1000 resultados para signalisation cellulaire
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Les cellules souches embryonnaires (ES) sont porteuses de grands espoirs en recherche biomdicale dans le but dapporter un traitement dfinitif lostoarthrose. Parce que certaines articulations des chevaux sont similaires celles des humains, cet animal reprsente un modle important dans lvaluation de stratgies de rgnration du cartilage. Cependant, pour exprimenter un traitement par les cellules ES chez le cheval, des cellules ES quines (eES) nont toujours pas pu tre drives. Dans ce contexte, lobjectif principal de cette tude est de driver des lignes de cellules eES. Le premier objectif de notre tude consiste optimiser la technique de drivation des cellules eES. Nous dmontrons que la ligne de cellules nourricires et le stade de dveloppement des embryons influencent lefficacit de la technique de drivation tandis que linhibition de voies de signalisation menant la diffrenciation des cellules ES ne linfluence pas sous nos conditions. Le deuxime objectif de notre tude est de caractriser de faon plus approfondie les lignes de cellules eES obtenues. Nous dmontrons que les cellules eES drives expriment autant des marqueurs associs aux cellules pluripotentes quaux cellules diffrencies et que linhibition de voies de signalisation menant la diffrenciation ninfluence pas lexpression de ces marqueurs. Pour conclure, nous confirmons avoir driv des lignes de cellules semblables au cellules eES (eES-like) ne correspondant pas compltement aux critres des cellules ES.
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Les changements volutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire appropri, telles que les caractristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mcanismes sensoriels y rpondant. L'haplode de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprtant le gradient de la concentration d'une phromone scrte par les partenaires potentiels grce un rseau de protines signaltiques de type kinase actives par la mitose (MAPK). La dcision de la liaison sexuelle chez la levure est un vnement en "toutourien", la manire d'un interrupteur. Les cellules haplodes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phromones quil produit. Seul le partenaire proximit scrtant des concentrations de phromones gales ou suprieures une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phromones sont attribus des partenaires pouvant mener des accouplements infructueux. Notre comprhension du mcanisme molculaire contrlant cet interrupteur de la dcision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la prsente thse, je dmontre que le mcanisme de dcision de la liaison sexuelle provient de la comptition pour le contrle de l'tat de phosphorylation de quatre sites sur la protine d'chafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette comptition rsulte en la dissociation de type intrupteur entre Fus3 et Ste5, ncessaire la prise de dcision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la dcision de la liaison sexuelle s'effectue une tape prcoce de la voie de rponse aux phromones et se produit rapidement, peut-tre dans le but de prvenir la perte dun partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 gnre un mcanisme indit d'ultrasensibilit, ressemblant "l'ultrasensibilit d'ordre zro", qui rsiste aux variations de concentration de ces protines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dpit de la stochasticit cellulaire ou de variations gntiques entre individus.Je dmontre, par la suite, qu'un vnement prcoce en rponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 la membrane plasmique est galement ultrasensible l'augmentation de la concentration de phromones et que cette ultrasensibilit est engendre par la dphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associe Ste5 via la protine polarisante, Bem1. L'interfrence dans ce mcanisme provoque une perte de l'ultrasensibilit et rduit, du mme coup, l'amplitude et la fidlit de la voie de rponse aux phromones la stimulation. Ces changements se refltent en une rduction de la fidlit et de la prcision de la morphologie attribuable la rponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protique la surface de la membrane plasmique est un thme gnral persistant dans tous les organismes, de la bactrie l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accrotre l'efficacit, la fidlit et la spcificit de la transmission du signal. L'ensemble de nos dcouvertes dmontre que l'ultrasensibilit, la prcision et la robustesse de la rponse aux phromones dcoulent de la rgulation de la phosphorylation stoichiomtrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rle modulateur de Ste5 dans la dcision de la destine cellulaire tend le rpertoire fonctionnel des protines d'chafaudage bien au-del de l'accessoire dans la spcificit et l'efficacit des traitements de l'information. La rgulation de la dynamique des caractres signal-rponse travers une telle rgulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protines d'chafaudage combines l'assemblage la membrane peut tre un moyen gnral par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mcanismes similaires peuvent contrler les dcisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent tre compromis dans des drglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thme reli, je prsente la dcouverte d'un nouveau mcanisme o le seuil de la concentration de phromones est contrl par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manire, le point prdtermin dans lequel la quantit et la qualit des nutriments accessibles dans l'environnement dterminent le seuil partir duquel la levure s'accouple. La sous-unit rgulatrice de la kinase protine A (PKA),Bcy1, une composante cl du rseau signaltique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unit des petites protines G, Gpa1, le premier effecteur dans le rseau de rponse aux phromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en prsence d'un sucre idal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la dcision d'accouplement est active. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accrot la concentration seuil ncessaire une rponse aux phromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilit, les levures peuvent intgrer le stimulus provenant des phromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la dcision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement.
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Il y a 4 isoforme de p38 : , , , and . MK5, l'origine identifi comme tant un rgulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour tre active par la protine kinase p38 (qui est un mitogne activ par la protine kinase, MAPK). Cette dernire est implique dans les mcanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est galement active par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien quelles soient fortement exprimes dans le coeur, le rle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par consquent, nous avons tudi l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) induisant un surcharge chronique de pression chez les souris htrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a t augment chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'chocardiographie de la trans-thoracique dmontre que la surcharge de pression a altr la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observ moins de dpt de collagne, valu par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Paralllement, le niveau de lARNm de collagne type1 alpha-1 a t significativement diminu dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De mme, ERK3, mais pas ERK5 ni p38, co-IP avec MK5 dans les 2 modles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, lajout exognique de GST-MK5 a abaiss ERK4 et p38, mais pas ERK3 dans les lystes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38 ne dmontrent aucune co-IP avec MK5. Ces donnes suggrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38, est capable dinteragir avec, et rguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entirement avec ERK3 et par consquent MK5 nest pas disponible pour lier les protines exogniques. Les souris htrozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont galement dmontr une rduction ou une absence de collagne et une faible expression dARNm du collagne type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces rsultats dmontrent un important rle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons galement dmontr 5 variant d'pissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une dltion de 6 paires de base dans lexon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des diffrents variant d'pissage a t vrifie par PCR en temps rel (qPCR). Bien que lexpression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant tait tissu-spcifique (coeur, rein, pancras, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant dpissage varie pendant la surcharge de pression et le dveloppement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqu que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situ au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimules. Suite une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors quune petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'pissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rle exact oblige des recherches supplmentaires. Except lisoforme , toutes les isoformes de p38 sont exprimes dans le coeur et la forme est considre comme tant l'isoforme dominante. Lanalyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont dmontr que p38 et p38 sont les deux isoformes prdominantes alors que p38 et p38 sont exprimes aux mmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a dmontr que p38 et p38 se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite la surcharge par TAC, p38 s'est accumul dans noyau tandis que la distribution de p38 est demeure inchange. Ainsi, l'abondance de p38 et sa translocalisation nuclaire suite la surcharge de pression indique un rle potentiel dans l'expression gnique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en vidence pour la premire fois un rle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38 avec p38, et la localisation diffrentielle de p38 pendant la surcharge aigu ou chronique de pression suggrent diffrents rles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque.
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Linfection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le systme immunitaire et conduit une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par consquent, entrane un tat dimmunodficience. Cette immunodficience permet l'tablissement dinfections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associes au Sida. Ces patients peuvent aussi dvelopper des lymphomes, lsions du systme nerveux central et une atteinte rnale. L'ampleur et la svrit des conditions associes observes chez les patients infects par le VIH-1 ne peuvent tre imputes seulement au processus infectieux et la dpltion des cellules T CD4+. Ceci suggre que les produits des gnes de rgulation pourraient avoir des effets cytopathognes. Cependant, les tudes sur la physiopathogense induite par le VIH ou ses diffrents gnes ont t difficiles mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infects par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider dissquer le rle des diffrents composants du gnome viral et les mcanismes pathogntiques impliqus. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modle de souris transgniques pour le gne vpu. Vpu code pour une phosphoprotine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions la surface cellulaire, induit la dgradation des CD4, induit la rgulation ngative des CMH-1, augmente la susceptibilit la mort cellulaire des lymphocytes T infects par le VIH et favorise la rplication virale en empchant les mcanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractris pathologiquement un modle de souris transgniques porteuses du gne vpu du VIH-1. Nos rsultats dmontrent que lexpression de vpu chez les souris transgniques induit le dveloppement spontan dune hyperplasie lymphode pansystmique, une splnomgalie avec une hyperplasie lymphode folliculaire voluant en lsions prmalignes et malignes qui prsentent certaines similarits avec la maladie de Castleman et une iv glomrulonphrite mesangioprolifrative qui rappelle certaines altrations de nphropathie associe au VIH chez les patients infects. Lensemble des altrations dmontre que les souris Tg/vpu dveloppent une activation chronique et non spcifique du systme immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une drgulation de lIL-6 et une hyperplasie du rseau de cellules mtallophiliques pourraient tre impliques. Dautres rsultats obtenus sur les valuations du fonctionnement du systme immunitaire de la rate et du thymus mettent en vidence une susceptibilit augmente des lymphocytes des tissus lymphodes aux effets apoptotiques de la dexamthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules dorganes lymphodes ainsi quune raction inflammatoire (Schwartzman) exacerbe et des anomalies dans la raction dhypersensibilit retarde exprimentale. Ce modle transgnique reproduit plusieurs anomalies rencontres chez les patients infects par le VIH et ouvre de nouvelles hypothses sur la pathogense de linfection par le VIH.
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Quelques vidences suggrent que Bcl-xL, un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, possde galement des fonctions au niveau du cycle cellulaire et de ses points-contrle. Pour tudier la rgulation et fonction de Bcl-xL au cours du cycle cellulaire, nous avons gnr et exprim dans des cellules humaines une srie de mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala et Thr115Ala. L'analyse de cette srie de mutants rvle que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser62Ala) sont moins stables au point-contrle G2 du cycle cellulaire compares aux cellules exprimant le type sauvage ou les autres mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala et Thr115Ala. Les tudes de cintiques de phosphorylation et de localisation de phospho-Bcl-xL(Ser62) dans des cellules synchronises et suite l'activation du point-contrle en G2 mdi par l'toposide (VP16), nous indiquent que phospho-Bcl-xL(Ser62) migre dans les corps nuclolaires durant l'arrt en G2 dans les cellules exposes au VP16. Une srie d'expriences incluant des essais kinase in vitro, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et d'ARN interfrant, nous rvlent que Polo kinase 1 (PLK1) et MAPK9/JNK2 sont les protines kinase impliques dans la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62), et pour son accumulation dans les corps nuclolaires pendant le point-contrle en G2. Nos rsultats indiquent que durant le point-contrle en G2, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie et se co-localise avec CDK1(CDC2), le complexe cycline-kinase qui contrle l'entre en mitose. Nos rsultats suggrent que dans les corps nuclolaires, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilise l'arrt en G2 en squestrant CDK1(CDC2) pour retarder l'entre en mitose. Ces rsultats soulignent galement que les dommages l'ADN influencent la composition des corps nuclolaires, structure nuclaire qui merge maintenant comme une composante importante de la rponse aux dommages l'ADN. Dans une deuxime tude, nous dcrivons que les cellules exprimant le mutant de phosphorylation Bcl-xL(Ser62Ala) sont galement plus stables au point-contrle de l'assemblage du fuseau de la chromatine (SAC) suite une exposition au taxol, compares aux cellules exprimant le type sauvage ou d'autres mutants de phosphorylation de Bcl-xL, incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala. Cet effet est indpendent de la fonction anti-apoptotique de Bcl-xL. Bcl-xL(Ser62) est fortement phosphoryl par PLK1 et MAPK14/SAPKp38 la promtaphase, la mtaphase et la frontire de l'anaphase, et dphosphoryl la tlophase et la cytokinse. Phospho-Bcl-xL(Ser62) se trouve dans les centrosomes avec -tubuline, le long du fuseau mitotique avec la protine moteure dynine et dans le cytosol mitotique avec des composantes du SAC. Dans des cellules exposes au taxol, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie au complexe inhibiteur CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3, alors que le mutant Bcl-xL(Ser62Ala) ne se lie pas ce complexe. Ces rsultats indiquent que durant le SAC, la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62) acclre la rsolution du SAC et l'entre des cellules en anaphase. Des expriences bloquant l'expression de Bcl-xL rvlent galement un taux trs lev de cellules ttraplodes et binucles aprs un traitement au nocodazole, consistant avec une fonction de Bcl-xL durant la mitose et dans la stabilit gnomique. Dans la troisime tude, l'analyse fonctionnelle de cette srie de mutants de phosphorylation indique galement que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser49Ala) sont moins stables durant le point-contrle G2 et entre en cytokinse plus lentement dans des cellules exposes aux inhibiteurs de la polymrisation/dpolymrisation des tubulines, composantes des microtubules. Ces effets de Bcl-xL(Ser49Ala) sont indpendents de sa fonction anti-apoptotique. La phosphorylation de Bcl-xL(Ser49) est dynamique au cours du cycle cellulaire. Dans des cellules synchronises, Bcl-xL(Ser49) est phosphoryl en phase S et G2, dphosphoryl la promtaphase, la mtaphase et la frontire de l'anaphase, et re-phosphoryl durant la tlophase et la cytokinse. Au cours du point-contrle G2 induit par les dommages l'ADN, un pool important de phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve aux centrosomes, un site important pour la rgulation de l'entre en mitose. Durant la tlophase et la cytokinse, phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve le long des microtubules avec la protine moteure dynine et dans le cytosol mitotique. Finalement, nos rsultats suggrent que PLK3 est responsable de la phosphorylation de Bcl-xL(Ser49), une protine kinase implique pour l'entre des cellules en mitose et pour la progression de la mitose jusqu' la division cellulaire.
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La dcouverte du systme des peptides natriurtiques (NP), au dbut des annes 80, fut une dcouverte majeure qui rvla le rle endocrinien du cur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurse et la natriurse provoques par ce systme ont volu vers un niveau de complexit insouponn cette poque. Nous savons prsent que les NP sont impliqus dans plusieurs autres mcanismes dont la prolifration cellulaire, lapoptose, linhibition du systme rnine-angiotensine-aldostrone (RAAS) et le mtabolisme des adipocytes. Le mtabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre lobsit. Cette condition aux proportions pandmiques est un facteur de risque majeur dans lapparition de lhypertension et du syndrome mtabolique (MetS). La comprhension des mcanismes et des dfauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrle du MetS et de lhypertension. Lexpression du rcepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrle par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurtique de loreillette (ANP). La dcouverte dune boucle de retro-inhibition, dans les annes 90, a t un vnement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite une stimulation lANP, le NPR1/GCA peut inhiber lactivit transcriptionnelle de son propre gne par un mcanisme dpendant du cGMP. Notre groupe a identifi un lment cis-rgulateur responsable de cette sensibilit au cGMP et mon projet consistait identifier la ou les protine(s) liant cet lment de rponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifi un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque dADN complmentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient dun ADNc de 1083-bp dont le gne est localis sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protine dont la fonction tait inconnue jusquici. Nous avons nomm cette nouvelle protine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison lADN ont montr que cette protine possde une affinit 18 fois plus leve pour le cGMP-RE que le contrle, tandis que des expriences de retard sur gel (EMSA) ont confirm la spcificit des interactions protine-ADN. De plus, limmuno-prcipitation de la chromatine (ChIP) a prouv que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe lexpression du gne rapporteur lucifrase sous contrle du promoteur de npr1/gca. Linhibition de GREBP laide dARN interfrant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, lANP stimule lexpression de grebp de 60% aprs seulement 3 heures et inhibe lexpression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protine nuclaire surtout exprime dans le cur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nuclotidiques du gne sont plus frquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici lexistence dun gne spcifique lhumain qui agit comme rpresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqu dans le dveloppement de lhypertension.
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Linflammation est un procd complexe qui vise llimination de lagent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la rparation du tissu affect. La persistance de lagent causal ou lincapacit rsoudre linflammation mne un drglement homostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidit et la mortalit. Lathrosclrose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont lorigine est multifactorielle. Lhypertension et ltat infectieux reprsentent respectivement des facteurs de risque classiques et mergents du dveloppement de cette maladie. Les fondements initiaux de linflammation font intervenir limmunit inne, la premire ligne de dfense dont disposent les cellules pour rpondre un signal de danger. Le but de cette thse est dexaminer le rle pro-inflammatoire dune famille de kinases essentielles limmunit inne, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molcule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est charg deffectuer la phosphorylation de linhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mne sa dgradation et la libration du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit lactivit phosphotransfrase dIKKbeta dans les VSMC par immunoprcipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grce une approche ARN interfrence (ARNi) dirige contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mcanisme dinduction de NF-kappaB par lAngII est atypique, puisquil ne module pas IkappaBalpha, et montrons laide dinhibiteurs pharmacologiques que lactivation de p65 est indpendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du rcepteur de lEGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant elles principalement actives suite une infection bactrienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomgalovirus humain, un pathogne associ lathrosclrose, a la capacit dinduire lactivation de TBK1 dans les VSMC. Lusage dARNi dirig contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliques dans lactivation dIRF-3. De plus, nous montrons laide dune ligne de VSMC exprimant une version dominante ngative dIRF-3 que ce dernier est essentiel la synthse des chimiokines RANTES et IP-10, tel quanalys par RT-PCR. Par ailleurs, il a rcemment t montr que les kinases IKK-related taient troitement lies la transformation oncognique, et que TBK1 tait pro-angiognique. Or, langiogense est le plus souvent module par la rponse hypoxique qui est dailleurs commune la majorit des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module langiogense, linflammation et la survie cellulaire. Nous montrons laide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et dune approche lentivirale que TBK1 est spcifiquement implique dans linduction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. Lexpression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les rsultats originaux prsents dans cette thse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mcanismes distincts.
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Les virus exploitent la machinerie cellulaire de lhte de faon trs varie et plusieurs types vont mme jusqu incorporer certaines protines cellulaires. Nous avons rcemment effectu la premire analyse protomique du virion mature de lHerps simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de dterminer que jusqu 49 protines cellulaires diffrentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de dterminer leur importance dans le cycle de rplication dHSV-1, nous avons mis au point un systme de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relch dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqu la GFP ainsi que des petits ARN interfrents (pARNi) ciblant spcifiquement ces protines cellulaires. Cette approche nous a permis de dmontrer que 17 des protines identifies prcdemment jouaient un rle critique dans la rplication dHSV-1, suggrant ainsi que leur incorporation dans le virus nest pas alatoire. Nous avons ensuite examin le rle dune de ces protines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de rplication de plusieurs virus humains. laide de pARNi ainsi que de diffrentes lignes cellulaires, dont une ligne DDX3X thermosensible, nous avons dmontr que linhibition de DDX3X rsultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de lexpression des gnes viraux. Nous avons aussi dmontr que la fraction de DDX3X incorpore dans le virion contribuait activement au cycle infectieux dHSV-1. Ces rsultats confirment lintrt de notre approche afin dtudier les interactions hte-pathogne en plus de dmontrer la contribution des protines cellulaires incorpores HSV-1 dans linfection virale.
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Limmunosuppression a permis damliorer lincidence du rejet aigu sans toutefois amliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractris par une vasculopathie du greffon (VG) similaire une forme acclre dathrosclrose native accompagne de fibrose. La pathophysiologie de la VG dcoule de lhypothse de rponse linsulte propose par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, lendothlium stress par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie lapoptose endothliale suivi dune rponse de rparation vasculaire via un paississement myo-intimal aux sites dinsultes. Toutefois, lorsque les stress endothliaux initiaux demeurent soutenus, lapoptose endothliale et la rponse de rparation perptuent. Compte tenu que linhibition de lapoptose endothliale bloque le dveloppement de la VG in vivo, notre hypothse de travail reposait sur les rpercussions paracrines de lapoptose endothliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons gnr un systme exprimental in vitro afin dinduire lapoptose endothliale en absence significative de ncrose cellulaire. laide dune approche protomique multidimensionnelle et comparative, nous avons dmontr que les cellules endothliales apoptotiques exportent spcifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons dmontr que certains de ces SPM ont des proprits anti-apoptotiques (TCTP et EGF), dautre fibrognique (CTGF), rcapitulant ainsi certains phnotypes cellulaires associs au dveloppement de la VG. Parmi les mdiateurs identifis, 16 navaient pas de signal de scrtion, incluant TCTP, suggrant que des mcanismes de scrtion non conventionnels soient favoriss durant lapoptose. Nous avons dmontr que la caspase-3 effectrice rgule la voie de scrtion non classique exosomiale associe lexport extracellulaire de nanovsicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, lensemble des donnes protomiques ont permis dmettre lhypothse quen rponse un stress apoptotique, la cellule exporte diffrents mdiateurs (solubles et vsiculaires) de manire non conventionnelle ncessitant la fusion dorganelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mcanisme serait rgul durant la phase effectrice de lapoptose permettant ainsi dinitier une rponse de rparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protique et nanovsiculaire lgu durant lapoptose endothliale pourrait servir simultanment de biomarqueur de la VG et de cible thrapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique.
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Le dveloppement du systme nerveux central (SNC) chez les vertbrs est un processus d'une extrme complexit qui ncessite une orchestration molculaire trs prcise. Certains gnes exprims trs tt lors du dveloppement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gnes, on retrouve le facteur de transcription Lim homodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex crbral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume rduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) d une dficience en rythrocytes matures. L'objectif principal de cette thse est de caractriser le rle molculaire de Lhx2 dans le dveloppement des yeux et du cortex crbral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription homodomaine exprim dans la portion antrieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le dveloppement de l'oeil dbute par une vagination bilatrale de cette rgion. Nous dmontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premires tapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retarde dans la plaque neurale antrieure. Au stade de la formation de la vsicule optique, l'absence de Lhx2 empche l'activation de Six6 (un facteur de transcription galement essentiel au dveloppement de l'il). Nous dmontrons que Lhx2 et Pax6 cooprent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gne essentiel pour la dtermination de l'identit rtinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour tablir l'identit rtinienne dfinitive et promouvoir la prolifration cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprim dans le tlencphale, rgion qui donnera naissance au cortex crbral. L'absence de Lhx2 entrane une diminution de la prolifration des cellules prognitrices neurales dans cette rgion e12.5. Nous dmontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules prognitrices neurales (cellules de glie radiale) se diffrencient prmaturment en cellules prognitrices intermdiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phnotypes sont corrls une baisse d'activit de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprim dans le tlencphale. De plus, Lhx2 et des co-rpresseurs s'associent la chromatine de la rgion promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex crbral en dveloppement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifration des cellules prognitrices neurales.
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Les patients atteints de la maladie de Tangier prsentent des niveaux trs bas de lipoprotines de haute densit (HDL), un facteur de risque pour le dveloppement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre lathrosclrose puisquelles effecturent le transport rebours du cholestrol des tissus priphriques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est cause par des mutations dans le gne du transporteur ATP-binding cassette A1 (ABCA1). Le modle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de lapolipoprotine A-I (apoA-I), la composante protique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discodales. Un dfaut dans la lipidation de lapoA-I par lABCA1 abolit la biognse des HDL. Nous avons voulu tudier les sites dinteraction de lABCA1 avec son ligand (lapoA-I), les voies de biognse impliques, et limplication des pr--HDL dans lefflux du cholestrol par la voie de lABCA1. Dabord, nous avons utilis un systme de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de dterminer les sites de liaison cellulaires de lapoA-I, leurs localisations et limplication de lABCA1. Nous avons trouv que la majorit de lapoA-I nest pas associe lABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, tait la membrane plasmique. Ensuite, Une tude plus dtaille examinait les voies de lipidation de lapoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montr que la lipidation de lapoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies diffrentes cintiquement. Finalement, nous avons montr que les pr--HDL effluent aussi (efficacement que lapoA-I) le cholestrol par la voie de lABCA1. Ces observations runies dmontrent que 1) la majorit de lapoA-I sest trouv non-associe lABCA1; 2) deux tiers de lapoA-I sassocient a la membrane plasmique; 3) la lipidation de lapoA-I se fait en partie la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1.
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La tumeur des cellules de la granulosa (GCT) reprsente 5% des cas de cancers ovariens chez la femme. Bien que considres comme peu malignes, la mort survient dans 80% des cas suite une recrudescence de la maladie. En dpit de ces statistiques sinistres, peu dtudes ont t portes sur ce type de cancer. Le premier objectif de cette tude consistait lucider les mcanismes molculaires causant les GCT en dmontrant limplication de la voie de signalisation PI3K/AKT dans leur tiologie. Pour ce faire, nous avons employ la technologie Cre-Lox afin de cibler le gne Pten (antagoniste de cette voie) spcifiquement dans les cellules de la granulosa chez la souris. Ces souris (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) ont occasionnellement dvelopp des GCT, soutenant notre hypothse de limportance de la voie PI3K/AKT dans leur tiologie. La voie WNT/CTNNB1 est une autre voie de signalisation qui a rcemment t implique dans le dveloppement des GCT. Dans le cadre de ce projet, nous avons galement test lexistence possible dune synergie fonctionnelle entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le dveloppement de la maladie. Pour ce faire, nous avons cr le modle transgnique Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+, chez lequel les cellules de la granulosa prsentant non seulement une dsinhibition de la voie PI3K/AKT, mais aussi une suractivation de la voie WNT/CTNNB1. Tel que prdit, les souris Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ ont dvelopp une forme de GCT beaucoup plus agressive que celle observe chez les femelles Ptenflox/flox;Amhr2cre/+. Spcifiquement, le dveloppement des tumeurs se dclenchait plus tt, leur croissance tait beaucoup plus rapide, nous avons pu observer des mtastases pulmonaires et la dissmination des cellules tumorales dans la cavit pritonale, et la maladie tait invariablement fatale avant lge de 8 semaines. Le modle Ptenflox/flox;Ctnnb1flox (ex3)/+;Amhr2cre/+ a donc servi dmontrer l'existence d'une synergie entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le dveloppement de la GCT. De faon inattendue, les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ ont aussi prsent un phnotype de sous-fertilit qui ntait pas dorigine ovarienne. Il a rcemment t dmontr que la souche Amhr2cre dirige lexpression de Cre non seulement aux cellules de la granulosa, mais aussi au stroma utrin et au myomtre. Le second objectif de ce travail tait donc de dmontrer si et comment le phnotype dinfertilit chez les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ pouvait dcouler dun dfaut utrin. Lors de l'implantation, les cellules du stroma utrin se diffrencient en cellules dciduelles pour former la dcidua maternelle (DM), qui se rgresse ensuite par apoptose afin de faciliter linvasion des cellules trophoblastiques. De plus, la DM, en collaboration avec le tissu foetal, recrute des uNKs dont le rle est de remodeler les artres spirales pour augmenter lapport sanguin maternel vers le foetus en dveloppement. Nous avons pu dmontrer que l'utrus des femelles gestantes Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ prsentait une DM anormalement rsistante l'apoptose, moins de uNKs et des artres spirales non-remodeles. Par consquent, linvasion des cellules du trophoblaste tait restreinte, compromettant le dveloppement et la survie de l'embryon. Nous avons donc tabli pour la premire fois limportance de Pten lors de la dcidualisation et de linvasion du trophoblaste.
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Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus ADN double brin infectant les pithliums de la peau et des muqueuses. La rplication ncessaire au maintien de leur gnome dans les cellules infectes dpend des protines virales E1 et E2. Au cours de la rplication, E1 est recrute lorigine de rplication par E2 afin dtre assemble en doubles hexamres capables de drouler lADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de lactivit ATPase/hlicase, un domaine central de liaison lorigine et une rgion N-terminale rgulant la rplication in vivo. Cette rgion contient des signaux de localisation et dexport nuclaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a t propos que ce transport est rgul par la sumoylation de E1. Finalement, la rgion N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernire rgule diffremment lexport nuclaire des protines E1 du VPB et du VPH. Dans la premire partie de cette tude, nous avons dmontr que bien que la protine E1 des VPH interagit avec Ubc9, lenzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie nest pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons dtermin que laccumulation nuclaire de E1 est plutt rgule pas sa phosphorylation. En fait, nous avons dmontr que lexport nuclaire de E1 est inhib par la phosphorylation de srines conserves de la rgion N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons tabli que lexport nuclaire de E1 nest pas ncessaire lamplification du gnome dans les kratinocytes diffrencis mais quil est requis pour le maintien du gnome dans les kratinocytes non diffrencis. En particulier, nous avons dcouvert que laccumulation nuclaire de E1 inhibe la prolifration cellulaire en induisant un arrt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifratif est contrecarre par lexport de E1 au cytoplasme. Dans la troisime partie de cette tude, nous avons dmontr que larrt cellulaire induit par E1 dpend de sa liaison lADN et lATP, et quil est accompagn par lactivation de la voie de rponse aux dommages lADN dpendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux vnements semblent toutefois distincts puisque la formation dun complexe E1-E2 rduit lactivation de la voie de rponse aux dommages par E1 sans toutefois prvenir larrt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons dmontr que la rplication transitoire de lADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrtes en phase S, indpendamment de lactivation de la voie de rponse aux dommages lADN et de la kinase ATM. Globalement, nos rsultats dmontrent que lexport nuclaire de E1 est rgul par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils dmontrent galement que lexport nuclaire de E1 est essentiel au maintien du gnome dans les kratinocytes, possiblement parce quil prvient linhibition de la prolifration cellulaire et lactivation de la voie de rponse aux dommages lADN en limitant laccumulation de E1 au noyau.
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Lautophagie est un processus cellulaire catabolique qui a t conserv durant lvolution de la levure lhomme. Cet important mcanisme consiste en une dgradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de lautophagie : la microautophagie, lautophagie mdie par les chaperones et la macroautophagie nomme autophagie . Il a t dmontr que lors de lautophagie, le matriel cytoplasmique (protines cytosoliques et organites) est squestr dans lautophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi lautophagolysosome. Le matriel squestr et la membrane interne de lautophagosome seront dgrads par les hydrolases lysosomales. Plusieurs tudes se sont focalises sur la dtermination de la machinerie molculaire et les mcanismes de lautophagie. Il a t dmontr limplication de 31 molcules Atg essentielles dans le processus de lautophagie. Lidentification de ces protines a permis de dceler le rle de lautophagie non seulement dans le maintien de lhomostasie cellulaire mais aussi dans la dfense contre les agents pathognes. En effet, lautophagie joue un rle important dans limmunit inne conduisant contrler lvasion des pathognes dont les bactries et les virus. galement, lautophagie est implique dans limmunit adaptative en favorisant la prsentation des antignes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une tude rcente suggre que lautophagie contribue la prsentation antignique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu dvelopper des mcanismes pour contourner et inhiber en partie le rle protecteur de lautophagie. Rcemment, une tude dans notre laboratoire a mis en vidence, lors dune infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la prsence dune nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de linfection. Cette nouvelle structure est diffrente des autophagosomes classiques double membrane et est caractrise morphologiquement par quatre membranes drives de lenveloppe nuclaire interne et externe. Peu de choses ont t rapportes sur cette nouvelle voie autophagique qui peut tre un mcanisme de dfense cellulaire quand lautophagie classique dans le cytosol est inhibe par HSV-1. Il devient donc intressant de caractriser les molcules impliques dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectromtrie de masse. Pour ce faire, il tait impratif dtablir un outil disolation des noyaux partir de macrophages infects par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront forms. La validation de cette mthode disolation a t effectue en dterminant la puret et lintgrit des noyaux isols partir des cellules non infectes (contrle) et infectes par HSV-1. La puret des prparations de noyaux isols a t caractrise par labsence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. galement, il a fallu dterminer la cintique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignes cellulaires de macrophages utilises dans ce projet. Dans une perspective future, lanalyse protomique partir des chantillons purs des noyaux isols (non infects et infects) mnera identifier les protines impliques dans la formation des autophagosomes drivs des noyaux, ce qui permettra ultrieurement deffectuer des tudes sur les mcanismes molculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.
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Les facteurs dADP-ribosylation (ARFs) sont des petites GTPases impliques dans le transport vsiculaire, la synthse des lipides membranaires et la rorganisation du cytosquelette dactine. Les isoformes 1 (ARF1) et 6 (ARF6) sont les plus tudies. ARF1 est connue pour tre distribue lappareil de Golgi, alors quARF6 est confine principalement la membrane plasmique. Rcemment, il a t dmontr quARF6 est hautement exprime et active dans plusieurs cellules de cancer du sein invasif et que celle-ci contrle les processus de migration et dinvasion. Cependant, le rle dARF1 dans ces processus biologiques impliqus dans la formation de mtastases du cancer du sein demeure mconnu. Dans la prsente tude, nous avons utilis comme modle dtude pour ARF1 les MDA-MB-231, une ligne de cellules invasives du cancer du sein exprimant de haut niveau de rcepteurs au facteur de croissance pidermique (EGFR). Afin dvaluer le rle dARF1 dans la migration, dans la transition pithliale msenchymateuse (EMT) et dans la prolifration cellulaire, nous avons procd deux types dapproches exprimentales, soit linhibition de lexpression endogne dARF1 par linterfrence lARN de mme que la surexpression de formes mutantes dominante ngative (ARF1T31N) et constitutivement active dARF1 (ARF1Q71L), qui miment les formes inactive et active de la GTPase, respectivement. De manire intressante, la suppression dARF1 et la surexpression de la forme inactive dARF1 induisent larrt de la migration et de la prolifration des MDA-MB-231 de manire dpendante lactivation de lEGFR et ce, en bloquant lactivation de la voie PI3Kinase. De plus, nous dmontrons quARF1, de mme que les ARF GEFs Cytohsine-1 et Cytohsine-2, contribuent au phnotype invasif des cellules tumorales de cancer du sein. Dans les mmes approches exprimentales, nous montrons que linactivation dARF1 dans les MDA-MB-231 dclenche un arrt de croissance irrversible associ linduction de la snescence et ce, en rgulant la fonction de la protine du rtinoblastome pRb. Enfin, cette tude a permis de mettre en vidence le rle physiologique dARF1 dans les processus de migration et de prolifration cellulaire, deux vnements biologiques responsables de la progression du cancer du sein.
