Leukotriene A4 hydrolase: mapping of a henicosapeptide involved in mechanism-based inactivation.

Leukotriene A4 (LTA4) hydrolase [7E,9E,11Z,14Z)-(5S,6S)-5,6-epoxyicosa-7,9 ,11,14-tetraenoate hydrolase; EC 3.3.2.6] is a bifunctional zinc metalloenzyme which converts LTA4 into the chemotactic agent leukotriene B4 (LTB4). Suicide inactivation, a typical feature of LTA4 hydrolase/aminopeptidase, occurs via an irreversible, apparently mechanism-based, covalent binding of LTA4 to the protein in a 1:1 stoichiometry. Differential lysine-specific peptide mapping of unmodified and suicide-inactivated LTA4 hydrolase has been used to identify a henicosapeptide, encompassing the amino acid residues 365-385 of human LTA4 hydrolase, which is involved in the binding of LTA4, LTA4 methyl ester, and LTA4 ethyl ester to the native enzyme. A modified form of this peptide, generated by lysine-specific digestion of LTA4 hydrolase inactivated by LTA4 ethyl ester, could be isolated for complete Edman degradation. The sequence analysis revealed a gap at position 14, which shows that binding of the leukotriene epoxide had occurred via Tyr-378 in LTA4 hydrolase. Inactivation of the epoxide hydrolase and the aminopeptidase activity was accompanied by a proportionate modification of the peptide. Furthermore, both enzyme inactivation and peptide modification could be prevented by preincubation of LTA4 hydrolase with the competitive inhibitor bestatin, which demonstrates that the henicosapeptide contains functional elements of the active site(s). It may now be possible to clarify the molecular mechanisms underlying suicide inactivation and epoxide hydrolysis by site-directed mutagenesis combined with structural analysis of the lipid molecule, covalently bound to the peptide.

A chloroplast processing enzyme involved in precursor maturation shares a zinc-binding motif with a recently recognized family of metalloendopeptidases.

Nuclear-encoded proteins targeted to the chloroplast are typically synthesized with N-terminal transit peptides which are proteolytically removed upon import. Structurally related proteins of 145 and 143 kDa copurify with a soluble chloroplast processing enzyme (CPE) that cleaves the precursor for the major light-harvesting chlorophyll a/b binding protein and have been implicated in the maturation of the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and acyl carrier protein. The 145- and 143-kDa proteins have not been found as a heterodimer and thus may represent functionally independent isoforms encoded by separate genes. Here we describe the primary structure of a 140-kDa polypeptide encoded by cDNAs isolated by using antibodies raised against the 145/143-kDa doublet. The 140-kDa polypeptide contains a transit peptide, and strikingly, a His-Xaa-Xaa-Glu-His zinc-binding motif that is conserved in a recently recognized family of metalloendopeptidases, which includes Escherichia coli protease III, insulin-degrading enzyme, and subunit beta of the mitochondrial processing peptidase. Identity of 25-30%, concentrated near the N terminus of the 140-kDa polypeptide, is found with these proteases. Expression of CPE in leaves is not light dependent. Indeed, transcripts are present in dark-grown plants, and the 145/143-kDa doublet and proteolytic activity are both found in etioplasts, as well as in root plastids. Thus, CPE appears to be a necessary component of the import machinery in photosynthetic and nonphotosynthetic tissues, and it may function as a general stromal processing peptidase in plastids.

Mutagenesis of the putative alpha-helical domain of the Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1: effect on stability and virion incorporation.

vpr is one of the auxiliary genes of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and is conserved in the related HIV-2/simian immunodeficiency virus lentiviruses. The unique feature of Vpr is that it is the only nonstructural protein incorporated into the virus particle. Secondary structural analysis predicted an amphipathic alpha-helical domain in the amino terminus of Vpr (residues 17-34) which contains five acidic and four leucine residues. To evaluate the role of specific residues of the helical domain for virion incorporation, mutagenesis of this domain was carried out. Substitution of proline for any of the individual acidic residues (Asp-17 and Glu-21, -24, -25, and -29) eliminated the virion incorporation of Vpr and also altered the stability of Vpr in cells. Conservative replacement of glutamic residues of the helical domain with aspartic residues resulted in Vpr characteristic of wild type both in stability and virion incorporation, as did substitution of glutamine for the acidic residues. In contrast, replacement of leucine residues of the helical domain (residues 20, 22, 23, and 26) by alanine eliminated virion incorporation function of Vpr. These data indicate that acidic and hydrophobic residues and the helical structure in this region are critical for the stability of Vpr and its efficient incorporation into virus-like particles.

Interfacial activation-based molecular bioimprinting of lipolytic enzymes.

Interfacial activation-based molecular (bio)-imprinting (IAMI) has been developed to rationally improve the performance of lipolytic enzymes in nonaqueous environments. The strategy combinedly exploits (i) the known dramatic enhancement of the protein conformational rigidity in a water-restricted milieu and (ii) the reported conformational changes associated with the activation of these enzymes at lipid-water interfaces, which basically involves an increased substrate accessibility to the active site and/or an induction of a more competent catalytic machinery. Six model enzymes have been assayed in several model reactions in nonaqueous media. The results, rationalized in light of the present biochemical and structural knowledge, show that the IAMI approach represents a straightforward, versatile method to generate manageable, activated (kinetically trapped) forms of lipolytic enzymes, providing under optimal conditions nonaqueous rate enhancements of up to two orders of magnitude. It is also shown that imprintability of lipolytic enzymes depends not only on the nature of the enzyme but also on the "quality" of the interface used as the template.

Zebrafish como organismo-modelo para análises de efeitos comportamentais e toxicológicas da cetamina empregando cromatografia em fase gasosa e estatística multivariada

A cetamina é uma droga amplamente utilizada e o seu uso inadequado tem sido associado à graves consequências para a saúde humana. Embora as propriedades farmacológicas deste agente em doses terapêuticas sejam bem conhecidas, existem poucos estudos sobre os efeitos secundários induzidos por doses não-terapêuticas, incluindo os efeitos nos estados de ansiedade e agressividade. Neste contexto, os modelos animais são uma etapa importante na investigação e elucidação do mecanismo de ação a nível comportamental. O zebrafish (Danio rerio) é um novo organismo-modelo, interessante e promissor, uma vez que apresenta alta similaridade fisiológica, genética e neuroquímica com seres humanos, respostas comportamentais bem definidas e rápida absorção de compostos de interesse em meio aquoso além de apresentar uma série de vantagens em relação aos modelos mamíferos tais como manutenção de baixo custo, prática e executável em espaços reduzidos. Nesse sentido, faz-se necessário a execução de ensaios comportamentais em conjunto com análises estatísticas robustas e rápidas tais como ANOVA e Métodos Multivariados; e também o desenvolvimento de métodos analíticos sensíveis, precisos e rápidos para determinação de compostos de interesse em matrizes biológicas provenientes do animal. Os objetivos do presente trabalho foram a investigação dos efeitos da cetamina sobre a ansiedade e a agressividade em zebrafish adulto empregando Testes de Claro-Escuro e Testes do Espelho e métodos estatísticos univariados (ANOVA) e multivariados (PCA, HCA e SIMCA) assim como o desenvolvimento de método analítico para determinação da cetamina em matriz biológica proveniente do animal, empregando Extração Líquido-Líquido e Cromatografia em Fase Gasosa acoplada ao Detector de Nitrogênio-Fósforo (GC-NPD). Os resultados comportamentais indicaram que a cetamina produziu um efeito significativo dose-dependente em zebrafish adulto na latência à área clara, no número de cruzamentos entre as áreas e no tempo de exploração da área clara. Os resultados das análises SIMCA e PCA mostraram uma maior similaridade entre o grupo controle e os grupos de tratamento expostos às doses mais baixas (5 e 20 mg L-1) e entre os grupos expostos às doses de 40 e 60 mg L-1. Na análise por PCA, dois componentes principais responderam por 88,74% de toda a informação do sistema, sendo que 62,59% da informação cumulativa do sistema foi descrito pela primeira componente principal. As classificações HCA e SIMCA seguiram uma evolução lógica na distribuição das amostras por classes. As doses mais altas de cetamina induziram uma distribuição mais homogênea das amostras enquanto as doses mais baixas e o controle resultaram em distribuições mais dispersas. No Teste do Espelho, a cetamina não induziu efeitos significativos no comportamento dos animais. Estes resultados sugerem que a cetamina é modulador de comportamentos ansiosos, sem efeitos indutores de agressividade. Os resultados da validação do método cromatográfico indicaram uma extração com valores de recuperação entre 33,65% e 70,89%. A curva de calibração foi linear com valor de R2 superior a 0,99. O limite de detecção (LOD) foi de 1 ng e o limite de quantificação (LOQ) foi de 5 ng. A exatidão do método cromatográfico manteve-se entre - 24,83% e - 1,258%, a precisão intra-ensaio entre 2,67 e 14,5% e a precisão inter-ensaio entre 1,93 e 13,9%.

Sistema computacional com geração de dados e visualização de resultados para estrutura de edifícios

Este trabalho trata do desenvolvimento de um sistema computacional, para a geração de dados e apresentação de resultados, específico para as estruturas de edifícios. As rotinas desenvolvidas devem trabalhar em conjunto com um sistema computacional para análise de estruturas com base no Método dos Elementos Finitos, contemplando tanto as estruturas de pavimentos; com a utilização de elementos de barra, placa/casca e molas; como as estruturas de contraventamento; com a utilização de elementos de barra tridimensional e recursos especiais como nó mestre e trechos rígidos. A linguagem computacional adotada para a elaboração das rotinas mencionadas é o Object Pascal do DELPHI, um ambiente de programação visual estruturado na programação orientada a objetos do Object Pascal. Essa escolha tem como objetivo, conseguir um sistema computacional onde alterações e adições de funções possam ser realizadas com facilidade, sem que todo o conjunto de programas precise ser analisado e modificado. Por fim, o programa deve servir como um verdadeiro ambiente para análise de estruturas de edifícios, controlando através de uma interface amigável com o usuário uma série de outros programas já desenvolvidos em FORTRAN, como por exemplo o dimensionamento de vigas, pilares, etc.

Modelo tridimensional em elementos finitos para a análise de cabo umbilical STU submetido ao carregamento de crushing.

Este trabalho desenvolve e apresenta um modelo tridimensional em elementos finitos de um cabo umbilical do tipo STU (Steel Tube Umbilical) utilizado na extração offshore de petróleo. Tal modelo é utilizado para estudar o carregamento de crushing, que é imposto ao cabo umbilical pelas sapatas do tensionador durante o seu lançamento, de modo a obter de forma detalhada a distribuição de tensões nos componentes do núcleo, com foco nos tubos de aço utilizados para o transporte de fluidos. A metodologia empregada no desenvolvimento do modelo é descrita detalhadamente ao longo do trabalho, de forma que possa vir a ser utilizada no estudo de outras configurações de cabos umbilicais. O modelo elaborado é utilizado (i) como paradigma para a validação de um modelo bidimensional, que visa analisar o mesmo problema de forma mais simples e rápida, e (ii) para o estudo do comportamento das tensões nos tubos de aço na região de transição de entrada/saída da sapata. Na comparação entre os modelos bi e tridimensional, o trabalho conclui pela validade do modelo bidimensional na avaliação das tensões nos tubos de aço resultantes do carregamento de crushing, na região central do cabo. O estudo realizado na região de transição de entrada/saída da sapata permitiu verificar que ocorre um aumento dos níveis de tensão nos tubos de aço nessas regiões de transição, com redistribuição do campo de tensões após plastificação.

O elemento finito T6-3i na análise de placas e dinâmica de cascas.

O método dos elementos finitos é o método numérico mais difundido na análise de estruturas. Ao longo das últimas décadas foram formulados inúmeros elementos finitos para análise de cascas e placas. As formulações de elementos finitos lidam bem com o campo de deslocamentos, mas geralmente faltam testes que possam validar os resultados obtidos para o campo das tensões. Este trabalho analisa o elemento finito T6-3i, um elemento finito triangular de seis nós proposto dentro de uma formulação geometricamente exata, em relação aos seus resultados de tensões, comparando-os com as teorias analíticas de placas, resultados de tabelas para o cálculo de momentos em placas retangulares e do ANSYSr, um software comercial para análise estrutural, mostrando que o T6-3i pode apresentar resultados insatisfatórios. Na segunda parte deste trabalho, as potencialidades do T6-3i são expandidas, sendo proposta uma formulação dinâmica para análise não linear de cascas. Utiliza-se um modelo Lagrangiano atualizado e a forma fraca é obtida do Teorema dos Trabalhos Virtuais. São feitas simulações numéricas da deformação de domos finos que apresentam vários snap-throughs e snap-backs, incluindo domos com vincos curvos, mostrando a robustez, simplicidade e versatilidade do elemento na sua formulação e na geração das malhas não estruturadas necessárias para as simulações.

Caracterização macro e micromorfológica do solo para compreensão de processos erosivos lineares, topossequência Manacá, São Carlos - SP

A presente pesquisa tem como objetivo compreender a dinâmica de comportamento do solo sob escala macro e micromorfológica visualizados em topossequência, no que concerne aos agentes morfológicos que condicionam e contribuem para deflagração de processos erosivos. A área de estudo está inserida na sub-bacia hidrográfica do Laranja Azeda localizada na região centro-leste do estado de São Paulo, no município de São Carlos/SP, e têm fundamental importância por pertencer à bacia hidrográfica do Ribeirão Feijão, importante manancial urbano para a cidade. O planejamento de uso e ocupação adequados aos fatores físicos que compõe a dinâmica desta paisagem são essenciais visando a conservação e preservação dos recursos hídricos ali existentes, onde a expressiva ocorrência de processos erosivos são objetos de preocupação, já que estes podem causar assoreamento de rios e reservatórios. Utilizando uma metodologia multiescalar para seleção da área de pesquisa em detalhe e compreensão da organização e dinâmica da cobertura pedológica, foram utilizados os procedimentos propostos pela Análise Estrutural da Cobertura Pedológica e conceitos e técnicas da micromorfologia de solos. Verifica-se que a distribuição dos solos na Topossequência Manacá está estritamente correlacionada à transformação vertical do materialde origem em solo, em cuja vertente existe uma diferenciação litológica que condiciona a morfologia diferenciada, tanto em escala macromorfológica quanto micromorfológica. O terço superior e médio da vertente está associado à depósitos colúvio-eluvionaresda Formação Itaqueri, onde desenvolve-se um Latossolo Vermelho Amarelo. Já o terço inferior da vertente corresponde a um solo formado a partir dos arenitos da Formação Botucatu, sendo enquadrado enquanto Neossolo Quartzarênico. Com o auxílio técnicas de análise bidimensional de imagens retiradas das lâminas delgadas de solo, foi possível visualizar e quantificar a macroposidade ao longo da vertente, importante atributo morfológico que controla os fluxos de água e são agentes condicionantes para o desenvolvimento de processos erosivos. Conclui-se que a ocorrência de voçorocas no terço médio inferior da vertente é a materialização em forma de processos erosivos deste comportamento diferencial da massa do solo, onde portanto, na Topossequência Manacá a busca de equilíbrio dinâmico na vertente é induzida pela dinâmica genética evolutiva das formações geológicas que sustentam a paisagem, desencadeada em processos erosivos que tendem a progredir em desequilíbrio, a depender do manejo estabelecido para o local.

Overexpression of guanylate cyclase activating protein 2 in rod photoreceptors in vivo leads to morphological changes at the synaptic ribbon

Guanylate cyclase activating proteins are EF-hand containing proteins that confer calcium sensitivity to retinal guanylate cyclase at the outer segment discs of photoreceptor cells. By making the rate of cGMP synthesis dependent on the free intracellular calcium levels set by illumination, GCAPs play a fundamental role in the recovery of the light response and light adaptation. The main isoforms GCAP1 and GCAP2 also localize to the synaptic terminal, where their function is not known. Based on the reported interaction of GCAP2 with Ribeye, the major component of synaptic ribbons, it was proposed that GCAP2 could mediate the synaptic ribbon dynamic changes that happen in response to light. We here present a thorough ultrastructural analysis of rod synaptic terminals in loss-of-function (GCAP1/GCAP2 double knockout) and gain-of-function (transgenic overexpression) mouse models of GCAP2. Rod synaptic ribbons in GCAPs−/− mice did not differ from wildtype ribbons when mice were raised in constant darkness, indicating that GCAPs are not required for ribbon early assembly or maturation. Transgenic overexpression of GCAP2 in rods led to a shortening of synaptic ribbons, and to a higher than normal percentage of club-shaped and spherical ribbon morphologies. Restoration of GCAP2 expression in the GCAPs−/− background (GCAP2 expression in the absence of endogenous GCAP1) had the striking result of shortening ribbon length to a much higher degree than overexpression of GCAP2 in the wildtype background, as well as reducing the thickness of the outer plexiform layer without affecting the number of rod photoreceptor cells. These results indicate that preservation of the GCAP1 to GCAP2 relative levels is relevant for maintaining the integrity of the synaptic terminal. Our demonstration of GCAP2 immunolocalization at synaptic ribbons at the ultrastructural level would support a role of GCAPs at mediating the effect of light on morphological remodeling changes of synaptic ribbons.

Seismic behavior of a masonry chimney with severe cracking condition: preliminary study

This paper presents a structural analysis of a masonry chimney built in the 1940s, which is currently being cataloged as local interest heritage. This structure has not served any industrial purpose for the last thirty years. The chimney is located in the town of Agost (Alicante - Spain) and directly exposed to the prevailing winds from the sea, as it is approximately 12 km away from the waterfront and there are not any significant barriers, which could protect the structure against the wind. There are longitudinal cracks and fissures all along the shaft because of the chimney’s geometrical characteristics, the effect of the masonry creep and especially the lack of maintenance. Moreover, there is also a permanent bending deformation in the upper 1/3 of the height due to the wind pressure. A numerical analysis for the static behavior against gravity and wind loads was performed using the structure’s current conditions after a detailed report of its geometry, its construction system and the cracking pattern. Afterwards, the dynamic behavior was studied, i.e. a seismic analysis using both response spectra and accelerograms in order to examine the structural stability. This work shows the pre-monitoring analysis before any experimental testing. Using the current results the future test conditions will be determined (e.g. number of sensors and monitoring point location, excitation systems, etc) prior to a possible structural reinforcement by applying composite material (fiber reinforced polymers).

Evolución tectónica del borde norte de la cuenca del Bajo Segura. Implicaciones en la evolución de la falla de Crevillente (sector Abanilla-Alicante)

En este estudio presentamos los resultados del análisis estructural del borde norte de la cuenca del Bajo Segura, en la cordillera Bética oriental. En este borde se desarrolla el sinclinal de Crevillente; se trata de un pliegue de propagación de falla con geometría de crecimiento y vergente al sur asociado a la falla de Crevillente (sector Abanilla-Alicante). El estudio cuantitativo de la discordancia progresiva asociada a dicho pliegue ha puesto de manifiesto que la actividad de esta falla se inició en el Tortoniense, aumentó durante el Messiniense y, a partir de ese momento se ha mantenido constante o ha disminuido durante el Plioceno y el Cuaternario. La escasez de depósitos cuaternarios deformados no implica que no exista actividad cuaternaria de la falla de Crevillente (sector Abanilla-Alicante), ya que la mayoría de los depósitos más recientes son discontinuos o se localizan al sur, alejados de la zona de máxima deformación. Por otro lado, el hecho de que la actividad de la falla del Bajo Segura, situada en el borde meridional de la cuenca, se iniciara durante el Plioceno, parece indicar una migración de la deformación hacia el sur.

Study of zinc protein ligands in a halophilic enzyme

Glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) from the halophilic Archaeon Haloferax mediterranei belongs to the medium-chain alcohol dehydrogenase superfamily and requires a zinc ion for catalysis. The zinc ion is coordinated by a histidine, a water molecule and two other ligands from the protein or the substrate, which vary during the catalytic cycle of the enzyme. In many enzymes of this superfamily one of the zinc ligands is commonly cysteine, which is replaced by an aspartate residue at position 38 in the halophilic enzyme. This change has been only observed in glucose dehydrogenases from extremely halophilic microorganisms belonging to the Archaea Domain. This paper describes biochemical studies and structural comparisons to analyze the role of sequence differences between thermophilic and halophilic glucose dehydrogenases which contain a zinc ion within the protein surrounded by three ligands. Whilst the catalytic activity of the D38C GlcDH mutant is reduced, its thermal stability is enhanced, consistent with the greater structural similarity between this mutant and the homologous thermophilic enzyme from Thermoplasma acidophilum.

Resilience by solidary ties

This article considers an empirical approach to the relationships among three well known concepts: “Benevolence” (Schwartz), Solidarity and Resilience ("Subjective wellbeing scale" - SWB). The first concept refers to cultural values, the second one to social networks and the third to the ability to recover from crisis. The measurement of solidarity has been done from the point of view of supportive ties. The baseline hypothesis considers that the presence of a high value in Benevolence contributes to the involvements in solidarity networks. Participation in supportive relationships facilitates recovery from personal crisis. Using data from the European Social Survey (ESS6), we conclude from this structural analysis that the resilience reflected in a society is partly a consequence of the supportive networks shaped by the presence of benevolence values.

Targetless image-based method for measuring displacements and strains on concrete surfaces with a consumer camera

Measurement of concrete strain through non-invasive methods is of great importance in civil engineering and structural analysis. Traditional methods use laser speckle and high quality cameras that may result too expensive for many applications. Here we present a method for measuring concrete deformations with a standard reflex camera and image processing for tracking objects in the concretes surface. Two different approaches are presented here. In the first one, on-purpose objects are drawn on the surface, while on the second one we track small defects on the surface due to air bubbles in the hardening process. The method has been tested on a concrete sample under several loading/unloading cycles. A stop-motion sequence of the process has been captured and analyzed. Results have been successfully compared with the values given by a strain gauge. Accuracy of our methods in tracking objects is below 8 μm, in the order of more expensive commercial devices.