A biomimetic model membrane system on oxidic surfaces designed for the investigation of cytochrome c oxidase and other membrane proteins by fluorescence and waveguide spectroscopy

Die transmembrane Potenzialdifferenz Δφm ist direkt mit der katalytischen Aktivität der Cytochrom c Oxidase (CcO) verknüpft. Die CcO ist das terminale Enzym (Komplex IV) in der Atmungskette der Mitochondrien. Das Enzym katalysiert die Reduktion von O2 zu 2 H2O. Dabei werden Elektronen vom natürlichen Substrat Cytochrom c zur CcO übertragen. Der Eleltronentransfer innerhalb der CcO ist an die Protonentranslokation über die Membran gekoppelt. Folglich bildet sich über der inneren Membrane der Mitochondrien eine Differenz in der Protonenkonzentration. Zusätzlich wird eine Potenzialdifferenz Δφm generiert.rnrnDas Transmembranpotenzial Δφm kann mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie unter Einsatz eines potenzialemfindlichen Farbstoffs gemessen werden. Um quantitative Aussagen aus solchen Untersuchungen ableiten zu können, müssen zuvor Kalibrierungsmessungen am Membransystem durchgeführt werden.rnrnIn dieser Arbeit werden Kalibrierungsmessungen von Δφm in einer Modellmembrane mit inkorporiertem CcO vorgestellt. Dazu wurde ein biomimetisches Membransystem, die Proteinverankerte Doppelschicht (protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM), auf einem transparenten, leitfähigem Substrat (Indiumzinnoxid, ITO) entwickelt. ITO ermöglicht den simultanen Einsatz von elektrochemischen und Fluoreszenz- oder optischen wellenleiterspektroskopischen Methoden. Das Δφm in der ptBLM wurde durch extern angelegte, definierte elektrische Spannungen induziert. rnrnEine dünne Hydrogelschicht wurde als "soft cushion" für die ptBLM auf ITO eingesetzt. Das Polymernetzwerk enthält die NTA Funktionsgruppen zur orientierten Immobilisierung der CcO auf der Oberfläche der Hydrogels mit Hilfe der Ni-NTA Technik. Die ptBLM wurde nach der Immobilisierung der CcO mittels in-situ Dialyse gebildet. Elektrochemische Impedanzmessungen zeigten einen hohen elektrischen Widerstand (≈ 1 MΩ) der ptBLM. Optische Wellenleiterspektren (SPR / OWS) zeigten eine erhöhte Anisotropie des Systems nach der Bildung der Doppellipidschicht. Cyklovoltammetriemessungen von reduziertem Cytochrom c bestätigten die Aktivität der CcO in der Hydrogel-gestützten ptBLM. Das Membranpotenzial in der Hydrogel-gestützten ptBLM, induziert durch definierte elektrische Spannungen, wurde mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Referenzmessungen mit einer einfach verankerten Dopplellipidschicht (tBLM) lieferten einen Umrechnungsfaktor zwischen dem ratiometrischen Parameter Rn und dem Membranpotenzial (0,05 / 100 mV). Die Nachweisgrenze für das Membranpotenzial in einer Hydrogel-gestützten ptBLM lag bei ≈ 80 mV. Diese Daten dienen als gute Grundlage für künftige Untersuchungen des selbstgenerierten Δφm der CcO in einer ptBLM.

Time-resolved surface enhanced resonance Raman spectro-electrochemistry of heme proteins

The membrane protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is one of the most important functional bio-molecules. It appears in almost every eukaryotic cell and many bacteria. Although the different species differ in the number of subunits, the functional differences are merely marginal. CcO is the terminal link in the electron transfer pathway of the mitochondrial respiratory chain. Electrons transferred to the catalytic center of the enzyme conduce to the reduction of molecular oxygen to water. Oxygen reduction is coupled to the pumping of protons into the inter-membrane space and hence generates a difference in electrochemical potential of protons across the inner mitochondrial membrane. This potential difference drives the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy carrier within all biological cells. rnrnThe goal of the present work is to contribute to a better understanding of the functional mechanism of CcO by using time-resolved surface enhanced resonance Raman spectroscopy (TR-SERRS). Despite intensive research effort within the last decades, the functional mechanism of CcO is still subject to controversial discussions. It was the primary goal of this dissertation to initiate electron transfer to the redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB electrochemically and to observe the corresponding redox transitions in-situ with a focus on the two heme structures by using SERRS. A measuring cell was developed, which allowed combination of electrochemical excitation with Raman spectroscopy for the purpose of performing the accordant measurements. Cytochrome c was used as a benchmark system to test the new measuring cell and to prove the feasibility of appropriate Raman measurements. In contrast to CcO the heme protein cc contains only a single heme structure. Nevertheless, characteristic Raman bands of the hemes can be observed for both proteins.rnrnIn order to investigate CcO it was immobilized on top of a silver substrate and embedded into an artificial membrane. The catalytic activity of CcO and therefore the complete functional capability of the enzyme within the biomimetic membrane architecture was verified using cyclic voltammetry. Raman spectroscopy was performed using a special nano-structured silver surface, which was developed within the scope of the present work. This new substrate combined two fundamental properties. It facilitated the formation of a protein tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) and it allowed obtaining Raman spectra with sufficient high signal-to-noise ratios.rnSpectro-electrochemical investigations showed that at open circuit potential the enzyme exists in a mixed-valence state, with heme a and and heme a3 in the reduced and oxidized state, respectively. This was considered as an intermediate state between the non-activated and the fully activated state of CcO. Time-resolved SERRS measurements revealed that a hampered electron transfer to the redox center heme a3 characterizes this intermediate state.rn

Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)

Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) gehört zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell schädlicher Epoxide in deren unschädliche Diol-Form. Hauptsächlich setzt die sEH endogene, der Arachidonsäure verwandte Signalmoleküle, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher könnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entzündungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Domänen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivität befindet sich in der 35 kD großen C-terminalen Domäne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugehörige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Domäne bekannt. Im Gegensatz dazu ist über die 25 kD große N-terminale Domäne wenig bekannt. Die N-terminale Domäne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gezählt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Domäne lange ungeklärt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen können, dass die sEH in Säugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zusätzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivität im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abhängiger Phosphataseaktivität in der N-terminalen Domäne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Domäne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird für die Ausübung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzuklären, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und möglichen funktionellen Ähnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminosäuren (konservierte und teilweise konservierte Aminosäuren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Domäne als Kandidaten ausgewählt.rnVon den Phosphatase-Domäne bildenden Aminosäuren wurden acht ausgewählt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminosäuren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgewählten Aminosäuren durch mindestens zwei alternative Aminosäuren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminosäure ähnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die für eine mutante sEH Phosphatase Domäne kodieren, in dem lediglich eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Domäne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung bestätigt. Die so generierte N-terminale Domäne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinitätschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivität gegenüber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivität zeigten, wurden anschließend kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der „direct linear blot“ Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Großteil der Enzymaktivität (Vmax) gegenüber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivität ließ sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrität erklären, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminosäureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) führten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivität, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminosäureaustausche die für Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgeführt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivität, die aber dennoch für die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausmaß zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe veränderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11  Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren für die Phosphataseaktivität der sEH nötig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufklärung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminosäuren bei und unterstützen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abläuft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ähnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, für die Ausübung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gestützt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Domäne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschließenden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterstützt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminosäuren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgeklärt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn

Catalysts and processes for next-generation H2 production

The present study is focused on the development of new VIII group metal on CeO2 – ZrO2 (CZO) catalyst to be used in reforming reaction for syngas production. The catalyst are tested in the oxyreforming process, extensively studied by Barbera [44] in a new multistep process configuration, with intermediate H2 membrane separation, that can be carried out at lower temperature (750°C) with respect the reforming processes (900 – 1000°C). In spite of the milder temperatures, the oxy-reforming conditions (S/C = 0.7; O2/C = 0.21) remain critical regarding the deactivation problems mainly deriving from thermal sintering and carbon formation phenomena. The combination of the high thermal stability characterizing the ZrO2, with the CeO2 redox properties, allows the formation of stable mixed oxide system with high oxygen mobility. This feature can be exploited in order to contrast the carbon deposition on the active metal surface through the oxidation of the carbon by means of the mobile oxygen atoms available at the surface of the CZO support. Ce0.5Zr0.5O2 is the phase claimed to have the highest oxygen mobility but its formation is difficult through classical synthesis (co-precipitation), hence a water-in-oil microemulsion method is, widely studied and characterized. Two methods (IWI and bulk) for the insertion of the active metal (Rh, Ru, Ni) are followed and their effects, mainly related to the metal stability and dispersion on the support, are discussed, correlating the characterization with the catalytic activity. Different parameters (calcination and reduction temperatures) are tuned to obtain the best catalytic system both in terms of activity and stability. Interesting results are obtained with impregnated and bulk catalysts, the latter representing a new class of catalysts. The best catalysts are also tested in a low temperature (350 – 500°C) steam reforming process and preliminary tests with H2 membrane separation have been also carried out.

Funktionelle Charakterisierung der Metalloendopeptidasen Meprin alpha und Meprin beta unter besonderer Berücksichtigung pathologischer Umstände in der menschlichen Dermis

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neuentdeckte Astacin-ähnliche-Proteasen LAST undrnLAST_MAM aus dem Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus funktionell charakterisiert.rnInsbesondere LAST_MAM, eignet sich zur phylogenetischen Untersuchung, hinsichtlich derrnEvolution von Astacin-ähnlichen-Proteasen mit MAM-Domäne, zu denen auch die Meprinernzählen. Es wurde deutlich, dass LAST_MAM nicht unmittelbar mit anderen Astacinen, diernüber eine MAM-Domäne verfügen, verwandt ist, und dass von einer divergenten Entwicklungrndieser Proteasen und der MAM-Domäne selbst ausgegangen werden muss.rnMeprin Metalloendopeptidasen werden in membrangebundener und sezernierter Form,rnvorwiegend in Epithelien aber auch in intestinalen Leukozyten und bestimmten Krebszellenrnexprimiert. Meprin

Physiologische Veränderungen bei der Thylakoidmembranbiogenese und die Funktionsweise des Nukleotidaustauschfaktors GrpE in Cyanobakterien

Bei Wachstum im Dunkeln zeigten sich rudimentäre Thylakoidstrukturen, wobei nach dem Transfer ins Licht ein vollständiges Thylakoidmembransystem erneut ausgebildet wurde. Parallel stieg, der Chlorophyllgehalt pro Zelle und das Verhältnis von Phycobilisomen zu Chlorophyll verschob sich erneut auf die Seite des Chlorophylls. Das bei Wachstum im Dunkeln als Monomer vorliegende PS II, war nicht funktional. Nach dem Transfer ins Licht, war nach etwa acht bis zwölf Stunden ein aktives PS II zu detektieren. Das PS I lag nach der Inkubation im Dunkeln, in geringerer Konzentration aber aktiv als Trimer in den Zellen vor.rnZwei Typ I Signalpeptidasen aus Synechocystis sp. PCC 6803 zeigten Unterschiede im Bezug auf ihre intrazelluläre Lokalisation. Für die Untersuchungen der Lokalisation konnte ein neues System der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt und erfolgreich eingesetzt werden. Das LepB1 zeigte einen (auto-) proteolytischen Abbau. Für Untersuchungen zur katalytischen Aktivität wurden Vorläuferproteine als Substrate für LepB2 identifiziert.rnDie Funktionsweise der GrpE-Proteine aus verwandten Cyanobakterien zeigt Unterschiede. Bei beiden GrpE-Proteinen erfolgt der reversible Übergang von einem Dimer hin zu einem Monomer innerhalb eines physiologisch relevanten Temperaturbereichs in einem Schritt. Bei dem Protein aus Synechocystis sp. ist der N-Terminus und bei dem Protein aus dem thermophilen Bakterium Thermosynechococcus der C-Terminus für die Dimerisierung essentiell. rn

From carbazole-containing and pi-expanded triangular trinuclear porphyrinoids

Zusammenfassung:rnDie vorliegende Arbeit beschreibt das Design und die Synthese neuartiger Porphyrinoide anhand der Modifikation und der π-Systemausdehnung an der Peripherie des Porphyrin-Gerüsts. Die Darstellung künstlicher Porphyrine ist von Interesse, da neue physiko-chemischen Eigenschaften erhalten und untersucht werden können. Die in dieser Arbeit vorgestellten Porphyrinoide wurden mit Hilfe von modernen Synthesemethoden wie den metallkatalysierten Kreuzkupplungen und somit durch Aryl-Aryl Verknüpfungen aufgebaut.rnDer erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Modifikation des Porphyrin-Gerüsts. Porphyrine bestehen aus jeweils zwei Pyrrol- und Pyrrolenin-Einheiten, welche systematisch ausgetauscht wurden. Die Pyrrol-Einheiten wurden durch Carbazol ersetzt, das sich formal vom Pyrrol durch Anfügen von zwei Benzogruppen ableitet und deshalb besonders gut geeignet ist. Die Pyrrolenin-Einheiten wurden aus folgenden Gründen durch andere Heterozyklen wie Pyridin, Pyrrol oder Triazol ersetzt: rn* Nachbildung des stabilen Porphyrin trans-NH-Tautomers (Carbazol und Pyridin)rn* Nachbildung von (NH)4-Liganden wie Calix[4]pyrrol (Carbazol und Pyrrol)rn* Vereinigung von N-H und C-H Wasserstoffbrücken-Donor-Einheiten in einem Makrozyklus (Carbazol und Triazol)rnDie Synthese eines drei-Zentren Porphyrinoids mit ausgedehntem π-System wird im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit beschrieben. Dieses Thema basiert auf der aktuellen Entwicklung von nicht-Edelmetall basierten Katalysatoren für die Reduktion von Sauerstoff. Hier werden derzeit N4 makrozyklische Metallkomplexe, die mehrere katalytisch aktive Stellen aufweisen, untersucht. In diesem Zusammenhang, hat die Gruppe von Prof. Müllen einen neuartigen drei-Zentren-Komplex entwickelt. Ausgehend von diesen Erkenntnissen, dient diese Arbeit zur Verbesserung der katalytischen Aktivität des drei-Zentren-Komplex durch die Variation von verschieden Substituenten. Hierbei wurden zwei wesentliche Konzepte verfolgt:rn* Vernetzung durch die Bildung von Netzwerken oder durch Pyrolyse in der Mesophasern* Verbesserung des Katalysator-Trägermaterial-KontaktsrnNeben den Synthesen wurden die Eigenschaften und möglichen Anwendungen dieser neuartigen Materialen untersucht, wie z.B. als Liganden für Übergangsmetalle, als Anionenrezeptoren oder als Elektrokatalysatoren für die Reduktion von Sauerstoff. rn

Selective oxidation of 5-hydroxymethylfurfural using monometallic and bimetallic supported nanoparticles

This work deals with the oxidation of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) to 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA) using metal supported catalysts. Catalysts were prepared from the immobilisation of preformed monometallic (Au, Pd) and bimetallic (AuCu, AuPd) nanoparticles on commercial oxides (TiO2, CeO2). Au-TiO2 catalyst was found to be very active for HMF oxidation; however, this system deactivated very fast. For this reason, we prepared bimetallic gold-copper nanoparticles and an increase in the catalytic activity was observed together with an increase in catalyst stability. In order to optimise the interaction of the metal active phase with the support, Au and AuCu nanoparticles were supported onto CeO2. Au-CeO2 catalyst was found to be more active than the bimetallic one, leading to the conclusion that in this case the most important feature is the interaction between gold and the support. Catalyst pre-treatments (calcination and washing) were carried out to maximise the contact between the metal and the oxide and an increase in the FDCA production could be observed. The presence of ceria defective sites was crucial for FDCA formation. Mesoporous cerium oxide was synthesised with the hard template method and was used as support for Au nanoparticles to promote the catalytic activity. In order to study the role of active phase in HMF oxidation, PdAu nanoparticles were supported onto TiO2. Au and Pd monometallic catalysts were very active in the formation of HMFCA (5-hydroxymethyl-2-furan carboxylic acid), but Pd was not able to convert it, leading to a low FDCA yield. The calcination of PdAu catalysts led to Pd segregation on the particles surface, which changed the reaction pathway and included an important contribution of the Cannizzaro reaction. PVP protected PdAu nanoparticles, synthesised with different morphologies (core-shell and alloyed structure), confirmed the presence of a different reaction mechanism when the metal surface composition changes.

Morphology control in metallocene-catalyzed polyolefin synthesis

The main aim of the work presented in this dissertation was the morphology control in metallocene-catalyzed polyolefin synthesis. This was studied by selective immobilization techniques on a variety of supports such as porous polyurethane particles (Chapter 3), electrospun fibers (Chapter 4 and 5), inorganic-organic hybrid core-shell particles (Chapter 6) and hollow silica particles (Chapter 7). Another aspect of this dissertation was modulating a catalytic activity by controlling a size of boron-based cocatalysts (Chapter 8).

Synthese und Charakterisierung biologischer Hybridpolymere zur gentechnologischen Anwendung

KurzfassungrnrnZiel der vorliegenden Arbeit war es eine gezielte, hochspezifische Inhibierung der Proteinbiosynthese zu erreichen. Dies kann durch eine Blockierung des mRNA-Strangs durch komplementäre DNA/RNA-Stränge (ähnlich zur Antisense-Methode) oder durch die Hydrolyse des mRNA-Strangs mit Hilfe spezieller Enzyme (RNasen) realisiert werden. Da jedoch beide Methoden nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen führen, wäre deshalb eine Kombination aus beiden Methoden ideal, welche in einer spezifischen, gezielten und permanenten Ausschaltung der Proteinbiosynthese resultieren würde. Um dieses Ziel zu verwirklichen, ist es nötig, ein Molekül zu synthetisieren, welches in der Lage ist selektiv an einer spezifischen Position an den RNA-Strang zu hybridisieren und anschließend den RNA-Strang an dieser zu hydrolysieren. Der große Vorteil dieses Konzepts liegt darin, dass die DNA-Sequenz für die Hybridisierung an die entsprechende RNA maßgeschneidert hergestellt werden kann und somit jede RNA gezielt angesteuert werden kann, was letztendlich zu einer spezifischen Inhibierung der korrespondierenden Proteinbiosynthese führen soll.rnDurch die Verwendung und Optimierung der Nativen Chemischen Ligation (NCL) als Konjugationsmethode konnten zwei Biomakromoleküle in Form einer 46-basenlangen DNA (komplementär zum RNA-Strang) und einer 31-aminosäurelangen RNase kovalent verknüpft werden. Durch unterschiedliche chemische und molekularbiologische Analysemethoden, wie PAGE, GPC, CE, MALDI-ToF-MS etc., war es zudem möglich, die erfolgreiche Synthese dieses biologischen Hybridpolymers als monodisperses, reines Produkt zu bestätigen. rnDie Synthese des ca. 800-basenlangen RNA-Strangs, der als Modell-Matrize für die selektive und spezifische Degradierung durch das DNA-RNase-Konjugat dienen sollte, konnte unter Zuhilfenahme gentechnologischer Standard-Methoden erfolgreich bewerkstelligt werden. Weiterhin konnte durch die Verwendung der radioaktiven cDNA-Synthese gezeigt werden, dass das DNA-RNase-Konjugat an die gewünschte Stelle des RNA-Strangs hybridisiert. Die Identifizierung einer anschließenden spezifischen Hydrolyse des RNA-Strangs durch die an den DNA-Strang angeknüpfte RNase war aufgrund der geringen katalytischen Aktivität des Enzyms bisher allerdings nicht möglich.rn

Chemical exfoliation of graphene and its application in organic electronics and energy storage devices

Graphene, the thinnest two-dimensional material possible, is considered as a realistic candidate for the numerous applications in electronic, energy storage and conversion devices due to its unique properties, such as high optical transmittance, high conductivity, excellent chemical and thermal stability. However, the electronic and chemical properties of graphene are highly dependent on their preparation methods. Therefore, the development of novel chemical exfoliation process which aims at high yield synthesis of high quality graphene while maintaining good solution processability is of great concern. This thesis focuses on the solution production of high-quality graphene by wet-chemical exfoliation methods and addresses the applications of the chemically exfoliated graphene in organic electronics and energy storage devices.rnPlatinum is the most commonly used catalysts for fuel cells but they suffered from sluggish electron transfer kinetics. On the other hand, heteroatom doped graphene is known to enhance not only electrical conductivity but also long term operation stability. In this regard, a simple synthetic method is developed for the nitrogen doped graphene (NG) preparation. Moreover, iron (Fe) can be incorporated into the synthetic process. As-prepared NG with and without Fe shows excellent catalytic activity and stability compared to that of Pt based catalysts.rnHigh electrical conductivity is one of the most important requirements for the application of graphene in electronic devices. Therefore, for the fabrication of electrically conductive graphene films, a novel methane plasma assisted reduction of GO is developed. The high electrical conductivity of plasma reduced GO films revealed an excellent electrochemical performance in terms of high power and energy densities when used as an electrode in the micro-supercapacitors.rnAlthough, GO can be prepared in bulk scale, large amount of defect density and low electrical conductivity are major drawbacks. To overcome the intrinsic limitation of poor quality of GO and/or reduced GO, a novel protocol is extablished for mass production of high-quality graphene by means of electrochemical exfoliation of graphite. The prepared graphene shows high electrical conductivity, low defect density and good solution processability. Furthermore, when used as electrodes in organic field-effect transistors and/or in supercapacitors, the electrochemically exfoliated graphene shows excellent device performances. The low cost and environment friendly production of such high-quality graphene is of great importance for future generation electronics and energy storage devices. rn

Reforming dell'etanolo con processo ciclico: studio della reattività di ossidi misti con struttura spinello

This work deals with a study on the feasibility of a new process, aimed at the production of hydrogen from water and ethanol (a compound obtained starting from biomasses), with inherent separation of hydrogen from C-containing products. The strategy of the process includes a first step, during which a metal oxide is contacted with ethanol at high temperature; during this step, the metal oxide is reduced and the corresponding metallic form develops. During the second step, the reduced metal compound is contacted at high temperature with water, to produce molecular hydrogen and with formation of the original metal oxide. In overall, the combination of the two steps within the cycle process corresponds to ethanol reforming, where however COx and H2 are produced separately. Various mixed metal oxides were used as electrons and ionic oxygen carriers, all of them being characterized by the spinel structure typical of M-modified non-stoichiometric ferrites: M0,6Fe2,4O4 (M = Co, Mn or Co/Mn). The first step was investigated in depth; it was found that besides the generation of the expected CO, CO2 and H2O, the products of ethanol anaerobic oxidation, also a large amount of H2 and coke were produced. The latter is highly undesired, since it affects the second step, during which water is fed over the pre-reduced spinel at high temperature. The behavior of the different spinels was affected by the nature of the divalent metal cation. The new materials were tested in terms of both redox proprieties and catalytic activity to generate hydrogen. Still the problem of coke formation remains the greater challenge to solve.

Studio dell'interazione di etanolo con catalizzatori TiO2-CeOx.

Due to the limited availability of natural oil and the harmful effects of its usage, the industry has focused in searching for sustainable types of raw materials for the production of chemicals. The bioethanol, obtained by fermentation of biomass, has gained particular importance in recent years both as a biofuel, and as a “building block” molecule because it can be considered as a starting reagent to obtain other added value chemical compounds, such as ethylene, acetaldehyde, butadiene and ethyl acetate. The goal of this research was the study of the interaction of ethanol with catalysts based on TiO2-CeOX. Since the electronic properties have implications on the catalytic activity, the idea was to understand if the TiO2-CeOX systems have different reactivity from that of ceria and rutile alone, or an intermediate between them. The study was focused on the characterization of the adsorbed species on the catalysts surface after ethanol adsorption through an in-situ spectroscopic technique (DRIFTS) that allowed us to extract information that could be helpful for the understanding of the processes at the molecular level. The mass spectrometry was used to monitor on-line the desorbed products. Furthermore, reactivity tests in a flow reactor were performed, in order to verify the catalytic behavior of the samples in conditions which are more similar to those applied at an industrial scale. The samples showed to behave in different way depending on the conditions used and the thermal treatment. The particular behavior of the mixed samples with respect to the single oxides is interpreted for each case according to the spectroscopic information collected.

Studio dell'attività idrolitica di glucomannano ad opera di alcuni preparati enzimatici industriali

Over the last few decades, polysaccharides have gained increasing attention in the biomedical and drug delivery fields. Among them, glucomannan (GM) has become a particularly interesting polymer in the nutraceutical, pharmaceutical and cosmeceutical field, however the high molecular weight of this natural polymer is the cause of the limits to its application that reflected in a poor solubility in water.Reduce the molecular weight could improve its use and at the same time does not eliminate its properties. In this study, we investigated the ability of enzymes to hydrolyze the polysaccharide structure of glucomannan by two commercial enzymes: Fungamyl Super AX and Celluclast BG. The purpose of the thesis was to identify the enzymatic activity and the process parameters ( pH and temperature) that influence the catalytic activity of the enzymes, the molecular size and the viscosity of products released after enzymatic hydrolysis of glucomannan.

The transforming parasite Theileria co-opts host cell mitotic and central spindles to persist in continuously dividing cells

The protozoan parasite Theileria inhabits the host cell cytoplasm and possesses the unique capacity to transform the cells it infects, inducing continuous proliferation and protection against apoptosis. The transforming schizont is a multinucleated syncytium that resides free in the host cell cytoplasm and is strictly intracellular. To maintain transformation, it is crucial that this syncytium is divided over the two daughter cells at each host cell cytokinesis. This process was dissected using different cell cycle synchronization methods in combination with the targeted application of specific inhibitors. We found that Theileria schizonts associate with newly formed host cell microtubules that emanate from the spindle poles, positioning the parasite at the equatorial region of the mitotic cell where host cell chromosomes assemble during metaphase. During anaphase, the schizont interacts closely with host cell central spindle. As part of this process, the schizont recruits a host cell mitotic kinase, Polo-like kinase 1, and we established that parasite association with host cell central spindles requires Polo-like kinase 1 catalytic activity. Blocking the interaction between the schizont and astral as well as central spindle microtubules prevented parasite segregation between the daughter cells during cytokinesis. Our findings provide a striking example of how an intracellular eukaryotic pathogen that evolved ways to induce the uncontrolled proliferation of the cells it infects usurps the host cell mitotic machinery, including Polo-like kinase 1, one of the pivotal mitotic kinases, to ensure its own persistence and survival.