Comparação de métodos para detecção de Bipolaris sorokiniana em sementes de cevada

O fungo Bipolaris sorokiniana, agente causal da helmintosporiose da cevada (Hordeum vulgare), sobrevive como micélio em sementes infetadas e saprofiticamente nos restos culturais de seus hospedeiros. Em experimentos conduzidos em laboratório, diferentes métodos [papel-filtro, papel-filtro + componentes líquidos do meio seletivo de Reis (MSR), batata-dextrose-ágar (BDA), extrato de tomate-ágar, V-8-ágar, meio seletivo de Reis (MSR) e meio seletivo de Dodman & Reinke] foram comparados visando selecionar o mais sensível para detecção de B. sorokiniana em sementes de cevada. Os meios foram testados com e sem congelamento das sementes. Sem congelamento, os meios seletivos foram mais sensíveis na detecção de B. sorokiniana, seguidos pelo meio de BDA. O método papel-filtro padrão ocupou uma posição intermediária, estatisticamente inferior aos demais. Sob congelamento a -20 ºC (durante 16 h), o tratamento térmico anulou o efeito dos substratos na detecção do fungo, de tal modo que todos apresentaram comportamento estatisticamente semelhante. Esse procedimento não afetou positivamente a detecção do fungo-alvo deste estudo. O meio seletivo de Reis foi mais sensível que o de papel-filtro + congelamento na detecção de B. sorokiniana em sementes com diferentes níveis de incidência.

Efeito do lodo de esgoto na indução de supressividade in vitro a Phytophthora nicotianae

Uma alternativa de manejo das doenças causadas por Phytophthora spp. é o uso de matéria orgânica. No presente trabalho foi avaliada a potencialidade do lodo de esgoto na indução de supressividade in vitro a P. nicotianae. O efeito do lodo de esgoto incorporado ao solo na sobrevivência de P. nicotianae foi avaliado mediante um experimento fatorial com dois fatores: doses de lodo de esgoto (0, 10, 20 e 40% p/p) e concentrações de inóculo [0, 10 ou 20 g de grãos de trigo (Triticum aestivum) colonizados kg-1]. Aos 21 dias, quando aumentaram as doses de lodo de esgoto, a sobrevivência de P. nicotianae e os pHs das misturas diminuíram, e as condutividades elétricas (CE) aumentaram. As correlações entre a CE e a sobrevivência do patógeno foram negativas e significativas (P>0,05). Para estudar o efeito dos compostos químicos envolvidos na supressividade, foram obtidos extratos em água, H2SO4 2N e KOH 0,4N de misturas de areia – lodo de esgoto (20% p/p), e foram acrescentados ao meio de cultura e seu efeito avaliado no crescimento das colônias de P. nicotianae. O extrato ácido (H2SO4 2N) do tratamento com 20% de lodo de esgoto inibiu significativamente (P>0,05) o crescimento da colônia do patógeno. O efeito biológico foi estudado mediante isolamento de microrganismos em meio de cultura e seleção por antagonismo. No bioensaio com plântulas de alfafa (Medicago sativa) destacaram-se os isolados F9.1 (Aspergillus sp.) e A12.1 (actinomiceto, não identificado); e no teste de culturas pareadas destacou-se um Trichoderma sp. e dois actinomicetos por antibiose, e um Trichoderma sp. e três Aspergillus sp. por hiperparasitismo.

Eclosão e mortalidade de Meloidogyne exigua em extratos e em produtos naturais

A eclosão e mortalidade de juvenis de segundo estádio (J2) de Meloidogyne exigua foram avaliadas em extratos aquosos de urucum-colorau (Bixa orellana), cravo-da-índia (Syzygium aromaticum), canela (Cinnamomum zeylanicum), pimenta-do-reino (Piper nigrum), gengibre (Zingiber officinale), salsa (Petroselium crispum), soro de leite, solução nutritiva hidropônica, solução aquosa de cloreto de sódio (NaCl) e açúcar (sacarose), fermento biológico e probiótico (Controlmix®). O soro de leite e os extratos de canela, fermento biológico e cloreto de sódio causaram 100% de mortalidade (P<0,05) após 24 h do contato dos J2 com os extratos. Mortalidade acima de 50% também ocorreu nos extratos de cravo-da-índia e no probiótico. Os demais materiais testados foram estatisticamente iguais à água (P<0,05). A eclosão foi avaliada durante 16 dias de imersão dos ovos de M. exigua nos extratos. Comparando os valores da área abaixo da curva de progresso da eclosão, observou-se que, exceto o açúcar e a solução hidropônica, todos os extratos e produtos testados inibiram a eclosão (P<0,01) dos J2 de M. exigua. Entre todos os extratos e produtos testados, maior inibição (P<0,01) da eclosão ocorreu no soro de leite, probiótico, canelaecravo-da-índia, destacando-se o soro de leite e o extrato de canela que assim como inibiram a eclosão também foram altamente tóxicos aos juvenis.

Isolamento, caracterização cultural-morfológica, patogenicidade e serologia de Streptomyces spp. da batata

O presente trabalho testou quatro métodos de isolamento de Streptomyces spp. em tubérculos de batata (Solanum tuberosum) com sarna comum, superficial e profunda, caracterizando os isolados quanto a morfologia, serologia e patogenicidade. Para o isolamento foram testados: meio de cultura ágar-água a pH 10; meio contendo antibióticos; meio de asparagina e meio de quitina. O meio ágar-água pH 10 foi o mais eficaz no isolamento de Streptomyces spp. com média de 129 colônias/placa, além de ser de fácil preparo, menor custo e proporcionar melhor visualização das colônias. No meio de antibiótico verificou-se média de 54% dos fragmentos de tubérculos plaqueados com crescimento de Streptomyces spp. Já nos meios de asparagina e quitina a média foi de 36,3 e 2,5 colônias/placa, respectivamente. Para caracterização dos isolados obtidos utilizou-se o meio de extrato de levedura e malte. As colônias originadas apresentaram coloração que variou de cinza a marrom e de branco a creme, com ou sem produção de pigmento, com cadeias de esporos flexuosas ou espiraladas, de tamanho variável e produzindo ou não micélio aéreo em colônias com cadeias espiraladas. Dezenove isolados, representando esses diferentes tipos, foram inoculados na batata cv. Monalisa por infestação de solo autoclavado, antes da semeadura dos tubérculos-sementes. Sintomas típicos da doença foram verificados 14 semanas após a inoculação, para oito isolados. Anti-soros produzidos em coelhos contra três isolados fitopatogênicos apresentaram reação serológica (dupla difusão em gel-ágar de Ouchterlony) para os antígenos homólogos e para poucos antígenos heterólogos, porém os isolados de Streptomyces com patogenicidade confirmada não apresentaram antígenos em comum.

Efeitos na fotossíntese e área foliar de cultivares de alface inoculadas mecanicamente com patótipos do Lettuce mosaic virus e Lettuce mottle virus

Levantamentos realizados no estado de São Paulo indicaram a ocorrência isolada e em infecções mistas do Lettuce mosaic virus (LMV) e do Lettuce mottle virus (LeMoV) em plantas de alface (Lactuca sativa). O presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da infecção isolada e mista entre o LMV (patótipos II e IV) e o LeMoV, em cultivares de alface suscetível (White Boston) e tolerante (Elisa - gene mol¹) ao LMV patótipo II. As plantas foram inoculadas via extrato vegetal tamponado com isolados de LMV-II, LMV-IV e LeMoV separadamente e em diferentes combinações, com intervalo de 24 h ou simultaneamente com os dois vírus. As plantas infetadas foram analisadas utilizando-se hospedeiras diferenciais para o LMV e o LeMoV, e no caso do LMV pelo teste sorológico de PTA-ELISA. Nas avaliações de peso fresco e seco, área foliar e teor de clorofila, observou-se que a cultivar White Boston foi a mais afetada por ambos os vírus. As infecções mistas e isoladas na cultivar Elisa causaram efeitos semelhantes, provavelmente devido a presença do gene mo1¹ de tolerância ao LMV-II. O isolado LMV-IV foi considerado o mais agressivo nestas cultivares quando comparado ao LMV-II e o LeMoV.

Inibidor de tripsina em raízes de Eucalyptus urophylla

As raízes de eucalipto (Eucalyptus urophylla) podem estar associadas a fungos como Pisolithus tinctorius, formando uma simbiose conhecida como ectomicorriza, mas também podem estar colonizadas por fungos patogênicos, como Rhizoctonia solani, agente causal do tombamento de plantas em viveiros. O objetivo deste trabalho foi verificar a presença de atividade inibitória de tripsina, uma serino-protease, em raízes de E. urophylla e a atividade de tripsina em filtrados desses fungos. Alíquotas de extrato protéico bruto de raízes de E. urophylla e frações protéicas parcialmente purificadas por cromatografia de exclusão molecular, do tipo Sephacryl S-100-HR, foram testadas para atividade inibitória de tripsina. Proteínas do extrato ou das frações, quando incubadas com o substrato BAPNA (a-benzoil-arginina-p-nitroanilida) e tripsina comercial na presença de tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0), resultou em atividade de inibidor de tripsina ao redor de 80%. Filtrados de meios de cultura de P. tinctorius e R. solani foram parcialmente purificados em cromatografia de exclusão molecular, porém atividade de tripsina sobre o substrato BAPNA não foi verificada em nenhuma das frações. Portanto, não foi possível estabelecer uma correlação direta entre o inibidor da planta e proteases dos fungos. Os resultados apresentados abrem novas perspectivas para o estudo dessas proteínas nas interações entre patógenos e simbiontes para espécies de eucalipto.

Crescimento, esporulação e virulência do inóculo de Cercospora piaropi, agente de biocontrole do aguapé

O presente ensaio foi realizado com o objetivo de avaliar a produção de biomassa micelial bem como a esporulação de Cercospora piaropi, nos meios líquidos V8, ETD (Extrato de Tomate Diluído) e BD (Batata - Dextrose), em períodos de cultivo de 96, 120, 144 e 168 h, sob agitação constante. Adicionalmente foi avaliado o efeito de períodos de desidratação da biomassa micelial (24, 48, 72, 96 e 120 h) sobre a esporulação. Os inóculos obtidos foram avaliados quanto à severidade da doença em plantas de aguapé (Eichhornia crassipes). De acordo com os resultados, o meio ETD proporcionou maior crescimento micelial em relação aos meios BD e V8, destacando-se o período de 144 h de agitação. Entretanto, o meio V8 induziu esporulação superior do patógeno, quando cultivado por 120 h. Os inóculos obtidos nos meios V8 e ETD causaram maiores valores de severidade da doença. O período de desidratação da biomassa micelial a partir de 72 h favoreceu maior produção de conídios. Não houve efeito do período de desidratação sobre a severidade da doença.

Produção de micélio de Crinipellis perniciosa em quatro meios de cultura, visando extração de DNA

A produção de massa micelial é o primeiro passo para obter amostras de DNA de qualidade e quantidade suficiente para análises moleculares. Neste trabalho, objetivou-se analisar a quantidade e a qualidade do DNA de Crinipellis perniciosa extraído a partir de massa micelial obtida em quatro meios de cultura. Foi avaliado o peso de micélio liofilizado produzido nos seguintes meios de cultura: 1. extrato de levedura (2,5%); 2. extrato de malte (2,5%); 3. BD (batata 20% e dextrose 2%) e 4. extrato de malte + BD (50% de cada meio). O crescimento micelial foi iniciado a partir de um disco de micélio colocado no centro de placas de Petri de 90 mm contendo o meio testado e mantidas a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h, por dez dias. Foi utilizado o DIC com dez repetições. O micélio produzido foi liofilizado e o DNA extraído utilizando-se o método do SDS com a desproteinização feita com ou sem fenol. A pureza do DNA baseada na relação A260/A280 e a integridade em gel de agarose 0,8% foram analisadas. A quantidade de micélio produzida nos meios de cultura 1 e 4 foi maior do que nos meios 2 e 3. O DNA extraído a partir de micélio produzido nos meios 2 e 3 apresentou maior integridade, obtendo-se produtos de amplificação mais nítidos. A desproteinização com fenol possibilitou a extração de DNA mais puro. Porém, DNA de ótima qualidade e em quantidade suficiente pode ser extraído a partir de micélio produzido em meios baratos como o BD, sem a necessidade da desproteinização com fenol.

Técnica de restrição hídrica: efeito sobre Acremonium strictum, protrusão de sementes e obtenção de sementes de milho infetadas

Este experimento objetivou a obtenção de sementes de milho (Zea mays) portadoras de Acremonium strictum, utilizando-se técnica de restrição hídrica e visando sua utilização posterior em estudos sobre a interação patógeno - hospedeiro. O trabalho constou de avaliações de efeitos da adição de manitol, NaCl e KCl nos potenciais de -0,48; -0,6; -0,8; -1,0; -1,2 e -1,4 MPa ao meio extrato de malte-ágar (MEA) sobre o crescimento micelial, textura de micélio, forma marginal da colônia, pigmentação e esporulação in vitro de colônias de A. strictum, bem como sobre o percentual de protrusão de radículas de sementes de milho. Foi avaliada também a correlação entre diferentes períodos de exposição das sementes à colônia do fungo e sua incidência em sementes desinfestadas ou não com NaClO 1% por 2 min. A taxa de crescimento micelial de A. strictum foi estimulada em meio MEA + manitol (-0,6 a -1,4 MPa) e a morfologia típica de colônias do patógeno em meio MEA acrescido com manitol, NaCl e KCl diferiu dos padrões apresentados no controle (-0,48 MPa). A esporulação do fungo foi estimulada pelo manitol nos potenciais -0,8 a -1,4 MPa, aplicados ao meio de cultivo padrão. As menores percentagens de protrusão radicular em sementes de milho incubadas por até cinco dias foram observadas em MEA + manitol (-1,4 MPa) e MEA + NaCl (-1,2 e -1,4 MPa). No entanto, verificou-se efeito fitotóxico do NaCl sobre a germinação das sementes. Por meio da técnica de restrição hídrica foi possível obter até 36% de sementes de milho infetadas por A. strictum.

Diagnóstico biológico e molecular e análise da seqüência de nucleotídeos do gene da proteína capsidial de um isolado do Apple stem pitting virus

O Apple stem pitting virus (ASPV) foi detectado por RT-PCR em amostras de cultivares de pereiras européias (Pyrus communis L.) cvs. Starkrimson e Abate Fetel, e asiáticas (P. pyrifolia var. culta) cvs. Kousui e Housui coletadas no início do outono de 2003 em pomar da Estação Experimental da Embrapa Uva e Vinho, Vacaria, RS. Utilizando várias combinações de oligonucleotídeos, foram amplificados fragmentos de DNA de 269 e 1554 pb, este último contendo o gene completo (1131 nt) da proteína capsidial do ASPV. Outro fragmento amplificado de 291 pb compreende parte do gene da polimerase viral. Estes fragmentos constituem-se em um excelente instrumento de diagnóstico do ASPV em pereiras. A comparação das seqüências de nucleotídeos do gene da proteína capsidial do ASPV com seqüências do banco de dados GenBank, revelou identidades de 89% com seqüências de um isolado alemão de macieira e de 85 a 88% com isolados poloneses, de pereiras. A indicadora herbácea Nicotiana occidentalis cv. 37B, inoculada mecanicamente com extrato foliar da cv. Housui, apresentou lesões locais necróticas, necrose foliar marginal e das nervuras. O ASPV também foi detectado por dot-ELISA nas cvs. Abate Fetel e Kousui, na cv. Starkrimson por imunoblot, e em Pyronia veitchii (Trabut) Guill. por enxertia de borbulhas da cv. Abate Fetel infetada.

Severidade da podridão-verde em inhames e especialização fisiológica em Penicillium sclerotigenum

Estudaram-se as reações do inhame Dioscorea alata cv. São Tomé e D. cayennensis cv. Da Costa em relação à severidade da podridão-verde, causada pelo fungo Penicillium sclerotigenum. Ao mesmo tempo, foi pesquisada à ocorrência de especialização fisiológica do agente causal, em relação à patogenicidade, nas mencionadas espécies de inhame. Para complementar esse estudo, analisou-se, in vitro, o crescimento micelial de P. sclerotigenum em três meios de cultura semi-sintéticos, sendo dois à base de extrato de túberas das espécies de inhame supracitadas e o terceiro de batata inglesa (Solanum tuberosum), todos complementados com dextrose e ágar. Observou-se que a severidade da podridão-verde foi menor em D. alata do que em D. cayennensis, não sendo constada especialização fisiológica nos isolados de P. sclerotigenum. Corroborando com esses resultados, o crescimento e desenvolvimento dos isolados de P. sclerotigenum no meio D. alata Dextrose Ágar foi significativamente menor do que nos meios Batata Dextrose - Ágar e D. cayennensis Dextrose Agar, esses mais favoráveis para crescimento do fungo.

Caracterização de isolados de Phytophthora drechsleri, agente causal da podridão mole de raízes de mandioca

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar nove isolados de Phytophthora sp. obtidos de mandioca (Manihot esculenta), através da morfologia e morfometria das estruturas propagativas e crescimento micelial em diferentes temperaturas e avaliar sua patogenicidade. Os esporângios produzidos em extrato de solo não esterilizado mostraram-se ovóides, não papilados, persistentes, formados em esporangióforos não ramificados ou em simpódio, com dimensões de 24,6 - 57,4 µ x 14,8 - 37,7 µm e relação comprimento/largura de 1,0 - 2,6. Os clamidósporos foram raros. Os oósporos obtidos em cultura monospórica em V8 ágar eram apleuróticos, com 13,1 - 34,4 µm de diâmetro. Oogônios mostraram-se esféricos e mediram 19,7 - 41,0 µm de diâmetro; anterídios anfígenos, com dimensões de 8,2 - 24,6 µm x 8,2 - 19,7 µm. O maior diâmetro das colônias ocorreu a 25 ºC em V8 ágar. Os isolados patogênicos às plantas e raízes destacadas de mandioca inoculados foram identificados como Phytophthora drechsleri.

Controle de Alternaria solani em tomateiro por extratos de Curcuma longa e curcumina: I. avaliação in vitro

A descoberta de compostos secundários de plantas medicinais com atividade antimicrobiana mostra-se promissora para o controle de fitopatógenos. A cúrcuma, Curcuma longa, apresenta em seus rizomas compostos com atividade antifúngica. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a fungitoxidade in vitro dos extratos de cúrcuma e da curcumina contra Alternaria solani. Foram utilizados extratos brutos aquosos (EB) de rizomas de cúrcuma (esterilizados por autoclavagem) nas concentrações de 0, 1, 5, 10 e 20% e curcumina nas concentrações de 0, 50, 100, 200 e 400 mg/L, os quais foram incorporados em meio de cultura batata-dextrose-ágar para avaliação de crescimento micelial e esporulação do fungo. Também foram testados extratos de cúrcuma a 10 e 15% esterilizados por filtração. O efeito dos extratos de cúrcuma autoclavados e não autoclavados e da curcumina na germinação de esporos in vitro foi também avaliado. Os extratos de cúrcuma a 10 e 15% não autoclavados inibiram em 38,2% e 23,2%, respectivamente, o crescimento micelial e 71,7% e 87%, respectivamente, a esporulação do fungo. Quando autoclavados, não apresentaram inibição do crescimento micelial nem da germinação de esporos e a inibição da esporulação foi menor, indicando a presença de compostos antimicrobianos termolábeis. O extrato não autoclavado na concentração de 5% inibiu em até 15% a germinação dos esporos. A curcumina inibiu o crescimento micelial em 29,5% na maior concentração testada, sem, contudo, afetar a esporulação e a germinação de esporos in vitro. Esses resultados indicam o potencial antifúngico da cúrcuma e curcumina contra A. solani.

Sobrevivência de Acidovorax avenae subsp. citrulli em meloeiro

A capacidade de Acidovorax avenae subsp. citrulli sobreviver epifítica e endofíticamente nas folhas e raízes, bem como na rizosfera de meloeiro, foi determinada utilizando um isolado mutante resistente a rifampicina (Aac1Rif). Folhas de meloeiros com 18 dias, cultivados em casa de vegetação e no campo, foram pulverizadas com suspensões do mutante nas concentrações (3,4 x 10², 3,4 x 10³ e 3,4 x 10(4) ufc.ml-1). Para determinar a sobrevivência em raízes e na rizosfera sementes de melão Amarelo híbrido AF-682 foram semeadas em solo infestado com suspensões de Aac1Rif a 3,4 x 10(5), 3,4 x 10(6) e 3,4 x 10(7) ufc.ml-1. A cada seis dias, amostras de folhas, raízes e solo rizosférico foram coletadas e processadas para isolamento em meio de ágar nutritivo + extrato de levedura + dextrose contendo rifampicina. As populações bacterianas foram determinadas em ufc.g-1 de amostra e os dados obtidos transformados em log10 para análise de regressão. Nas folhas de meloeiro, em casa-de-vegetação e campo, o mutante Aac1Rif sobreviveu epifiticamente durante 54 dias, observando-se inicialmente aumento da população bacteriana epifítica, com posterior declínio, sendo as populações finais semelhantes nas duas condições estudadas, com valores variando de 10³ a 10(4) ufc.g-1 de folha, independente da concentração do inóculo inicial. Nas raízes e rizosfera, em casa-de-vegetação, a população bacteriana decresceu ao longo do tempo até atingir aos 60 dias após a infestação do solo, níveis de 10² a 10³ ufc.g-1 de raiz e 10¹ ufc.g-1 de solo. AacRif não foi detectado sobrevivendo endofiticamente em folhas ou raízes de meloeiro.

Controle de Alternaria solani em tomateiro por extratos de Curcuma longa e curcumina: II. Avaliação in vivo

A pinta preta, causada por Alternaria solani, é uma das mais importantes doenças da cultura do tomateiro no Brasil. Várias alternativas aos fungicidas têm sido avaliadas nos últimos anos na busca de produtos que controlem satisfatoriamente as doenças, tenham pequeno impacto ambiental e baixa toxicidade aos seres vivos. A cúrcuma, Curcuma longa, apresenta em seus rizomas compostos com comprovada atividade antimicrobiana. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o controle de pinta preta em tomateiro utilizando extratos de cúrcuma e curcumina em condições de casa de vegetação. Os tratamentos utilizados foram: extrato de cúrcuma (1 e 10%), curcumina (50 e 100 mg/L), acibenzolar-S-metil (ASM) (25 mg do i.a./L), oxicloreto de cobre (1.100 mg do i.a./L), azoxystrobin (80 mg do i.a./L) e testemunha (água). A curcumina e os extratos brutos de cúrcuma apresentaram níveis de controle de pinta preta similares ao tratamento com fungicida cúprico, mas inferior ao azoxystrobin. Não houve diferenças estatísticas na produção comercial de tomate entre tratamentos. Somente o tratamento de curcumina 50 mg/l apresentou maior porcentagem de frutos grandes em relação à testemunha. Esses resultados indicam o potencial de controle de pinta preta em tomateiro com cúrcuma e curcumina.