue production of scFv antibody fragments against human TNF- α, we performed five rounds of biopanning using stepwise decreased amount of TNF-α (1 to 0.1 μ g), a semi-synthetic phage antibody library (Tomlinson I + J) and TG1 cells. Antibody clones were isolated and selected through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) screening. The selected scFv antibody fragments were further characterized by means of ELISA, PCR, restriction fragment length polymorphism (RFLP) and Western blot analyses as well as fluorescence microscopy and flow cytometry. Based upon binding affinity to TNF-α , 15 clones were selected out of 50 positive clones enriched from PD in vitro selection. The selected scFvs displayed high specificity and binding affinity with Kd values at nm range to human TNF-α . The immunofluorescence analysis revealed significant binding of the selected scFv antibody fragments to the Raji B lymphoblasts. The effectiveness of the selected scFv fragments was further validated by flow cytometry analysis in the lipopolysaccharide (LPS) treated mouse fibroblast L929 cells. Based upon these findings, we propose the selected fully human anti-TNF-α scFv antibody fragments as potential immunotherapy agents that may be translated into preclinical/clinical applications.

'Tropical': uma nova seleção de tangerina 'Sunki'

Situado no município de Cruz das Almas, Recôncavo Baiano, o Programa de Melhoramento Genético de Citros da Embrapa Mandioca e Fruticultura possui ações dirigidas ao desenvolvimento de novos porta-enxertos, adaptados a condições de cultivo tropicais, compreendendo: hibridações controladas, visando à exploração da ampla variabilidade genética existente em Citrus e gêneros afins; introdução de novas variedades a partir de várias regiões do País e do exterior; seleção de clones nucelares, relacionados a porta-enxertos tradicionais, porém possuidores de características de interesse agronômico que os distinguem de seus padrões varietais. O presente trabalho refere-se a estudos pertinentes a esta última linha de pesquisa, baseados em avaliações dirigidas a 20 seleções de tangerina 'Sunki', tendo como objetivo principal a identificação de indivíduos que se destacam pela produção de frutos com um número médio de sementes superior ao comumente verificado nesse porta-enxerto. As análises realizadas compreenderam os seguintes caracteres: número médio de sementes por fruto, número médio de embriões por semente, intervalo de variação do número de embriões por semente, porcentagem de poliembrionia e tamanho de embrião. Os resultados obtidos permitem indicar a seleção 'Sunki Tropical' como alternativa de uso em programas de diversificação de porta-enxertos nas condições em que esta tangerina apresenta boa adaptação, principalmente em função de seu elevado número médio de sementes por fruto (18,7) e previsível uniformidade de seedlings, esta decorrente de sua elevada porcentagem de poliembrionia, próxima a 100%.

Enhanced cytotoxicity and decreased CD8 dependence of human cancer-specific cytotoxic T lymphocytes after vaccination with low peptide dose.

In mice, vaccination with high peptide doses generates higher frequencies of specific CD8+ T cells, but with lower avidity compared to vaccination with lower peptide doses. To investigate the impact of peptide dose on CD8+ T cell responses in humans, melanoma patients were vaccinated with 0.1 or 0.5 mg Melan-A/MART-1 peptide, mixed with CpG 7909 and Incomplete Freund's adjuvant. Neither the kinetics nor the amplitude of the Melan-A-specific CD8+ T cell responses differed between the two vaccination groups. Also, CD8+ T cell differentiation and cytokine production ex vivo were similar in the two groups. Interestingly, after low peptide dose vaccination, Melan-A-specific CD8+ T cells showed enhanced degranulation upon peptide stimulation, as assessed by CD107a upregulation and perforin release ex vivo. In accordance, CD8+ T cell clones derived from low peptide dose-vaccinated patients showed significantly increased degranulation and stronger cytotoxicity. In parallel, Melan-A-specific CD8+ T cells and clones from low peptide dose-vaccinated patients expressed lower CD8 levels, despite similar or even stronger binding to tetramers. Furthermore, CD8+ T cell clones from low peptide dose-vaccinated patients bound CD8 binding-deficient tetramers more efficiently, suggesting that they may express higher affinity TCRs. We conclude that low peptide dose vaccination generated CD8+ T cell responses with stronger cytotoxicity and lower CD8 dependence.

Componentes da variância em caracteres agronômicos de acerola

Estimaram-se os componentes da variância e sua participação porcentual na variância de caracteres de genótipos de acerola de Itápolis, Viradouro e Jaboticabal. Realizaram-se avaliações em folhas, frutos e outros caracteres das plantas, de dez/97 a jan/99. Na estimação, adotaram-se os modelos com clones, épocas e clones x épocas, quando havia duas plantas do mesmo clone e com genótipos e épocas, quando havia uma planta por genótipo. Verificaram-se diferenças significativas em clones, épocas e clones x épocas em todos os caracteres, exceto comprimento de folhas (CMFO), rendimento de polpa (RMP20FR) e dias em colheita, que apresentaram significância em fatores específicos. A variância ambiental interfere mais acentuadamente em largura de folha (LMFO), massa de polpa, quantidade de vitamina C (VITC), RMP20FR e crescimento de ramos. Os proporcionalmente elevados componentes de variância genética de CMFO, LMFO, altura de planta, diâmetro de copa, altura de fruto, VITC e massa de fruto tornam efetiva a seleção de genótipos.

Melhoramento do cajueiro-anão-precoce: avaliação da qualidade do pedúnculo e a heterose dos seus híbridos

O consumo de pedúnculo de caju "in natura" vem experimentando incremento no Brasil após o cultivo dos novos clones de cajueiro-anão-precoce lançados nos anos oitenta. Apesar desses avanços, o consumo ainda é reduzido, uma vez que não ultrapassa 1% das cerca de 1,5 milhão de toneladas anuais produzidas no Nordeste. Este baixo consumo deve-se a alguns fatores, como o teor de tanino (0,27% a 0,72%) existente nos tipos cultivados de A. occidentale L. Por isso, a Embrapa vem realizando pesquisa objetivando a melhoria dessa característica nos clones anão-precoce CP76 e CP09, via retrocruzamento, com a espécie A. microcarpum L. Neste trabalho, iniciado em 1999, avaliaram-se o tanino, a acidez total (ATT%), os sólidos solúveis totais (SST), a relação SST/ATT, o pH e a textura de pedúnculos dos genitores empregados nos retrocruzamentos e seus respectivos híbridos, com os seguintes resultados: a) confirmaram-se os baixos teores de tanino (0,14%) e de ATT (0,16%) no A. microcarpum em relação às médias dos clones CP76 e CP09 (0,33% para tanino e 0,26% para ATT); b) o A. microcarpum também foi superior quanto à relação SST/ATT (80,6%) e a textura do pedúnculo (10,75 N), sendo os valores dos clones de 47,9 e 6,9N, respectivamente; c) estes resultados confirmam a importância do A. microcarpum como pai doador no melhoramento genético; d) os genitores não diferiram quanto aos teores de sólidos solúveis totais (SST) e pH; e) os híbridos entre A. microcarpum e A. occidentale exibiram acentuado vigor híbrido com relação aos teores de tanino, acidez e textura, e ausência de vigor híbrido em relação aos valores do pH e de sólidos solúveis totais (SST); f) não houve efeito nos cruzamentos recíprocos, para a maioria das características estudadas, à exceção do tanino.

Caracterização físico-morfológica de frutos de microtangerinas (Citrus spp.) de potencial utilização como porta-enxertos

O presente trabalho objetivou caracterizar espécies e variedades de Citrus do grupo das microtangerinas de valor potencial como porta-enxertos, de modo a propiciar maior conhecimento desse grupo de plantas e oferecer subsídios para futuras pesquisas. Um total de 14 variedades/clones foram descritas, incluindo as seguintes espécies: C. reshni Hort. ex Tan., C. sunki Hort. ex Tan, C. pectinifera Tan., C. crenatifolia Lush., C. amblycarpa Och., C. tachibana Tan., C. lycopersicaeformis Hort. ex Tan., C. keraji Hort. ex Tan. e C. reticulata Blanco. A pesquisa foi conduzida no Departamento de Horticultura da FCA-Unesp, Botucatu-SP e os frutos foram obtidos dos BAGs de Citros da FCA-Unesp-SP, e do CCSM-IAC, Cordeirópolis-SP. Descritores físicos e morfológicos de frutos indicaram diferenças entre espécies/variedades. As microtangerinas apresentaram características semelhantes quanto ao pequeno tamanho dos frutos, forma oblata e coloração laranja dos frutos. C. amblycarpa, C. sunki e C. tachibana produziram os frutos de menor tamanho e espessura de casca. Elevado número de sementes por fruto foi encontado nas tangerinas 'Cleópatra', 'Sun Chu Sha Kat', 'Suen Kat' e 'Heennaran', enquanto 'Sunki' apresentou elevado número de sementes abortadas. Parece discutível a posição botânica de 'Suen Kat', ao que se propõe considerar a mesma como uma variedade de C. sunki.

Comportamento da cajazeira enxertada sobre umbuzeiro em Pacajus-CE

A cajazeira é uma fruteira da família Anacardiaceae, explorada extrativamente, cujos frutos são nuculânios amarelos, de sabor agridoce, perfumados, ricos em carotenóides, açúcares, vitaminas A e C, denominados de taperebá, cajá-mirim ou cajá e muito utilizados na alimentação humana. Os problemas mais limitantes ao cultivo da cajazeira são a inexistência de clones recomendados para cultivo comercial e o elevado porte da planta. A cajazeira enxertada sobre umbuzeiro apresenta compatibilidade e afinidade entre as partes enxertadas e pouco interfere na forma de crescimento da planta, que é muito semelhante à de planta oriunda de semente, ou seja, tendência em formar caule de haste única e copa alta. A cultura ainda exige estudos sobre as modalidades e épocas de realização das podas para o controle do crescimento da planta e formação de copas que se enquadrem dentro de modelos de exploração intensiva.

Estudos histológicos preliminares da microenxertia de plantas micropropagadas de macieira

A fruticultura moderna necessita implantar tecnologias que possibilitem a produção de frutos de alta qualidade, com custos cada vez menores. A micropropagação associada à microenxertia possibilita altas taxas de multiplicação de plantas com alta qualidade fitossanitária, além de possibilitar a realização de estudos sobre compatibilidade de enxertia em diferentes clones. O presente trabalho tem como objetivo estudar o processo de soldadura entre genótipos de macieira (Malus domestica. Borkh) multiplicadas in vitro após a microenxertia. Esta técnica foi realizada em fenda simples, sob condições assépticas. Os estudos histológicos foram realizados através de cortes longitudinais seriados de segmentos de 8 mm do ponto de enxertia. O processo de soldadura foi caracterizado pelo desenvolvimento de tecido meristemático, originando células parenquimáticas na interface do microenxerto, com a proliferação do tecido cambial da cultivar copa. Isso possibilita a ligação do sistema vascular da copa com o do porta-enxerto, resultando na sobrevivência do microenxerto.

Influence of the temperature in germination of seeds of jabuticaba tree

The jaboticaba tree (Myrciaria spp.) is originated from the center-south of Brazil and presents different types. It's a medium size tree, with tendency to form a crown with great number of branches. A characteristic considered as limitant for the commercial crop is the great juvenility, advicing producing good rootstocks of seedlings and graft wanted varieties, and other vegetative processes. With the purpose of evaluating the effect of temperature on germination of three clones of jaboticaba tree, was carried out a laboratorial research. It was observed influence of the temperature on germination. The highest percentage of germination was obtained at low temperature (15ºC and 20ºC). When it was used the temperature of 35ºC, two clones had only 8% of germination, while the other one was verified 35%. These values show the possibility of the ocurrence of variability among the clones of jaboticaba tree.

Maravilha: uma nova seleção de tangerina 'Sunki'

Apesar das variações somáticas identificadas em pomares comerciais e em coleções de variedades serem, geralmente, desfavoráveis, apresentando baixa produtividade de frutos, morfologia foliar atípica ou frutos anormais, inúmeras mutações espontâneas de inquestionável valor têm sido identificadas, haja vista que a grande maioria das variedades cítricas comerciais, copas e porta-enxertos surgiu como decorrência de algum tipo de mutação natural. O presente trabalho diz respeito à exploração dessa importante via de obtenção de novos clones e variedades, fazendo parte de ações do Programa de Melhoramento Genético de Citros da Embrapa Mandioca e Fruticultura. Refere-se a uma nova seleção de tangerina 'Sunki', denominada 'Maravilha', identificada dentro de um grupo de seedlings nucelares da seleção 'da Flórida'. Foram realizadas comparações da 'Sunki Maravilha' com outras três seleções dessa tangerina, 'Comum', 'da Flórida' e 'Tropical', compreendendo os caracteres: número médio de sementes por fruto, número médio de embriões por semente, intervalo de variação do número de embriões por semente, porcentagem de poliembrionia e tamanho de embrião. Comparações foram efetuadas, também, com outros importantes porta-enxertos comerciais, limões 'Cravo' e 'Volkameriano' e tangerina 'Cleópatra', relativas a caracteres relacionados à germinação de sementes e ao vigor de seedlings (altura e número de folhas verdadeiras). Os resultados obtidos permitem indicar a seleção 'Sunki Maravilha' como alternativa de uso em programas de diversificação de porta-enxertos, nas condições em que esta tangerina apresenta boa adaptação, principalmente em função de seu relativamente elevado número médio de sementes por fruto (7,7), previsível uniformidade de seedlings, esta decorrente da elevada porcentagem de poliembrionia (100%), boa germinação de sementes e vigor de seedlings, além de provável resistência à gomose de Phytophthora spp.

Characterization and functional identification of a novel plant extradiol 4,5-dioxygenase involved in betalain pigment biosynthesis in Portulaca Grandiflora

RESUME Les bétalaïnes sont des pigments chromo-alcaloïdes violets et jaunes présents dans les plantes appartenant à l'ordre des Caryophyllales et dans les champignons des genres Amanita et Hygrocybe. Leur courte voie de biosynthèse est élucidée chimiquement depuis de nombreuses années, mais les enzymes impliquées dans cette biosynthèse chez les plantes ne sont toujours pas caractérisées. L'enzyme de la DOPA-dioxygénase d' Amanita muscaria a été identifiée (Girod et Zryd, 1991a), mais de nombreuses tentatives d'isolation d'un homologue chez les plantes ont échoué. Afin d'isoler les gènes spécifiques des bétalaïnes chez les plantes, nous avons construit des banques soustraites d'ADNc à partir d'ARN total de pétales immatures de Portulaca grandiflora (Pg) de génotypes jaunes et blancs, respectivement violets et blancs. Les clones couleur- spécifiques ont été détectés en premier par analyse Northem du RNA de pétales blancs et colorés. Les candidats positifs ont alors été soumis à une analyse de transcription au niveau des tiges colorées, vertes et des feuilles, afin d'établir leur expression spécifique. Deux ARNs messagers complets ont une expression corrélée avec l'accumulation des bétalaïnes dans les tissus. Le premier de ces clones, A.16, code pour une oxydase de l'acyl-Coenzyme A (ACX) putative, mais le domaine de liaison du FAD essentiel pour l'activité d'ACX est absent. Toutes nos tentatives pour démontrer sa fonction ont échoué. Le rôle de cette protéine dans la voie de synthèse des bétalaïnes reste inconnu. Le deuxième de ces clones spécifique aux bétalaïnes, L.6 (isolé par Zaiko, 2000), a été renommé DODA en raison de son homologie avec le domaine LigB (pfam02900) d'une 4,5-dioxygénase extradiol bactérienne. DODA a été identifié in silico comme une dioxygénase extradiol en raison de la conservation stricte, au niveau de sa séquence peptidique, des résidus catalytiques de LigB et de ceux liant le cofacteur fer. Une analyse de transfert Southem a montré que ce gène est unique dans Pg. L'expression transitoire de DODA par transformation biolistique dans des pétales blancs de Pg a produit des taches violettes ou jaunes dans des cellules transformées. Une analyse HPLC de ces taches a démontré leur identité avec les bétalaïnes présentes naturellement dans les pétales violets et jaunes de Pg, confirmant ainsi la complémentation par le gène Pg DODA de l'allèle récessif cc présent dans les pétales blancs de Pg. Des homologues de DODA (DOPA-dioxygénase) ont été identifiés dans de nombreuses espèces de plantes, y compris dans celles sans bétalaïne. L'alignement de ces homologues a permis l'identification d'un motif spécifique aux bétalaïnes à côté d'une histidine catalytique conservée. Ce motif [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] remplace le motif [H-N-L-R] conservé dans les plantes sans bétalaïne et le motif [H-N-L-x] présent dans tous les homologues bactériens et archaebactériens. Une modélisation tridimensionnelle préliminaire du site actif de Pg DODA et de son homologue dans la mousse Physcomitrella patens a montré l'importance de ce motif spécifique aux bétalaïnes pour l'accessibilité du substrat au site actif. L'analyse phylogénétique de DODA a confirmé l'évolution séparée de cette protéine chez les plantes à bétalaïnes par comparaison avec celle des plantes sans bétalaïne. Nous avons donc conclu que les bétalaïnes sont apparues par modification de l'affinité pour un substrat d'enzymes similaires à DODA, chez un ancêtre unique des Caryophyllales qui a perdu toute capacité de biosynthèse des anthocyanes. Finalement, Pg DODA n'a aucune similarité avec la protéine DODA d' Amanita muscaria, bien que celle-ci complémente aussi la pigmentation des pétales blancs de Pg. La biosynthèse des bétalaïnes est un exemple remarquable de convergence évolutive biochimique indépendante entre espèces de règnes différents. ABSTRACT Betalains are violet and yellow chromo-alkaloid pigments present in plants belonging to the order Caryophyllales and also in the fungal genera Amanita and Hygrocybe. Their short biosynthetic pathway is chemically well understood since many years, but enzymes involved in the plant pathway are still uncharacterized. The DOPA-dioxygenase from Amanita muscaria was identified (Girod and Zryd, 1991a), but numerous attempts to identify a plant homologue to the corresponding gene, failed. In order to isolate betalain-specific genes in plants, subtractive cDNA libraries were built with total RNA from white and yellow and respectively, violet immature petals from Portulaca grandiflora (Pg) genotypes. Colour-specific clones were first detected by Northern blot analysis using RNA from white and coloured petals. Positive candidates were submitted to further transcription analysis in coloured, green stems and leaves in order to assess their specific expression. Two full-length mRNAs showed a correlated expression with betalain accumulation in tissues. One of them, A.16, encodes a putative acyl-Coenzyme A oxidase (ACX), but missing the FAD binding domain essential for the ACX activity. Thus, all attempts to demonstrate its function failed. The role of this protein in the betalain biosynthesis pathway, if any, is still unknown. The second betalain-specific mRNA, L.6 (isolated by Zaiko, 2000) shows a homology with a LigB domain (pfam02900) from a bacterial extradiol 4,5-dioxygenase. It was then renamed DODA (DOPA-dioxygenase). DODA was identified in silico as a highly conserved extradiol dioxygenase due to the strict conservation of its peptidic sequence with LigB catalytic residues and iron-binding cofactor residues. Southern blot analysis showed that this gene is a single copy-gene in Pg. Transient expression of DODA protein through biolistic transformation of Pg white petals produced violet or yellow spots in individual cells. HPLC analysis of these spots showed an identity with betalain pigments present naturally in yellow and violet Pg petals, thus confirming the complementation of the recessive cc allele present in Pg white petals by Pg DODA gene. DODA homologues were identified in numerous plant species including those without betalain. Alignment of these homologues allowed the identification of a betalain-specific pattern beside a highly conserved catalytic histidine. This [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] pattern replaces a [H-N-L-R] pattern strictly conserved in non-betalain plants and a [H-N-L-x] pattern present in all bacterial and archaebacterial homologues. Preliminary three-dimensional modeling of the active site of Pg DODA and its Physcomitrella patens moss homologue revealed the importance of this betalain-specific pattern for the substrate accessibility to the DODA active site. DODA phylogenetic analysis confirmed the separate evolution of this protein in betalain-producing plants. We conclude that betalain pigments appeared in a unique ancestor of the Caryophyllales order in which anthocyanin biosynthetic pathway was impaired, by a modification of enzymes of the DODA family for substrate affinity. The Pg DODA protein has no sequence similarity with Amanita muscaria DODA, despite the fact that they both complement Pg white petals for their pigmentation. Betalain biosynthesis is an interesting example of independent biochemical evolutionary convergence between species from different kingdoms.

The use of positional scanning synthetic combinatorial libraries (PS-SCL) to study T Lympohcyte specificity and degeneracy

Les cellules CD8? T cytolytiques (CTL) sont les principaux effecteurs du système immunitaire adaptatif contre les infections et les tumeurs. La récente identification d?antigènes tumoraux humains reconnus par des cellules T cytolytiques est la base pour le, développement des vaccins antigène spécifiques contre le cancer. Le nombre d?antigènes tumoraux reconnus par des CTL que puisse être utilisé comme cible pour la vaccination des patients atteints du cancer est encore limité. Une nouvelle technique, simple et rapide, vient d?être proposée pour l?identification d?antigènes reconnus par des CTL. Elle se base sur l?utilisation de librairies combinatoriales de peptides arrangées en un format de "scanning" ou balayage par position (PS-SCL). La première partie de cette étude a consisté à valider cette nouvelle technique par une analyse détaillée de la reconnaissance des PS-SCL par différents clones de CTL spécifiques pour des antigènes associés à la tumeur (TAA) connus ainsi que par des clones de spécificité inconnue. Les résultats de ces analyses révèlent que pour tous les clones, la plupart des acides aminés qui composent la séquence du peptide antigénique naturel ont été identifiés par l?utilisation des PS-SCL. Les résultats obtenus ont permis d?identifier des peptides analogues ayant une antigènicité augmentée par rapport au peptide naturel, ainsi que des peptides comportant de multiples modifications de séquence, mais présentant la même réactivité que le peptide naturel. La deuxième partie de cette étude a consisté à effectuer des analyses biométriques des résultats complexes générés par la PS-SCL. Cette approche a permis l?identification des séquences correspondant aux épitopes naturels à partir de bases de données de peptides publiques. Parmi des milliers de peptides, les séquences naturelles se trouvent comprises dans les 30 séquences ayant les scores potentiels de stimulation les plus élevés pour chaque TAA étudié. Mais plus important encore, l?utilisation des PS-SCL avec un clone réactif contre des cellules tumorales mais de spécificité inconnue nous a permis d?identifier I?epitope reconnu par ce clone. Les données présentées ici encouragent l?utilisation des PS-SCL pour l?identification et l?optimisation d?épitopes pour des CTL réactifs anti-tumoraux, ainsi que pour l?étude de la reconnaissance dégénérée d?antigènes par les CTL.<br/><br/>CD8+ cytolytic T lymphocytes (CTL) are the main effector cells of the adaptive immune system against infection and tumors. The recent identification of moleculariy defined human tumor Ags recognized by autologous CTL has opened new opportunities for the development of Ag-specific cancer vaccines. Despite extensive work, however, the number of CTL-defined tumor Ags that are suitable targets for the vaccination of cancer patients is still limited, especially because of the laborious and time consuming nature of the procedures currentiy used for their identification. The use of combinatorial peptide libraries in positionai scanning format (Positional Scanning Synthetic Combinatorial Libraries, PS-SCL)' has recently been proposed as an alternative approach for the identification of these epitopes. To validate this approach, we analyzed in detail the recognition of PS-SCL by tumor-reactive CTL clones specific for multiple well-defined tumor-associated Ags (TAA) as well as by tumor-reactive CTL clones of unknown specificity. The results of these analyses revealed that for all the TAA-specific clones studied most of the amino acids composing the native antigenic peptide sequences could be identified through the use of PS-SCL. Based on the data obtained from the screening of PS-SCL, we could design peptide analogs of increased antigenicity as well as cross-reactive analog peptides containing multiple amino acid substitutions. In addition, the resuits of PS-SCL-screening combined with a recently developed biometric data analysis (PS-SCL-based biometric database analysis) allowed the identification of the native peptides in public protein databases among the 30 most active sequences, and this was the case for all the TAA studied. More importantiy, the screening of PS- SCL with a tumor-reactive CTL clone of unknown specificity resulted in the identification of the actual epitope. Overall, these data encourage the use of PS-SCL not oniy for the identification and optimization of tumor-associated CTL epitopes, but also for the analysis of degeneracy in T lymphocyte receptor (TCR) recognition of tumor Ags.<br/><br/>Les cellules T CD8? cytolytiques font partie des globules blancs du sang et sont les principales responsables de la lutte contre les infections et les tumeurs. Les immunologistes cherchent depuis des années à identifier des molécules exprimées et présentées à la surface des tumeurs qui puissent être reconnues par des cellules T CD8? cytolytiques capables ensuite de tuer ces tumeurs de façon spécifique. Ce type de molécules représente la base pour le développement de vaccins contre le cancer puisqu?elles pourraient être injectées aux patients afin d?induire une réponse anti- tumorale. A présent, il y a très peu de molécules capables de stimuler le système immunitaire contre les tumeurs qui sont connues parce que les techniques développées à ce jour pour leur identification sont complexes et longues. Une nouvelle technique vient d?être proposée pour l?identification de ce type de molécules qui se base sur l?utilisation de librairies de peptides. Ces librairies représentent toutes les combinaisons possibles des composants de base des molécules recherchées. La première partie de cette étude a consisté à valider cette nouvelle technique en utilisant des cellules T CD8? cytolytiques capables de tuer des cellules tumorales en reconnaissant une molécule connue présente à leur surface. On a démontré que l?utilisation des librairies permet d?identifier la plupart des composants de base de la molécule reconnue par les cellules T CD8? cytolytiques utilisées. La deuxième partie de cette étude a consisté à effectuer une recherche des molécules potentiellement actives dans des protéines présentes dans des bases des données en utilisant un programme informatique qui permet de classer les molécules sur la base de leur activité biologique. Parmi des milliers de molécules de la base de données, celles reconnues par nos cellules T CD8? cytolytiques ont été trouvées parmi les plus actives. Plus intéressant encore, la combinaison de ces deux techniques nous a permis d?identifier la molécule reconnue par une population de cellules T CD8? cytolytiques ayant une activité anti-tumorale, mais pour laquelle on ne connaissait pas la spécificité. Nos résultats encouragent l?utilisation des librairies pour trouver et optimiser des molécules reconnues spécifiquement par des cellules T CD8? cytolytiques capables de tuer des tumeurs.

CleanEx: a database of heterogeneous gene expression data based on a consistent gene nomenclature and linked to an improved annotation system

Résumé: L'automatisation du séquençage et de l'annotation des génomes, ainsi que l'application à large échelle de méthodes de mesure de l'expression génique, génèrent une quantité phénoménale de données pour des organismes modèles tels que l'homme ou la souris. Dans ce déluge de données, il devient très difficile d'obtenir des informations spécifiques à un organisme ou à un gène, et une telle recherche aboutit fréquemment à des réponses fragmentées, voir incomplètes. La création d'une base de données capable de gérer et d'intégrer aussi bien les données génomiques que les données transcriptomiques peut grandement améliorer la vitesse de recherche ainsi que la qualité des résultats obtenus, en permettant une comparaison directe de mesures d'expression des gènes provenant d'expériences réalisées grâce à des techniques différentes. L'objectif principal de ce projet, appelé CleanEx, est de fournir un accès direct aux données d'expression publiques par le biais de noms de gènes officiels, et de représenter des données d'expression produites selon des protocoles différents de manière à faciliter une analyse générale et une comparaison entre plusieurs jeux de données. Une mise à jour cohérente et régulière de la nomenclature des gènes est assurée en associant chaque expérience d'expression de gène à un identificateur permanent de la séquence-cible, donnant une description physique de la population d'ARN visée par l'expérience. Ces identificateurs sont ensuite associés à intervalles réguliers aux catalogues, en constante évolution, des gènes d'organismes modèles. Cette procédure automatique de traçage se fonde en partie sur des ressources externes d'information génomique, telles que UniGene et RefSeq. La partie centrale de CleanEx consiste en un index de gènes établi de manière hebdomadaire et qui contient les liens à toutes les données publiques d'expression déjà incorporées au système. En outre, la base de données des séquences-cible fournit un lien sur le gène correspondant ainsi qu'un contrôle de qualité de ce lien pour différents types de ressources expérimentales, telles que des clones ou des sondes Affymetrix. Le système de recherche en ligne de CleanEx offre un accès aux entrées individuelles ainsi qu'à des outils d'analyse croisée de jeux de donnnées. Ces outils se sont avérés très efficaces dans le cadre de la comparaison de l'expression de gènes, ainsi que, dans une certaine mesure, dans la détection d'une variation de cette expression liée au phénomène d'épissage alternatif. Les fichiers et les outils de CleanEx sont accessibles en ligne (http://www.cleanex.isb-sib.ch/). Abstract: The automatic genome sequencing and annotation, as well as the large-scale gene expression measurements methods, generate a massive amount of data for model organisms. Searching for genespecific or organism-specific information througout all the different databases has become a very difficult task, and often results in fragmented and unrelated answers. The generation of a database which will federate and integrate genomic and transcriptomic data together will greatly improve the search speed as well as the quality of the results by allowing a direct comparison of expression results obtained by different techniques. The main goal of this project, called the CleanEx database, is thus to provide access to public gene expression data via unique gene names and to represent heterogeneous expression data produced by different technologies in a way that facilitates joint analysis and crossdataset comparisons. A consistent and uptodate gene nomenclature is achieved by associating each single gene expression experiment with a permanent target identifier consisting of a physical description of the targeted RNA population or the hybridization reagent used. These targets are then mapped at regular intervals to the growing and evolving catalogues of genes from model organisms, such as human and mouse. The completely automatic mapping procedure relies partly on external genome information resources such as UniGene and RefSeq. The central part of CleanEx is a weekly built gene index containing crossreferences to all public expression data already incorporated into the system. In addition, the expression target database of CleanEx provides gene mapping and quality control information for various types of experimental resources, such as cDNA clones or Affymetrix probe sets. The Affymetrix mapping files are accessible as text files, for further use in external applications, and as individual entries, via the webbased interfaces . The CleanEx webbased query interfaces offer access to individual entries via text string searches or quantitative expression criteria, as well as crossdataset analysis tools, and crosschip gene comparison. These tools have proven to be very efficient in expression data comparison and even, to a certain extent, in detection of differentially expressed splice variants. The CleanEx flat files and tools are available online at: http://www.cleanex.isbsib. ch/.