Il foglio elettronico: strumenti, funzioni ed applicazioni

Utilizzare i lucidi come supporto alle lezioni e gli esempli appicativi come sussidi ed esempi da comprendere ed imitare

Study of the antioxidant fraction in edible olive oils obtained from different technological systems and parameters

Questo lavoro di tesi è stato suddiviso in tre parti. L’argomento principale è stato lo “Studio della componente antiossidante di oli ottenuti da olive mediante l’utilizzo di diversi sistemi e parametri tecnologici”. E’ ben noto come la qualità ossidativa di un olio di oliva dipenda oltre che dalla sua composizione in acidi grassi, dalla presenza di composti caratterizzati da un elevata attività antiossidante, ovvero le sostanze fenoliche. I composti fenolici contribuiscono quindi in maniera preponderante alla shelf life dell’olio extravergine di oliva. Inoltre sono state riscontrate delle forti correlazione tra alcune di queste sostanze e gli attributi sensoriali positivi di amaro e piccante. E’ poi da sottolineare come il potere antiossidante dei composti fenolici degli oli vergini di oliva, sia stato negli ultimi anni oggetto di considerevole interesse, poiché correlato alla protezione da alcune patologie come ad esempio quelle vascolari, degenerative e tumorali. Il contenuto delle sostanze fenoliche negli oli di oliva dipende da diversi fattori: cultivar, metodo di coltivazione, grado di maturazione delle olive e ovviamente dalle operazioni tecnologiche poiché possono variare il quantitativo di questi composti estratto. Alla luce di quanto appena detto abbiamo valutato l’influenza dei fattori agronomici (metodi di agricoltura biologica, integrata e convenzionale) e tecnologici (riduzione della temperatura della materia prima, aggiunta di coadiuvanti in fase di frangitura e di gramolatura, confronto tra tre oli extravergini di oliva ottenuti mediante diversi sistemi tecnologici) sul contenuto in composti fenolici di oli edibili ottenuti da olive (paper 1-3-4). Oltre alle sostanze fenoliche, negli oli di oliva sono presenti altri composti caratterizzati da proprietà chimiche e nutrizionali, tra questi vi sono i fitosteroli, ovvero gli steroli tipici del mondo vegetale, che rappresentano la frazione dell’insaponificabile quantitativamente più importante dopo gli idrocarburi. La composizione quali-quantitativa degli steroli di un olio di oliva è una delle caratteristiche analitiche più importanti nella valutazione della sua genuinità; infatti la frazione sterolica è significativamente diversa in funzione dell’origine botanica e perciò viene utilizzata per distinguere tra di loro gli oli e le loro miscele. Il principale sterolo nell’olio di oliva è il β- sitosterolo, la presenza di questo composto in quantità inferiore al 90% è un indice approssimativo dell’aggiunta di un qualsiasi altro olio. Il β-sitosterolo è una sostanza importante dal punto di vista della salute, poiché si oppone all’assorbimento del colesterolo. Mentre in letteratura si trovano numerosi lavori relativi al potere antiossidante di una serie di composti presenti nell’olio vergine di oliva (i già citati polifenoli, ma anche carotenoidi e tocoferoli) e ricerche che dimostrano invece come altri composti possano promuovere l’ossidazione dei lipidi, per quanto riguarda il potere antiossidante degli steroli e dei 4- metilsteroli, vi sono ancora poche informazioni. Per questo è stata da noi valutata la composizione sterolica in oli extravergini di oliva ottenuti con diverse tecnologie di estrazione e l’influenza di questa sostanza sulla loro stabilità ossidativa (paper 2). E’ stato recentemente riportato in letteratura come lipidi cellulari evidenziati attraverso la spettroscopia di risonanza nucleare magnetica (NMR) rivestano una importanza strategica da un punto di vista funzionale e metabolico. Questi lipidi, da un lato un lato sono stati associati allo sviluppo di cellule neoplastiche maligne e alla morte cellulare, dall’altro sono risultati anche messaggeri di processi benigni quali l’attivazione e la proliferazione di un normale processo di crescita cellulare. Nell’ambito di questa ricerca è nata una collaborazione tra il Dipartimento di Biochimica “G. Moruzzi” ed il Dipartimento di Scienze degli Alimenti dell’Università di Bologna. Infatti, il gruppo di lipochimica del Dipartimento di Scienze degli Alimenti, a cui fa capo il Prof. Giovanni Lercker, da sempre si occupa dello studio delle frazioni lipidiche, mediante le principali tecniche cromatografiche. L’obiettivo di questa collaborazione è stato quello di caratterizzare la componente lipidica totale estratta dai tessuti renali umani sani e neoplastici, mediante l’utilizzo combinato di diverse tecniche analitiche: la risonanza magnetica nucleare (1H e 13C RMN), la cromatografia su strato sottile (TLC), la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e la gas cromatografia (GC) (paper 5-6-7)

Materiali Compositi a Matrice Cementizia per i Rinforzi Strutturali

L’utilizzo degli FRP (Fiber Reinforced Polymer) nel campo dell’ingegneria civile riguarda essenzialmente il settore del restauro delle strutture degradate o danneggiate e quello dell’adeguamento statico delle strutture edificate in zona sismica; in questi settori è evidente la difficoltà operativa alla quale si va in contro se si volessero utilizzare tecniche di intervento che sfruttano materiali tradizionali. I motivi per cui è opportuno intervenire con sistemi compositi fibrosi sono: • l’estrema leggerezza del rinforzo, da cui ne deriva un incremento pressoché nullo delle masse sismiche ed allo stesso tempo un considerevole aumento della duttilità strutturale; • messa in opera senza l’ausilio di particolari attrezzature da un numero limitato di operatori, da cui un minore costo della mano d’opera; • posizionamento in tempi brevi e spesso senza interrompere l’esercizio della struttura. Il parametro principale che definisce le caratteristiche di un rinforzo fibroso non è la resistenza a trazione, che risulta essere ben al di sopra dei tassi di lavoro cui sono soggette le fibre, bensì il modulo elastico, di fatti, più tale valore è elevato maggiore sarà il contributo irrigidente che il rinforzo potrà fornire all’elemento strutturale sul quale è applicato. Generalmente per il rinforzo di strutture in c.a. si preferiscono fibre sia con resistenza a trazione medio-alta (>2000 MPa) che con modulo elastico medio-alto (E=170-250 GPa), mentre per il recupero degli edifici in muratura o con struttura in legno si scelgono fibre con modulo di elasticità più basso (E≤80 GPa) tipo quelle aramidiche che meglio si accordano con la rigidezza propria del supporto rinforzato. In questo contesto, ormai ampliamente ben disposto nei confronti dei compositi, si affacciano ora nuove generazioni di rinforzi. A gli ormai “classici” FRP, realizzati con fibre di carbonio o fibre di vetro accoppiate a matrici organiche (resine epossidiche), si affiancano gli FRCM (Fiber Reinforced Cementitious Matrix), i TRM (Textile Reinforced Mortars) e gli SRG (Steel Reinforced Grout) che sfruttano sia le eccezionali proprietà di fibre di nuova concezione come quelle in PBO (Poliparafenilenbenzobisoxazolo), sia un materiale come l’acciaio, che, per quanto comune nel campo dell’edilizia, viene caratterizzato da lavorazioni innovative che ne migliorano le prestazioni meccaniche. Tutte queste nuove tipologie di compositi, nonostante siano state annoverate con nomenclature così differenti, sono però accomunate dell’elemento che ne permette il funzionamento e l’adesione al supporto: la matrice cementizia

Strumenti per la valutazione dello stato conservativo e per la manutenzione programmata dei ponti della Provincia di Bologna

La tesi tratta di strumenti finalizzati alla valutazione dello stato conservativo e di supporto all'attività di manutenzione dei ponti, dai più generali Bridge Management Systems ai Sistemi di Valutazione Numerica della Condizione strutturale. Viene proposto uno strumento originale con cui classificare i ponti attraverso un Indice di Valutazione Complessiva e grazie ad esso stabilire le priorità d'intervento. Si tara lo strumento sul caso pratico di alcuni ponti della Provincia di Bologna. Su un ponte in particolare viene realizzato un approfondimento specifico sulla determinazione approssimata dei periodi propri delle strutture da ponte. Si effettua un confronto dei risultati di alcune modellazioni semplificate in riferimento a modellazioni dettagliate e risultati sperimentali.

Tecniche di risparmio idrico a livello locale e mondiale. Approfondimento sulle buone pratiche agricole per un uso sostenibile dell'acqua

Oltre un miliardo di persone non ha oggi accesso all’acqua potabile; più di due miliardi è il numero di coloro che vivono in condizioni igienico-sanitarie realmente proibitive. Sono 80 i paesi nel mondo (con il 40% della popolazione totale) in cui si riscontra difficoltà di approvvigionamento e presenza di risorse idriche che mancano dei requisiti che dovrebbero essere assicurati per la tutela della salute: quotidianamente e sistematicamente il diritto di accesso all’acqua, che nessun individuo dovrebbe vedersi negato, viene violato. Scarsità di acqua e non omogenea distribuzione sulla superficie terrestre sono fattori che concorrono alla crisi della risorsa, cui contribuiscono processsi di natura ambientale (cambiamenti climatici, desertificazione), di natura economica (le sorti dell’industria agroalimentare, la globalizzazione degli scambi, il bisogno crescente di energia), di natura sociale (migrazioni, urbanizzazione, crescita demografica, epidemie), di natura culturale (passaggio dal rurale all’urbano, dall’agricoltura di sussistenza a quella di profitto). Nell’ottica di uno sviluppo sostenibile un aumento indiscriminato dell’offerta non può costituire soluzione al continuo incremento della domanda di acqua. Si rende pertanto necessaria la definizione di politiche e strumenti di cambiamento nei modelli di consumo e nella pianificazione che consentano una riduzione degli squilibri nella distribuzione e nella gestione della risorsa a livello domestico e civile, industriale, agricolo. L’uso efficiente, e quindi sostenibile, dell’acqua è da perseguirsi secondo le modalità: • Risparmio, inteso come minore consumo di acqua all’inizio del ciclo. • Riciclo dell’acqua in circuito chiuso, inteso come riuso dell’acqua di scarico, o uso multiplo dell’acqua. Una idonea utilizzazione dipende da una idonea progettazione, che abbia come finalità: • La destinazione in via prioritaria delle fonti e delle risorse di più elevata qualità agli usi idropotabili, con una graduale sostituzione del consumo per altri usi con risorse di minore pregio. • La regolamentazione dell’uso delle acque sotterranee, mediante la limitazione del ricorso all’impiego di pozzi solo in mancanza di forniture alternative per uso civile, industriale, agricolo. • L’incentivazione ad un uso razionale della risorsa, anche mediante l’attuazione di idonee politiche tariffarie. • L’aumento dell’efficienza delle reti di adduzione e distribuzione, sia civili che irrigue. • La promozione di uso efficiente, riciclo e recupero di acqua nell’industria. • Il miglioramento dell’efficienza ed efficacia delle tecniche di irrigazione. • La promozione del riutilizzo delle acque nei vari settori. • La diffusione nella pratica domestica di apparati e tecnologie progettati per la riduzione degli sprechi e dei consumi di acqua. In ambito agricolo la necessità di un uso parsimonioso della risorsa impone il miglioramento dell’efficienza irrigua, pari appena al 40%. La regione Emilia Romagna a livello locale, Israele a livello internazionale, forniscono ottimi esempi in termini di efficacia dei sistemi di trasporto e di distribuzione, di buona manutenzione delle strutture. Possibili soluzioni verso le quali orientare la ricerca a livello mondiale per arginare la progressiva riduzione delle riserve idriche sono: • Revisione dei costi idrici. • Recupero delle riserve idriche. • Raccolta dell’acqua piovana. • Miglioramento degli impianti di distribuzione idrica. • Scelta di metodi di coltivazione idonei alle caratteristiche locali. • Scelta di colture a basso fabbisogno idrico. • Conservazione della risorsa attraverso un sistema di irrigazione efficiente. • Opere di desalinizzazione. • Trasferimento idrico su vasta scala da un’area all’altra. Si tratta di tecniche la cui attuazione può incrementare la disponibilità media pro capite di acqua, in particolare di coloro i quali non ne posseggono in quantità sufficiente per bere o sono privi di sistemi igienico-sanitari sufficienti.

Utilizzo metrico di immagini panoramiche satellitari CORONA

CAPITOLO 1 INTRODUZIONE Il lavoro presentato è relativo all’utilizzo a fini metrici di immagini satellitari storiche a geometria panoramica; in particolare sono state elaborate immagini satellitari acquisite dalla piattaforma statunitense CORONA, progettata ed impiegata essenzialmente a scopi militari tra gli anni ’60 e ’70 del secolo scorso, e recentemente soggette ad una declassificazione che ne ha consentito l’accesso anche a scopi ed utenti non militari. Il tema del recupero di immagini aeree e satellitari del passato è di grande interesse per un ampio spettro di applicazioni sul territorio, dall’analisi dello sviluppo urbano o in ambito regionale fino ad indagini specifiche locali relative a siti di interesse archeologico, industriale, ambientale. Esiste infatti un grandissimo patrimonio informativo che potrebbe colmare le lacune della documentazione cartografica, di per sé, per ovvi motivi tecnici ed economici, limitata a rappresentare l’evoluzione territoriale in modo asincrono e sporadico, e con “forzature” e limitazioni nel contenuto informativo legate agli scopi ed alle modalità di rappresentazione delle carte nel corso del tempo e per diversi tipi di applicazioni. L’immagine di tipo fotografico offre una rappresentazione completa, ancorché non soggettiva, dell’esistente e può complementare molto efficacemente il dato cartografico o farne le veci laddove questo non esista. La maggior parte del patrimonio di immagini storiche è certamente legata a voli fotogrammetrici che, a partire dai primi decenni del ‘900, hanno interessato vaste aree dei paesi più avanzati, o regioni di interesse a fini bellici. Accanto a queste, ed ovviamente su periodi più vicini a noi, si collocano le immagini acquisite da piattaforma satellitare, tra le quali rivestono un grande interesse quelle realizzate a scopo di spionaggio militare, essendo ad alta risoluzione geometrica e di ottimo dettaglio. Purtroppo, questo ricco patrimonio è ancora oggi in gran parte inaccessibile, anche se recentemente sono state avviate iniziative per permetterne l’accesso a fini civili, in considerazione anche dell’obsolescenza del dato e della disponibilità di altre e migliori fonti di informazione che il moderno telerilevamento ci propone. L’impiego di immagini storiche, siano esse aeree o satellitari, è nella gran parte dei casi di carattere qualitativo, inteso ad investigare sulla presenza o assenza di oggetti o fenomeni, e di rado assume un carattere metrico ed oggettivo, che richiederebbe tra l’altro la conoscenza di dati tecnici (per esempio il certificato di calibrazione nel caso delle camere aerofotogrammetriche) che sono andati perduti o sono inaccessibili. Va ricordato anche che i mezzi di presa dell’epoca erano spesso soggetti a fenomeni di distorsione ottica o altro tipo di degrado delle immagini che ne rendevano difficile un uso metrico. D’altra parte, un utilizzo metrico di queste immagini consentirebbe di conferire all’analisi del territorio e delle modifiche in esso intercorse anche un significato oggettivo che sarebbe essenziale per diversi scopi: per esempio, per potere effettuare misure su oggetti non più esistenti o per potere confrontare con precisione o co-registrare le immagini storiche con quelle attuali opportunamente georeferenziate. Il caso delle immagini Corona è molto interessante, per una serie di specificità che esse presentano: in primo luogo esse associano ad una alta risoluzione (dimensione del pixel a terra fino a 1.80 metri) una ampia copertura a terra (i fotogrammi di alcune missioni coprono strisce lunghe fino a 250 chilometri). Queste due caratteristiche “derivano” dal principio adottato in fase di acquisizione delle immagini stesse, vale a dire la geometria panoramica scelta appunto perché l’unica che consente di associare le due caratteristiche predette e quindi molto indicata ai fini spionaggio. Inoltre, data la numerosità e la frequenza delle missioni all’interno dell’omonimo programma, le serie storiche di questi fotogrammi permettono una ricostruzione “ricca” e “minuziosa” degli assetti territoriali pregressi, data appunto la maggior quantità di informazioni e l’imparzialità associabili ai prodotti fotografici. Va precisato sin dall’inizio come queste immagini, seppur rappresentino una risorsa “storica” notevole (sono datate fra il 1959 ed il 1972 e coprono regioni moto ampie e di grandissimo interesse per analisi territoriali), siano state molto raramente impiegate a scopi metrici. Ciò è probabilmente imputabile al fatto che il loro trattamento a fini metrici non è affatto semplice per tutta una serie di motivi che saranno evidenziati nei capitoli successivi. La sperimentazione condotta nell’ambito della tesi ha avuto due obiettivi primari, uno generale ed uno più particolare: da un lato il tentativo di valutare in senso lato le potenzialità dell’enorme patrimonio rappresentato da tali immagini (reperibili ad un costo basso in confronto a prodotti simili) e dall’altro l’opportunità di indagare la situazione territoriale locale per una zona della Turchia sud orientale (intorno al sito archeologico di Tilmen Höyük) sulla quale è attivo un progetto condotto dall’Università di Bologna (responsabile scientifico il Prof. Nicolò Marchetti del Dipartimento di Archeologia), a cui il DISTART collabora attivamente dal 2005. L’attività è condotta in collaborazione con l’Università di Istanbul ed il Museo Archeologico di Gaziantep. Questo lavoro si inserisce, inoltre, in un’ottica più ampia di quelle esposta, dello studio cioè a carattere regionale della zona in cui si trovano gli scavi archeologici di Tilmen Höyük; la disponibilità di immagini multitemporali su un ampio intervallo temporale, nonché di tipo multi sensore, con dati multispettrali, doterebbe questo studio di strumenti di conoscenza di altissimo interesse per la caratterizzazione dei cambiamenti intercorsi. Per quanto riguarda l’aspetto più generale, mettere a punto una procedura per il trattamento metrico delle immagini CORONA può rivelarsi utile all’intera comunità che ruota attorno al “mondo” dei GIS e del telerilevamento; come prima ricordato tali immagini (che coprono una superficie di quasi due milioni di chilometri quadrati) rappresentano un patrimonio storico fotografico immenso che potrebbe (e dovrebbe) essere utilizzato sia a scopi archeologici, sia come supporto per lo studio, in ambiente GIS, delle dinamiche territoriali di sviluppo di quelle zone in cui sono scarse o addirittura assenti immagini satellitari dati cartografici pregressi. Il lavoro è stato suddiviso in 6 capitoli, di cui il presente costituisce il primo. Il secondo capitolo è stato dedicato alla descrizione sommaria del progetto spaziale CORONA (progetto statunitense condotto a scopo di fotoricognizione del territorio dell’ex Unione Sovietica e delle aree Mediorientali politicamente correlate ad essa); in questa fase vengono riportate notizie in merito alla nascita e all’evoluzione di tale programma, vengono descritti piuttosto dettagliatamente gli aspetti concernenti le ottiche impiegate e le modalità di acquisizione delle immagini, vengono riportati tutti i riferimenti (storici e non) utili a chi volesse approfondire la conoscenza di questo straordinario programma spaziale. Nel terzo capitolo viene presentata una breve discussione in merito alle immagini panoramiche in generale, vale a dire le modalità di acquisizione, gli aspetti geometrici e prospettici alla base del principio panoramico, i pregi ed i difetti di questo tipo di immagini. Vengono inoltre presentati i diversi metodi rintracciabili in bibliografia per la correzione delle immagini panoramiche e quelli impiegati dai diversi autori (pochi per la verità) che hanno scelto di conferire un significato metrico (quindi quantitativo e non solo qualitativo come è accaduto per lungo tempo) alle immagini CORONA. Il quarto capitolo rappresenta una breve descrizione del sito archeologico di Tilmen Höyuk; collocazione geografica, cronologia delle varie campagne di studio che l’hanno riguardato, monumenti e suppellettili rinvenute nell’area e che hanno reso possibili una ricostruzione virtuale dell’aspetto originario della città ed una più profonda comprensione della situazione delle capitali del Mediterraneo durante il periodo del Bronzo Medio. Il quinto capitolo è dedicato allo “scopo” principe del lavoro affrontato, vale a dire la generazione dell’ortofotomosaico relativo alla zona di cui sopra. Dopo un’introduzione teorica in merito alla produzione di questo tipo di prodotto (procedure e trasformazioni utilizzabili, metodi di interpolazione dei pixel, qualità del DEM utilizzato), vengono presentati e commentati i risultati ottenuti, cercando di evidenziare le correlazioni fra gli stessi e le problematiche di diversa natura incontrate nella redazione di questo lavoro di tesi. Nel sesto ed ultimo capitolo sono contenute le conclusioni in merito al lavoro in questa sede presentato. Nell’appendice A vengono riportate le tabelle dei punti di controllo utilizzati in fase di orientamento esterno dei fotogrammi.

Simulazione quali-quantitativa della rete fognaria della città di Modena e dimensionamento di invasi per la mitigazione dell'impatto degli scaricatori di piena

Nel presente lavoro di tesi ci si è occupati dello studio del comportamento idraulico-ambientale della rete di drenaggio a servizio della città di Modena. In particolare si è condotta una valutazione dell’effetto che gli scaricatori della rete fognaria in oggetto hanno sul complesso dei corpi idrici riceventi. Tale lavoro si prefigge anche lo scopo di individuare e dimensionare i più efficaci sistemi di controllo degli sversamenti, operati dagli scaricatori stessi, ed infine supportare analisi costi-benefici in vista della realizzazione delle opere di risanamento ambientale necessarie per ottemperare ai vincoli imposti dalla vigente normativa regionale in merito alla gestione delle acque di prima pioggia (Deliberazione G.R. Emilia Romagna 286/2005). Lo studio si è articolato in fasi successive: • analisi dello stato di fatto; • catalogazione degli scaricatori in esercizio nella rete di drenaggio; • determinazione ed analisi dei bacini idrografici e delle superfici scolanti; • implementazione di un modello numerico della rete di drenaggio; • individuazione e valutazione delle criticità idraulico-ambientali del sistema, mediante simulazioni in continuo delle serie pluviometriche degli anni 2005 e 2006. L’attività che ha portato al conseguimento dei risultati che sono raccolti in questa “nota” è stata svolta in collaborazione con la società HERA Modena s.r.l. a cui compete, fra le altre, la gestione dell’intera rete di drenaggio urbano del Comune di Modena. La fase di analisi dello stato di fatto e delle superfici scolanti afferenti ai singoli sottobacini è stata condotta utilizzando lo strumento GIS Arcview; il quale è di supporto, anche ai fini di un’appropriata definizione delle caratteristiche specifiche del territorio. Lo studio è stato sviluppato mediante la realizzazione di un modello numerico di simulazione quali-quantitativa con l’ausilio del software InfoWorks CS 8.05, distribuito dalla Wallingford Software Ltd UK.

Analisi sulla sicurezza stradale nel comune di Casalecchio di Reno: messa in sicurezza di un attraversamento pedonale

Il lavoro svolto consiste inizialmente in una presentazione generale della situazione attuale della viabilità sul territorio casalecchiese. Su di esso si affronteranno un buon numero di problematiche che rendono le strade, presenti sul territorio, a rischio di incidentalità. Inerente a questo si è analizzato i dati degli incidenti dell’ultimo anno avvenuti sul territorio attraverso il lavoro di raccolta dati effettuato dall’Osservatorio dell’incidentalità stradale della Provincia di Bologna. Dai dati ottenuti e dai rilevamenti effettuati nell’arco di questi quattro mesi passati nell’Ufficio Traffico del comune di Casalecchio di Reno, sulle strade comunali si è riscontrato una serie di situazione a rischio che ho presentato in un capitolo apposito e si è discusso anche le relative soluzioni di intervento. Tali situazioni comprendono sia strade leggermente attempate che necessitano di interventi di sistemazione, sia intersezioni a raso di vario tipo che presentano un ampio ventaglio di problematiche per la sicurezza stradale, sia attraversamenti pedonali non a norma, con situazioni al limite della sicurezza che necessitano di immediati interventi di sistemazione e messa in sicurezza. In particolare si è approfondito lo studio degli attraversamenti pedonali, presentando tutti i possibili scenari che questa particolare situazione può avere, elencando tutti i possibili interventi che si possono adottare al fine di ottimizzare la sicurezza e ridurre al minimo i rischi, ovvero ridurre il più possibile la probabilità che un incidente accada e il danno subito dal pedone. Infine si è studiato nello specifico una situazione di pericolo, fra quelle presentate, che probabilmente rappresenta una delle situazioni più a rischio presenti sul territorio casalecchiese: un attraversamento pedonale sulla via Porrettana, nei pressi del parco Rodari, situato all’incirca a mezzavia fra l’incrocio tra via Porrettana e via Calzavecchio, e la rotonda Biagi. Tale attraversamento pedonale, in alcuni orari della giornata assai utilizzato dai residenti del limitrofo quartiere Calzavecchio che raggiungono il parco Rodari e nel giorno di mercoledì mattina il mercato rionale situato accanto al parco, presenta flussi pedonali abbastanza corposi ed è situato su una strada caratterizzata da un elevato flusso veicolare. Dopo aver presentato in maniera approfondita la situazione attuale di tale attraversamento pedonale, si sono infine proposte due diverse soluzione di intervento: una da poter essere attuata nell’immediato, l’altra subito dopo che si ottenga la declassazione di via Porrettana, cioè all’incirca fra cinque o sei anni. Si è allegato, infine, come appendice, la Normativa che si è utilizzata al fine di progettare tali soluzioni.

Studi funzionali e strutturali sul wildtype e sul mutante γM23-K della ATP sintasi di Rhodobacter capsulatus: ruolo dell'ADP e della forza protonmotiva nell'attivazione dell’enzima e nell'accoppiamento dell'idrolisi di ATP alla traslocazione protonica

Nel presente lavoro di tesi sono state messe a confronto le ATP sintasi wild-type e γM23-K in cromatofori del batterio fotosintetico Rhodobacter capsulatus sotto gli aspetti funzionale e regolatorio. Si pensava inizialmente che la mutazione, in base a studi riportati in letteratura condotti sull’omologa mutazione in E. coli, avrebbe indotto disaccoppiamento intrinseco nell’enzima. Il presente lavoro ha chiarito che il principale effetto della mutazione è un significativo aumento dell’affinità dell’enzima per l’ADP inibitorio, che ne determina il ridotto livello di ATP idrolisi e la rapidissima reinattivazione in seguito ad attivazione da forza protonmotiva. Il residuo 23 della subunità γ si trova posizionato in prossimità della regione conservata DEELSED carica negativamente della subunità β, e l’introduzione nel mutante di una ulteriore carica positiva potrebbe determinare una maggiore richiesta di energia per indurre l’apertura del sito catalitico. Un’analisi quantitativa dei dati di proton pumping condotta mediante inibizione parziale dell’idrolisi del wildtype ha inoltre mostrato come il grado di accoppiamento del mutante in condizioni standard non differisca sostanzialmente da quello del wild-type. D’altro canto, è stato recentemente osservato come un disaccoppiamento intrinseco possa venire osservato in condizioni opportune anche nel wild-type, e cioè a basse concentrazioni di ADP e Pi. Nel presente lavoro di tesi si è dimostrato come nel mutante l’osservazione del fenomeno del disaccoppiamento intrinseco sia facilitata rispetto al wild-type. È stato proprio nell’ambito delle misure condotte sul mutante che è stato possibile dimostrare per la prima volta il ruolo fondamentale della componente elettrica della forza protonmotiva nel mantenere lo stato enzimatico ad elevato accoppiamento. Tale ruolo è stato successivamente messo in luce anche nel wild-type, in parte anche grazie all’uso di inibitori specifici di F1 e di FO. Il disaccoppiamento intrinseco nel wild-type è stato ulteriormente esaminato anche nella sua dipendenza dalla rimozione di ADP e Pi; in particolare, oltre all’amina fluorescente ACMA, è stata utilizzata come sonda di ΔpH anche la 9-aminoacridina e come sonda di Δψ l’Oxonolo VI. In entrambi i casi il ruolo accoppiante di questi due ligandi è stato confermato, inoltre utilizzando la 9-aminoacridina è stato possibile calibrare il segnale di fluorescenza con salti acido-base, dando quindi una base quantitativa ai dati ottenuti. Noi riteniamo che il più probabile candidato strutturale coinvolto in questi cambiamenti di stato enzimatici sia la subunità ε, di cui è noto il coinvolgimento in processi di regolazione e in cambiamenti strutturali indotti da nucleotidi e dalla forza protonmotiva. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Fisica dell’Università di Friburgo è in atto un progetto per studiare i cambiamenti strutturali presumibilmente associati al disaccoppiamento intrinseco tramite FRET in singola molecola di complessi ATP-sintasici marcati con fluorofori sia sulla subunità ε che sulla subunità γ. Nell’ambito di questa tesi sono stati creati a questo fine alcuni doppi mutanti cisteinici ed è stato messo a punto un protocollo per la loro marcatura con sonde fluorescenti.

Interazioni tra le glicoproteine D, B, H ed L critiche per la fusione indotta dal virus Herpes simplex

Four glycoproteins (gD, gB, gH, and gL) are required for herpes simplex virus (HSV) entry into the cell and for cell-cell fusion in transfected cells. gD serves as the receptor-binding glycoprotein and as the trigger of fusion; the other three glycoproteins execute fusion between the viral envelope and the plasma or endocytic membranes. Little is known on the interaction of gD with gB, gH, and gL. Here, the interactions between herpes simplex virus gD and its nectin1 receptor or between gD, gB, and gH were analyzed by complementation of the N and C portions of split enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the glycoproteins. Split EGFP complementation was detected between proteins designated gDN + gHC, gDN + gBC, and gHN + gBC + wtgD, both in cells transfected with two or tree glycoproteins and in cells transfected with the four glycoproteins, commited to form syncytia. The in situ assay provides evidence that gD interacts with gH and gB independently one of the other. We further document the interaction between gH and gB. To elucidate which portions of the glycoproteins interact with each other we generated mutants of gD and gB. gD triggers fusion through a specialised domain, named pro-fusion domain (PFD), located C-terminally in the ectodomain. Here, we show that PFD is made of subdomains 1 and 2 (amino acids 260–285 and 285–310) and that each one partially contributed to herpes simplex virus infectivity. Chimeric gB molecules composed of HSV and human herpesvirus 8 (HHV8) sequences failed to reach the cell surface and to complement a gB defective virus. By means of pull down experiments we analyzed the interactions of HSV-HHV8 gB chimeras with gH or gD fused to the strep-tag. The gB sequence between aa residues 219-360 was identified as putative region of interaction with gH or critical to the interaction.

The photosynthetic bacterial reaction center in native and artificial envirnoments: effects on light-induced electron transfer

In this thesis we focussed on the characterization of the reaction center (RC) protein purified from the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. In particular, we discussed the effects of native and artificial environment on the light-induced electron transfer processes. The native environment consist of the inner antenna LH1 complex that copurifies with the RC forming the so called core complex, and the lipid phase tightly associated with it. In parallel, we analyzed the role of saccharidic glassy matrices on the interplay between electron transfer processes and internal protein dynamics. As a different artificial matrix, we incorporated the RC protein in a layer-by-layer structure with a twofold aim: to check the behaviour of the protein in such an unusual environment and to test the response of the system to herbicides. By examining the RC in its native environment, we found that the light-induced charge separated state P+QB - is markedly stabilized (by about 40 meV) in the core complex as compared to the RC-only system over a physiological pH range. We also verified that, as compared to the average composition of the membrane, the core complex copurifies with a tightly bound lipid complement of about 90 phospholipid molecules per RC, which is strongly enriched in cardiolipin. In parallel, a large ubiquinone pool was found in association with the core complex, giving rise to a quinone concentration about ten times larger than the average one in the membrane. Moreover, this quinone pool is fully functional, i.e. it is promptly available at the QB site during multiple turnover excitation of the RC. The latter two observations suggest important heterogeneities and anisotropies in the native membranes which can in principle account for the stabilization of the charge separated state in the core complex. The thermodynamic and kinetic parameters obtained in the RC-LH1 complex are very close to those measured in intact membranes, indicating that the electron transfer properties of the RC in vivo are essentially determined by its local environment. The studies performed by incorporating the RC into saccharidic matrices evidenced the relevance of solvent-protein interactions and dynamical coupling in determining the kinetics of electron transfer processes. The usual approach when studying the interplay between internal motions and protein function consists in freezing the degrees of freedom of the protein at cryogenic temperature. We proved that the “trehalose approach” offers distinct advantages with respect to this traditional methodology. We showed, in fact, that the RC conformational dynamics, coupled to specific electron transfer processes, can be modulated by varying the hydration level of the trehalose matrix at room temperature, thus allowing to disentangle solvent from temperature effects. The comparison between different saccharidic matrices has revealed that the structural and dynamical protein-matrix coupling depends strongly upon the sugar. The analyses performed in RCs embedded in polyelectrolyte multilayers (PEM) structures have shown that the electron transfer from QA - to QB, a conformationally gated process extremely sensitive to the RC environment, can be strongly modulated by the hydration level of the matrix, confirming analogous results obtained for this electron transfer reaction in sugar matrices. We found that PEM-RCs are a very stable system, particularly suitable to study the thermodynamics and kinetics of herbicide binding to the QB site. These features make PEM-RC structures quite promising in the development of herbicide biosensors. The studies discussed in the present thesis have shown that, although the effects on electron transfer induced by the native and artificial environments tested are markedly different, they can be described on the basis of a common kinetic model which takes into account the static conformational heterogeneity of the RC and the interconversion between conformational substates. Interestingly, the same distribution of rate constants (i.e. a Gamma distribution function) can describe charge recombination processes in solutions of purified RC, in RC-LH1 complexes, in wet and dry RC-PEM structures and in glassy saccharidic matrices over a wide range of hydration levels. In conclusion, the results obtained for RCs in different physico-chemical environments emphasize the relevance of the structure/dynamics solvent/protein coupling in determining the energetics and the kinetics of electron transfer processes in a membrane protein complex.

Molecular basis oh herpes simplex virus entry into the cell and retargeting of the viral tropism for the design of oncolytic herpesviruses

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) infects oral epitelial cells, then spreads to the nerve endings and estabilishes latency in sensory ganglia, from where it may, or may not reactivate. Diseases caused by virus reactivation include mild diseases such as muco-cutaneous lesions, and more severe, and even life-threatening encephalitis, or systemic infections affecting diverse organs. Herpes simplex virus represents the most comprehensive example of virus receptor interaction in Herpesviridae family, and the prototype virus encoding multipartite entry genes. In fact, it encodes 11-12 glycoproteins and a number of additional membrane proteins: five of these proteins play key roles in virus entry into subsceptible cells. Thus, glycoprotein B (gB) and glycoprotein C (gC) interact with heparan sulfate proteoglycan to enable initial attachment to cell surfaces. In the next step, in the entry cascade, gD binds a specific surface receptor such as nectin1 or HVEM. The interaction of glycoprotein D with the receptor alters the conformation of gD to enable the activation of gB, glycoprotein H, and glycoprotein L, a trio of glycoproteins that execute the fusion of the viral envelope with the plasma membrane. In this thesis, I described two distinct projects: I. The retargeting of viral tropism for the design of oncolytic Herpesviruses: • capable of infecting cells through the human epitelial growth factor receptor 2 (HER2), overexpressed in highly malignant mammary and ovarian tumors and correlates with a poor prognosis; • detargeted from its natural receptors, HVEM and nectin1. To this end, we inserted a ligand to HER2 in gD. Because HER2 has no natural ligand, the selected ligand was a single chain antibody (scFv) derived from MAb4D5 (monoclonal antibody to HER2), herein designated scHER2. All recombinant viruses were targeted to HER2 receptor, but only two viruses (R-LM113 and R-LM249) were completely detargeted from HVEM and nectin1. To engineer R-LM113, we removed a large portion at the N-terminus of gD (from aa 6 to aa 38) and inserted scHER2 sequence plus 9-aa serine-glycine flexible linker at position 39. On the other hand, to engineer R-LM249, we replaced the Ig-folded core of gD (from aa 61 to aa 218) with scHER2 flanked by Ser-Gly linkers. In summary, these results provide evidence that: i. gD can tolerate an insert almost as big as gD itself; ii. the Ig-like domain of gD can be removed; iii. the large portion at the N-terminus of gD (from aa 6 to aa 38) can be removed without loss of key function; iv. R-LM113 and R-LM249 recombinants are ready to be assayed in animal models of mammary and ovary tumour. This finding and the avaibility of a large number of scFv greatly increase the collection of potential receptors to which HSV can be redirected. II. The production and purification of recombinant truncated form of the heterodimer gHgL. We cloned a stable insect cell line expressing a soluble form of gH in complex with gL under the control of a metalloprotein inducible promoter and purified the heterodimer by means of ONE-STrEP-tag system by IBA. With respect to biological function, the purified heterodimer is capable: • of reacting to antibodies that recognize conformation dependent epitopes and neutralize virion infectivity; • of binding a variety cells at cell surface. No doubt, the availability of biological active purified gHgL heterodimer, in sufficient quantities, will speed up the efforts to solve its crystal structure and makes it feasible to identify more clearly whether gHgL has a cellular partner, and what is the role of this interaction on virus entry.