An examination of transcriptional and translational regulation of the 70kDa heat shock proteins following amputation of the tail and forelimb in the newt Notophthalmus viridescens

Several stresses to tissues including hyperthermia, ischemia, mechanical trauma and heavy metals have been demonstrated to affect the regulation of a subset of the family of heat shock proteins of70kOa (hsp70). In several organisms following some of these traumas, the levels of hsp70 mRNA and proteins are dramatically upregulated. However, the effects of the stress on limb and tail amputation in the newt Notophthalmus viridescens, involving mechanical tissue damage, have not adequately been examined. In the present study, three techniques were utilized to quantitate the levels of hsp70 mRNA and protein in the tissues of the forelimbs and tails of newts during the early post-traumatic events following surgical resection of these:: appendages. These included quantitative Western blotting of proteins separated by both one and twodimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and quantitative Northern blot analysis of total RNA. In tissues of both the limb and tail one hour after amputation, there were no significant differences in the levels of hsp70 protein measured by one-dimensional SOSPAGE followed by Western blotting, when compared to the levels measured in the unamputated limb. A 30 minute heat shock at 35°C failed to elicit an increase in the levels of hsp70 protein in these tissues. Further analysis using the more sensitive 20 PAGE separation of stump tissue proteins revealed that at least some of the five hsp70 isoforms of the newt may be differentially regulated in limbs and tails in response to trauma. It appears also that amputation of the tail and limb tissues leads to slight 3 elevation in the levels of HSP70 mRNA when compared to those of their respective unstressed tissues.

Response curves of deterministic and probabilistic cellular automata in one and two dimensions

One of the most important problems in the theory of cellular automata (CA) is determining the proportion of cells in a specific state after a given number of time iterations. We approach this problem using patterns in preimage sets - that is, the set of blocks which iterate to the desired output. This allows us to construct a response curve - a relationship between the proportion of cells in state 1 after niterations as a function of the initial proportion. We derive response curve formulae for many two-dimensional deterministic CA rules with L-neighbourhood. For all remaining rules, we find experimental response curves. We also use preimage sets to classify surjective rules. In the last part of the thesis, we consider a special class of one-dimensional probabilistic CA rules. We find response surface formula for these rules and experimental response surfaces for all remaining rules.

Mass spectrometry as a tool to dissect the role of chromatin assembly factors in regulating nucleosome assembly

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones.

Stabilité instrumentale en neuro imagerie fonctionnelle et structurelle

Dans ce mémoire, nous décrivons le travail effectué pour étendre nos connaissances sur les sources d’instabilité instrumentales en imagerie de résonance magnétique, en particulier dans le domaine anatomique par une étude où cinq adultes ont été scannés quatre fois dans la même plate-forme IRM, deux fois avant et deux fois après une mise à niveau importante d’un scanner 3T de Siemens. Les volumes de l’hippocampe droit et gauche de chaque sujet ont été mesurés avec une segmentation manuelle. Nous avons analysé la fiabilité test-retest avant et après la mise à niveau du système d’IRM. Dans le domaine fonctionnel, cinq adultes ont été scannés quatre fois dans la même plate forme IRM deux fois avant et deux fois après la même mise à niveau du scanneur. Les acquisitions du signal BOLD sont faites dans deux différentes résolutions spatiales (2x2x2mm et 4x4x4mm) pour évaluer la sensibilité du signal BOLD sous conditions de haute et basse SNR. Une dernière étude fonctionnelle sur fantôme avait pour but d’étudier la stabilité de la machine pour les images fonctionnelles et détecter les sources de bruit de type machine. La séquence EPI (Echo Planar Imaging) d’écho de gradient à deux dimensions a été utilisée. Des analyses comme le pourcentage des fluctuations et l’analyse de Fourier des résidus ont également été réalisées. Nous résultats indiquent que les différences dans le matériel provenant d’une importante mise à niveau ne peuvent pas compromettre la validité des études structurelles et fonctionnelles faites à travers la mise à niveau du scanneur. Les acquisitions quotidiennes ont permis de suivre l’évolution de la stabilité et de détecter toute source de bruit qui peut détériorer la détection des activations dans les images fonctionnelles.

La RNase P mitochondriale chez Neurospora crassa

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée.

Mammite bovine à Escherichia coli : identification et caractérisation de la persistance

Escherichia coli est un agent de mammites environnementales. Par contre, E. coli peut persister dans la glande mammaire. Les objectifs de cette étude étaient de confirmer la présence d’infection persistante chez des vaches laitières canadiennes et d’identifier la possibilité de contagion entre les quartiers d’une vache dans une cohorte de 91 fermes suivies durant deux ans. De plus, les souches persistantes ont été comparées à des souches transitoires. Les profils génétiques ont été obtenus à l’aide de l’électrophorèse sur gel en champs pulsés. La détection de la résistance pour sept antibiotiques s’est faite par microdilution. Vingt-sept gènes de virulence ont été déterminés par hybridation sur colonies. De la persistance a été détectée chez 18 vaches et de la contagion entre quartiers, chez deux vaches. La proportion de résistance chez les E. coli persistants était de 0,0 % (enrofloxacin) à 27,8 % (ampicilline et tétracycline) et de 0,0 % (enrofloxacin) à 16,8 % (tétracycline) pour les E. coli transitoires. Pour chacune des résistances additionnelles, les probabilités d’être une souche persistante augmentaient par un facteur 1,6 (95% IC : 1.1, 2.4). Une souche résistante à l’ampicilline et à la céphalothine avait une plus forte probabilité d’être persistante. Une souche possédant le gène iroN avait 5.4 fois plus de probabilité (95% IC: 1.2, 24.0) d’être persistante. Aussi, une souche positive pour le gène sitA avait 8.6 fois plus de probabilité (95% IC: 2.8, 27.1) d’être persistante. En conclusion, cette étude confirme qu’E. coli peut persister dans la glande mammaire des vaches laitières canadiennes et que ces E. coli sont différents de ceux impliqués lors d’infection transitoire.

Finite-size scaling analysis of the avalanches in the three-dimensional Gaussian random-field Ising model with metastable dynamics

A numerical study is presented of the third-dimensional Gaussian random-field Ising model at T=0 driven by an external field. Standard synchronous relaxation dynamics is employed to obtain the magnetization versus field hysteresis loops. The focus is on the analysis of the number and size distribution of the magnetization avalanches. They are classified as being nonspanning, one-dimensional-spanning, two-dimensional-spanning, or three-dimensional-spanning depending on whether or not they span the whole lattice in different space directions. Moreover, finite-size scaling analysis enables identification of two different types of nonspanning avalanches (critical and noncritical) and two different types of three-dimensional-spanning avalanches (critical and subcritical), whose numbers increase with L as a power law with different exponents. We conclude by giving a scenario for avalanche behavior in the thermodynamic limit.

Covalently Interconnected Three- Dimensional Graphene Oxide Solids

The creation of three-dimensionally engineered nanoporous architectures via covalently interconnected nanoscale building blocks remains one of the fundamental challenges in nanotechnology. Here we report the synthesis of ordered, stacked macroscopic three-dimensional (3D) solid scaffolds of graphene oxide (GO) fabricated via chemical cross-linking of two-dimensional GO building blocks. The resulting 3D GO network solids form highly porous interconnected structures, and the controlled reduction of these structures leads to formation of 3D conductive graphene scaffolds. These 3D architectures show promise for potential applications such as gas storage; CO2 gas adsorption measurements carried out under ambient conditions show high sorption capacity, demonstrating the possibility of creating new functional carbon solids starting with two-dimensional carbon layers

Cereal/legume rotation effects on rhizosphere bacterial community structure in West African soils

The increased use of cereal/legume crop rotation has been advocated as a strategy to increase cereal yields of subsistence farmers in West Africa, and is believed to promote changes in the rhizosphere that enhance early plant growth. In this study we investigated the microbial diversity of the rhizoplane from seedlings grown in two soils previously planted to cereal or legume from experimental plots in Gaya, Niger, and Kaboli, Togo. Soils from these legume rotation and continuous cereal plots were placed into containers and sown in a growth chamber with maize (Zea mays L.), millet (Pennisetum glaucum L.), sorghum (Sorghum bicolor L. Moench.), cowpea (Vigna unguiculata L.) or groundnut (Arachis hypogaea L.). At 7 and 14 days after sowing, 16S rDNA profiles of the eubacterial and ammoniaoxidizing communities from the rhizoplane and bulk soil were generated using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Community profiles were subjected to peak fitting analyses to quantify the DNA band position and intensities, after which these data were compared using correspondence and principal components analysis. The data showed that cropping system had a highly significant effect on community structure (p <0.005), irrespective of plant species or sampling time. Continuous cereal-soil grown plants had highly similar rhizoplane communities across crop species and sites, whereas communities from the rotation soil showed greater variability and clustered with respect to plant species. Analyses of the ammonia-oxidizing communities provided no evidence of any effects of plant species or management history on ammonia oxidizers in soil from Kaboli, but there were large shifts with respect to this group of bacteria in soils from Gaya. The results of these analyses show that crop rotation can cause significant shifts in rhizosphere bacterial communities.

Legume rotation effects on early growth and rhizosphere microbiology of sorghum in West African soils

Cereal yield increases in legume rotations on west African soils were the subject of much recent research aiming at the development of more productive cropping systems for the mainly subsistence-oriented agriculture in this region. However, little has been done to elucidate the possible contribution of soil microbiological factors to these rotation effects. Therefore a pot trial was conducted using legume rotation and continuous cereal soils each from one site in Burkina Faso and two sites in Togo where cropping system experiments had been conducted over 4 yrs. All soils were planted with seedlings of sorghum (Sorghum bicolor L. Moench). From 21 days after sowing onwards relative growth rates in rotation soils were higher than in the continuous cereal soils, resulting in between 69 and 500% higher shoot dry matter of rotation sorghum compared to sorghum growing in continuous cereal soils. Across sites rotation soils were characterized by higher pH, higher microbial N and a lower microbial biomass C/N ratio and, with the exception of one site, a higher fungal biomass in the rhizosphere. The bacterial and eukaryal community structure in the soil, assessed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), differed between sites. However, only at one site differed the bacterial and the eukaryal community structure in the rotation soil significantly from that in the continuous cereal soil. Although the results of this study confirmed the marked plantgrowth differences between sub-Saharan legume-rotation soils and their continuous cereal counterparts they also showed the difficulties to differentiate possible microbiological causes from their effects.

Magnetic interactions between transition metal impurities and clusters mediated by low-dimensional metallic hosts: A first principles theoretical investigation

The magnetic properties and interactions between transition metal (TM) impurities and clusters in low-dimensional metallic hosts are studied using a first principles theoretical method. In the first part of this work, the effect of magnetic order in 3d-5d systems is addressed from the perspective of its influence on the enhancement of the magnetic anisotropy energy (MAE). In the second part, the possibility of using external electric fields (EFs) to control the magnetic properties and interactions between nanoparticles deposited at noble metal surfaces is investigated. The influence of 3d composition and magnetic order on the spin polarization of the substrate and its consequences on the MAE are analyzed for the case of 3d impurities in one- and two-dimensional polarizable hosts. It is shown that the MAE and easy- axis of monoatomic free standing 3d-Pt wires is mainly determined by the atomic spin-orbit (SO) coupling contributions. The competition between ferromagnetic (FM) and antiferromagnetic (AF) order in FePtn wires is studied in detail for n=1-4 as a function of the relative position between Fe atoms. Our results show an oscillatory behavior of the magnetic polarization of Pt atoms as a function of their distance from the magnetic impurities, which can be correlated to a long-ranged magnetic coupling of the Fe atoms. Exceptionally large variations of the induced spin and orbital moments at the Pt atoms are found as a function of concentration and magnetic order. Along with a violation of the third Hund’s rule at the Fe sites, these variations result in a non trivial behavior of the MAE. In the case of TM impurities and dimers at the Cu(111), the effects of surface charging and applied EFs on the magnetic properties and substrate-mediated magnetic interactions have been investigated. The modifications of the surface electronic structure, impurity local moments and magnetic exchange coupling as a result of the EF-induced metallic screening and charge rearrangements are analysed. In a first study, the properties of surface substitutional Co and Fe impurities are investigated as a function of the external charge per surface atom q. At large inter-impurity distances the effective magnetic exchange coupling ∆E between impurities shows RKKY-like oscillations as a function of the distance which are not significantly affected by the considered values of q. For distances r < 10 Å, important modifications in the magnitude of ∆E, involving changes from FM to AF coupling, are found depending non-monotonously on the value and polarity of q. The interaction energies are analysed from a local perspective. In a second study, the interplay between external EF effects, internal magnetic order and substrate-mediated magnetic coupling has been investigated for Mn dimers on Cu(111). Our calculations show that EF (∼ 1eV/Å) can induce a switching from AF to FM ground-state magnetic order within single Mn dimers. The relative coupling between a pair of dimers also shows RKKY-like oscillations as a function of the inter-dimer distance. Their effective magnetic exchange interaction is found to depend significantly on the magnetic order within the Mn dimers and on their relative orientation on the surface. The dependence of the substrate-mediated interaction on the magnetic state of the dimers is qualitatively explained in terms of the differences in the scattering of surface electrons. At short inter-dimer distances, the ground-state configuration is determined by an interplay between exchange interactions and EF effects. These results demonstrate that external surface charging and applied EFs offer remarkable possibilities of manipulating the sign and strength of the magnetic coupling of surface supported nanoparticles.

Learning Three-Dimensional Shape Models for Sketch Recognition

Artifacts made by humans, such as items of furniture and houses, exhibit an enormous amount of variability in shape. In this paper, we concentrate on models of the shapes of objects that are made up of fixed collections of sub-parts whose dimensions and spatial arrangement exhibit variation. Our goals are: to learn these models from data and to use them for recognition. Our emphasis is on learning and recognition from three-dimensional data, to test the basic shape-modeling methodology. In this paper we also demonstrate how to use models learned in three dimensions for recognition of two-dimensional sketches of objects.

Polimorfismos del gen Butirilcolinesterasa responsables de reacciones adversas en pacientes consumidores de “cocaína”

La butirilcolinesterasa humana (BChE; EC 3.1.1.8) es una enzima polimórfica sintetizada en el hígado y en el tejido adiposo, ampliamente distribuida en el organismo y encargada de hidrolizar algunos ésteres de colina como la procaína, ésteres alifáticos como el ácido acetilsalicílico, fármacos como la metilprednisolona, el mivacurium y la succinilcolina y drogas de uso y/o abuso como la heroína y la cocaína. Es codificada por el gen BCHE (OMIM 177400), habiéndose identificado más de 100 variantes, algunas no estudiadas plenamente, además de la forma más frecuente, llamada usual o silvestre. Diferentes polimorfismos del gen BCHE se han relacionado con la síntesis de enzimas con niveles variados de actividad catalítica. Las bases moleculares de algunas de esas variantes genéticas han sido reportadas, entre las que se encuentra las variantes Atípica (A), fluoruro-resistente del tipo 1 y 2 (F-1 y F-2), silente (S), Kalow (K), James (J) y Hammersmith (H). En este estudio, en un grupo de pacientes se aplicó el instrumento validado Lifetime Severity Index for Cocaine Use Disorder (LSI-C) para evaluar la gravedad del consumo de “cocaína” a lo largo de la vida. Además, se determinaron Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs) en el gen BCHE conocidos como responsables de reacciones adversas en pacientes consumidores de “cocaína” mediante secuenciación del gen y se predijo el efecto delos SNPs sobre la función y la estructura de la proteína, mediante el uso de herramientas bio-informáticas. El instrumento LSI-C ofreció resultados en cuatro dimensiones: consumo a lo largo de la vida, consumo reciente, dependencia psicológica e intento de abandono del consumo. Los estudios de análisis molecular permitieron observar dos SNPs codificantes (cSNPs) no sinónimos en el 27.3% de la muestra, c.293A>G (p.Asp98Gly) y c.1699G>A (p.Ala567Thr), localizados en los exones 2 y 4, que corresponden, desde el punto de vista funcional, a la variante Atípica (A) [dbSNP: rs1799807] y a la variante Kalow (K) [dbSNP: rs1803274] de la enzima BChE, respectivamente. Los estudios de predicción In silico establecieron para el SNP p.Asp98Gly un carácter patogénico, mientras que para el SNP p.Ala567Thr, mostraron un comportamiento neutro. El análisis de los resultados permite proponer la existencia de una relación entre polimorfismos o variantes genéticas responsables de una baja actividad catalítica y/o baja concentración plasmática de la enzima BChE y algunas de las reacciones adversas ocurridas en pacientes consumidores de cocaína.

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

Detecció de la Ribonucleasa 1 anòmalament glicosilada en sèrums humans: possible ús com a marcador tumoral del càncer de pàncreas

L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes.