青蒿素生物合成相关基因对烟草遗传转化的研究

　　青蒿素是存在于中药青蒿(Artemisia annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物，是中国科学家研发出的当今最有潜力的抗疟药剂，较传统抗疟药很少或无毒副作用，因此青蒿素的生产备受人们关注。目前，青蒿素的生产主要以植物提取为主，但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低（约占干重的0.01%～0.8%），从而导致青蒿素价格昂贵，使许多贫困地区的疟疾患者无法得到医治，故提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源，降低生产青蒿素的成本具有重要的意义。　　 　　本论文基于扩大青蒿素的来源和提高青蒿植株中青蒿素含量的目的，开展了以下两方面的工作： 一、紫穗槐二烯在烟草中组合生物合成的研究 　　紫穗槐二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）是青蒿素生物合成的关键酶之一，为了能在烟草中合成青蒿素的前体，本研究将青蒿的紫穗槐二烯合酶基因置于CaMV 35S启动子控制下，通过根癌农杆菌介导转入烟草（Nicotiana tobacum L.），并获得了转ADS基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析表明，ADS基因已经整合到转基因烟草基因组中；RT-PCR及对转基因烟草中ADS酶活性和产物中紫穗槐二烯和植物甾醇的测定分析，进一步证明整合的ADS基因在转录、翻译水平上均已经表达。上述结果表明，利用基因工程将青蒿素生物合成途径的关键酶基因导入植物，转基因植物中能够合成青蒿素的前体，这一研究结果为利用转基因植物生产青蒿素或其前体奠定了基础。 二、青蒿鲨烯合酶双链干涉基因对烟草的遗传转化研究 　　鲨烯合酶（squalene synthase, SQS）是甾醇类生物合成分支途径的关键酶之一，利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)抑制目标基因表达的技术已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理，在与烟草SQS同源性高达80％的青蒿ASQS序列的5/端保守区选择622 bp作为构建RNAi的序列，借助中间克隆载体，经过三次亚克隆，最后形成含ASQS－RNAi表达盒的双元表达载体pART27－ASQS，并转入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法，共获得了12棵转基因植株。转基因植株经过PCR和PCR-Southern blotting 检测，证实外源ASQS基因已经导入烟草中，并已经成功整合到烟草基因组中；通过RT-PCR分析说明，转基因烟草中SQS基因的表达已被成功抑制，部分转基因植株中内源SQS的干扰效果高达90％以上。对SQS的直接产物鲨烯和最终产物植物甾醇的检测显示，转基因烟草的植物甾醇和鲨烯的含量明显低于对照。本实验的结果为下一步将此RNA干扰载体导入青蒿，抑制青蒿中ASQS基因的表达，从而提高青蒿素的含量提供了可能。

野生稻OrbHLH2基因的克隆及功能分析

　　bHLH（basic/helix-loop-helix）型的蛋白作为转录因子中的一个家族，控制一系列的生物学过程，例如细胞分化、细胞命运决定等。该家族的共同特点是具有一个bHLH型保守结构域，大约由60个氨基酸组成，在功能上划分为给两个部分：N端的碱性区域和C端的HLH区域，前者具有结合DNA的功能，后者参与了蛋白的二聚化，主要由疏水氨基酸组成。水稻中大多数的bHLH转录因子其功能还不清楚。 　　本论文利用同源克隆的方法，从水稻中得到与拟南芥ICE1同源性最高的基因，并命名为OsbHLH2，然后我们从野生稻中克隆到相关基因OrbHLH2。OrbHLH2 的cDNA全长为1961 bp，编码525个氨基酸。OrbHLH2与拟南芥、荠菜、毛果杨中推测的类ICE1蛋白之间的同源性分别达到46.1%、 45%、 41.2%，推测OrbHLH2可能是一个类ICE1蛋白。亚细胞定位实验结果表明，OrbHLH2定位于细胞核中；酵母自激活实验表明OrbHLH2具有自激活活性，因此推断OrbHLH2可能是一个转录因子。在水稻中对其组织表达模式进行分析发现，OsbHLH2在幼根、老根、幼茎、老茎、幼叶、老叶等组织中表达量极低，而在穗部的表达量很高，这暗示了OrbHLH2可能在水稻发育的特定阶段起重要作用；分析OsbHLH2对各种胁迫的响应，发现该基因在水稻中的表达不受低温、高盐、ABA等胁迫的诱导。 　　将OrbHLH2在拟南芥中异源超表达，转基因材料在发育上没有发现明显的表型改变。分析转基因拟南芥对不同胁迫的耐受性，结果表明：转基因拟南芥对高盐、渗透胁迫的抗性明显增强；分析一些抗逆标记基因的表达水平，发现与转基因拟南芥在高盐条件下DREB1A/CBF3、RD29A、COR15A和KIN1的表达量有不同程度的上调，暗示了在胁迫条件下OrbHLH2可能通过对DREB1A/CBF3途径中的基因的激活，来启动植物对逆境胁迫的响应，从而提高植物的抗逆性。该结果对于提高农作物的抗逆性具有潜在的应用价值。

拟南芥砷酸还原酶基因AtACR2的表达调控及其功能分析

将砷酸盐还原为亚砷酸盐是植物砷代谢途径中的关键步骤，其中砷酸还原酶是催化砷酸盐还原的关键酶。目前，对植物中砷酸还原酶基因的表达调控机制及该基因的功能了解得还不是很清楚。因此研究拟南芥砷酸还原酶基因的表达调控及其功能对于探讨植物对砷吸收、代谢、转运和富集的分子机制有重要意义。 本论文利用拟南芥砷酸还原酶基因（AtACR2）的启动表达调控序列的不同组合驱动GUS基因转录表达，对AtACR2启动表达调控序列的功能进行了分析；同时利用过表达、AtACR2基因T-DNA插入缺失突变体和地上部特异表达对拟南芥和蜈蚣草砷酸还原酶的基因功能进行了初步分析，主要结果如下： 1．对拟南芥AtACR2基因在不同砷酸盐处理浓度(0、100 yM、200 yM) 下的RT-PCR分析初步表明：在未用Na3As04处理的拟南芥幼苗中，AtACR2基因在根和茎叶中均有表达，且其在根中的转录水平高于茎叶中。同时该基因的表达在转录水平上受砷酸盐的负调控，即随着外界砷酸盐浓度的升高，AtACR2基因的转录水平降低。 2．将AtACR2基因不同启动调控序列组合驱动GUS基因转录表达，结果表 明：①由AtACR2基因上游1250 bp及其5’端非编码医构成的启动调控序列不足以启动AtACR2基因的转录表达和砷酸盐胁迫的应答；②在第一外显子和第一内含子中存在启动AtACR2基因起始转录表达的关键序列元件，它们的存在决定了该基因能否得以转录表达；⑧第一外显子和第一内含子序列中不仅存在起始基因转录的必需元件，还存在砷胁迫相关的应答元件，参与砷酸盐抑制AtACR2基因的转录表达调控；④在第二外显子和第二内含子中可能存在增强基因表达的调控元件序列，进一步影响该基因转录表达强度的调控。 3． 拟南芥AtA CR2基因和砷超富集植物蜈蚣草PvA CR2基因在拟南芥中过表达后的功能分析初步表明：①转基因植株能够通过减少体内As含量增强对砷酸盐的抗性；②两种植物的砷酸还原酶作用能力存在一定差异，其中超表达蜈蚣草PvA CR2能够使转基因植株根中As含量更少，但其对砷酸盐胁迫的抗性并没有AtACR2超表达植株强，这可能与转 PvA CR2基因植株地上部积累相对较高的砷含量有关。 4．将AtA CR2和PvA CR2在拟南芥中地上部特异表达后，抗性实验初步表明：①以野生型拟南芥为背景材料进行地上部特异超表达AtACR2或PvA CR2基因，不能增强转基因植株对砷酸盐抗性；②以AtA CR2基因的T-DNA插入缺失突变体为背景材料地上部特异表达AtACR2或PvA CR2基因，却能够明显增强转基因植株对砷酸盐的抗性。综上所述，植物砷酸还原酶基因在植物对砷酸盐胁迫的响应和调控中起着重要作用。

中药青蒿紫穗槐二烯合酶基因表达及调控的研究

青蒿素是从我国传统药用植物中药青蒿（Artemisia annua L.）中提取的新型抗疟特效药，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。目前，青蒿素生物合成的组织部位及其调控机制仍不完全清楚。紫穗槐二烯合酶（amorpha-4， 11-diene synthase, ADS）作为青蒿素生物合成分支途径的第一个关键酶，催化倍半萜化合物的通用前体法呢基焦磷酸环化，生成紫穗槐二烯。本论文通过对ADS 表达特性的分析，研究了青蒿素生物合成的组织特异性及其调控机制，主要研究结果如下： 一．紫穗槐二烯合酶基因启动子功能的研究 从青蒿高产株系001 中克隆得到了2850 bp 的ADS 启动子调控区。通过比较5’RACE 的测序结果与启动子序列，确定转录起始位点位于翻译起始位点上游44 bp，TATA 盒下游27 bp。该启动子序列包含的顺式作用元件有脱落酸应答元件(ABRE )、乙烯应答元件(ERE)、生长素应答元件(AUXRE）等植物激素反应元件，以及低温应答元件（LTRE）、高温应答元件（HSE）等与逆境有关的反应元件，还有与真菌诱导有关的W-box 元件等。将不同长度ADS 启动子与报告基因GUS 融合，构建了植物表达载体，通过农杆菌介导的方法获得稳定整合的转基因烟草。经过组织化学、GUS 荧光活性检测及RT-PCR 分析，发现该启动子的转录活性很低，无法通过GUS 染色进行观察。GUS 荧光活性检测及RT-PCR 结果表明，转录起始位点上游346 bp 是ADS 基础表达所必需的。高温、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸甲酯等处理均能促进青蒿中ADS 的表达，而脱落酸和乙烯的作用效果较小，与启动子序列分析的结果并不完全一致。 二．紫穗槐二烯合酶基因表达特性的研究 以青蒿高产株系001 为材料，在基因和蛋白水平揭示了ADS 的表达特性。RT-PCR 和Western 分析结果表明，ADS 在幼叶和花蕾中大量表达，在老叶和完全开放的花中表达量很低，而在青蒿的根和茎中几乎检测不到ADS 的表达。石蜡切片和整体原位杂交的结果表明，ADS 在顶端分生组织、叶原基及分泌腺毛中表达，在非分泌的T 型腺毛中不表达。当叶片完全展开后，ADS 只在分泌腺毛中表达，而且随着叶片的生长和老化，ADS 的表达量逐渐减少。另一个非常有趣的发现是同一叶片上的分泌腺毛，有些有ADS 的表达，有些则没有。用强光、低温、高温和水杨酸等因素处理后，有ADS 表达的分泌腺毛的比例没有明显的变化。 三．外源水杨酸促进青蒿素的生物合成 研究了外源水杨酸对青蒿素生物合成的影响，结果表明：1 mM 水杨酸处理后，青蒿叶片中的游离态水杨酸含量快速增加，处理后4 h 达到 0.79 μg g-1 FW，是对照的3.5 倍。外源水杨酸能够抑制青蒿中过氧化氢酶活性，提高抗坏血酸过氧化物酶活性，并通过对抗氧化酶活性的抑制引起青蒿体内活性氧水平的迅速升高。在处理后4 h，青蒿中H2O2 和O2-的含量分别达到对照的2.1 倍和2.4 倍。青蒿素含量在水杨酸处理后的前8 h 缓慢升高，随后升高的速度增加。外源水杨酸处理后8 h 和96 h，青蒿素含量分别达到9.1 mg g-1DW 和13.9 mg g-1DW，比对照高21.7%和75.8%。处理后8 h，青蒿酸的含量没有明显变化，随后开始增加。处理后16 h，青蒿酸的含量达到3.6 mg g-1DW，比对照高90%， 随后继续升高，至96 h 达到4.98 mg g-1 DW，比对照高127%。二氢青蒿酸的含量在处理后的8 h 内有所下降，随后缓慢升高。处理后8 h，二氢青蒿酸的含量降低了23.3%，随后二氢青蒿酸的含量开始升高，在处理后96 h，达到7.4 mg g-1DW，比对照高72.1%。外源SA 处理提高了青蒿素及其前体的总含量，在处理后1、2、4 天分别比对照提高了1.3、1.5 和1.8 倍。Northern 结果表明，水杨酸强烈诱导了青蒿素生物合成基因HMGR、ADS 的表达，但是对FPS、CYP71AV1 的诱导作用较小。这些研究结果表明，外源水杨酸至少通过两条途径诱导青蒿素的生物合成：一是通过诱导活性氧的产生促进二氢青蒿酸向青蒿素的转化；二是上调部分青蒿素生物合成相关基因的表达。根据这一研究成果，在青蒿田间栽培中，可以在收获前通过喷施水杨酸来快速、有效和低成本地提高青蒿素产量。

水稻OsGSR1调控赤霉素和油菜素内酯信号互作的分子机理研究

赤霉素（gibberellins，GAs）和油菜甾醇（brassinosteroids，BRs）在细胞伸长和植株形态建成等方面发挥重要的生理作用，但它们在分子水平上的相互作用仍然未知。在本实验室前期的芯片工作中筛选到受GA诱导表达的GAST家族基因OsGSR1(GA-stimulated gene in rice) (GenBank AY604180)。该基因全长cDNA为588 bp，编码110个氨基酸，OsGSR1具有GAST家族成员的共同特点。OsGSR1基因的表达受GA3诱导，同时受PAC抑制。基因表达模式分析表明OsGSR1在水稻的根、茎、幼穗和小花等多种组织和器官中表达。前期工作已获得转基因水稻。 本论文研究表明，OsGSR1 RNAi转基因水稻表现为初生根缩短、叶片直立、节间缩短和结实率降低等与GA和BR相关的表型。OsGSR1 RNAi转基因水稻对外源GA3敏感性降低，Real-time PCR分析表明在OsGSR1 RNAi转基因水稻中OsGA20ox2和SLR1的转录水平增高，GC-MS分析显示内源GA4含量增高，这些结果说明转基因材料中GA信号削弱。因此，OsGSR1是GA信号途径的正调控因子。另一方面，实验证据表明，外源BL处理可以抑制OsGSR1基因的表达，OsGSR1 RNAi转基因水稻不但可以响应外源BL处理，并且在叶夹角实验中显现出对外源BL更加敏感的特性。在OsGSR1 RNAi转基因水稻中，BR受体基因OsBRI1与合成基因OsDWARF表达量上调。外源添加BL可以恢复OsGSR1 RNAi转基因水稻矮化表型，上述结果说明OsGSR1可能作用于BR生物合成途径。酵母双杂交筛选、体外Pull-down结果和体内BiFC实验都证实OsGSR1可以与DIM/DWF1互作。在BR生物合成途径中，DIM/DWF1催化从24-亚甲基固醇（24-methylenecholesterol）到油菜甾醇（campesterol）的转化。GC-MS测定内源BRs含量结果进一步证实，转基因水稻中DIM/DWF1催化反应产物积累量减少，说明该反应受到明显抑制。所以，OsGSR1是通过直接作用于BR合成酶来调控BR生物合成。 综上所述，OsGSR1是GA信号途径的正调控因子，并且OsGSR1通过调节SLR1的表达参与到GA信号转导途径。OsGSR1和DIM/DWF1的互作说明OsGSR1直接参与了BR的生物合成过程。因此，我们的实验证明OsGSR1介导了GA和BR这两条激素信号转导途径的相互作用，从而调节了水稻植株的生长发育。

Radiocarbon record of solar variability and Holocene climatic change in coastal southern California

EXTRACT (SEE PDF FOR FULL ABSTRACT): Pollen analysis and 5 radiocarbon dates for a 687-cm core provide a detailed chronology of environmental change for San Joaquin Marsh at the head of Newport Bay, Orange County, California. Sediment deposition kept pace with sea level rise during the mid-Holocene, but after 4500 years BP, sea water regularly reached the coring site, and salt marsh was the local vegetation. Brief periods of dominance by fresh-water vegetation 3800, 2800, 2300 and after 560 years BP correlate global cooling events and (except the 3800-year BP event) with carbon-14 production anomalies. The coincidence of climate change and carbon-14 anomalies support a causal connection with solar variability, but regardless of the causal mechanism(s) the delta-carbon-14 curves provide a chronology for global, high-frequency climatic change comparable to that of Milankovitch cyclicity for longer time scales.

Population dynamics and stock assessment of Koth (Otolithoides biauritus Cantor, 1850) along the north-west coast of India

MSY, growth, selection and mortality parameters of Otolithoides biauritus have been worked out from data collected by MFV Saraswati of CIFE, and length frequency data from Ferry Wharf, Sasson dock, and Versova fish landing centres of Bombay. Values of L infinity, K, and t omicron obtained from length frequency study are 1572 mm, 0.2633/yr and 0.0289 yr respectively, and of weight growth parameters are W infinity = 10067 g, K = 0.03904/yr and t omicron = 0.0137 yr. Selection parameters are L + 150 mm, t sub(r) + 0.4167 yr lc + 240 mm and t omicron = 0.6367 yr. Selection factor (K) for codent worked out to be 12. Based on Z = 0.6486, the MSY of O. biauritus off northwest coast of India is assessed as 1,802 tons which is slightly higher than the current catch level of 1,634 tons.

酵母拮抗菌和外源水杨酸对核果类果实抗病相关基因的诱导表达

在果实采后贮藏过程中，病原真菌的侵染会引起果实腐烂，造成巨大的经济损失。利用生物和非生物因子诱导果实抗病性，已经成为采后病害防治领域的一个研究热点。本文主要利用RT-PCR和RACE技术克隆果实抗病相关基因，通过分子杂交和蛋白羰基化免疫检测技术，研究了外源SA和酵母拮抗菌诱导果实抗病性机理，结果表明： 1. 通过优化RNA提取方法，能从含有多糖的冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实中提取到质量较好的RNA，用于RT-PCR和Northern杂交。 2. 采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃果实克隆了两个抗氧化相关基因CAT2（Genbank：EF165590）和GPX（Genbank：EF165591）和两个PR基因GLU-1（Genbank：EF177487）和GLU-3（Genbank：EF177488)。其中CAT2全长cDNA序列为1479 bp，编码492个氨基酸；GPX全长cDNA序列为513 bp，编码170个氨基酸；GLU-1全长cDNA序列为1050 bp，编码349个氨基酸；GLU-3部分cDNA序列为454 bp，编码141个氨基酸。 3. 酵母拮抗菌Pichia membranaefaciens处理不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低果实贮藏期间青霉病（Penicillium expansum）的发生，并且对低成熟度果实的病害防治效果更为明显。酵母拮抗菌的抑病机理与减轻了甜樱桃果实蛋白羰基化程度，诱导了果实抗氧化酶基因（CAT和GPX）和PR基因（GLU-1）的表达和提高了抗氧化酶（CAT和GPX）和β-1,3-葡聚糖酶的活性有关。 4. 四种酵母拮抗菌P. membranaefaciens, Cryptococcus laurentii, Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis处理桃果实，可显著降低贮藏期间的褐腐病（Monilinia fructicola）。这是由于酵母拮抗菌能抑制病原菌侵染造成的氧化胁迫和蛋白羰基化。此外，酵母拮抗菌处理还能显著诱导CAT、POD、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性及相应基因的表达。 5. 水杨酸（SA，2 mM）处理采后不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低青霉病的危害。其抑病机理与SA处理能减轻P. expansum侵染引起的果实蛋白羰基化程度，显著提高CAT、GPX和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达和相关的酶的活性有关。而2 mM的SA处理对P. expansum的生长没有直接抑制作用。 6. 水杨酸（SA，2 mM）与P. membranaefaciens（1×108 CFU/ml）配合处理能显著降低低温贮藏期间桃果实的褐腐病，并能提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和POD的活性和相关基因的表达。另外，2 mM的SA对拮抗菌P. membranaefaciens的生长没有影响，但能够抑制病原菌M. fructicola的孢子萌发和菌丝扩展。

Note on the size groups of prawns landed by shrimp trawls of four different cod end meshes

A study on the different size groups of prawns caught by four shrimp trawls having different cod-end meshes was made by the author. The results indicate that small sized prawns of mean length 77.15 mm were captured by the net having 23.38 mm cod-end at 5-6 fathoms depth, medium prawns of mean length 105.22 mm was caught in 25.21 mm and 19.88 mm cod-end at 8 fathoms depth and big sized prawns of mean length 117.98 mm were caught in 21.29 mm cod-end. Further the relation of length on breadth of prawn is worked out to be : Bp=0.15 Lp - 1.50 where Bp and Lp are breadth and length respectively.

玉米 rbcL 基因与兰藻 rbcS 基因定向融合及它们在宿主大肠杆菌中的表达

二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(简称Rubisco, EC, 4.1.1.39)是绿色植物光合作用中参与固定CO2的关键酶。在高等植物，该酶是由8个分子量为55KD的大亚基(LSU)和8个分子量为14KD的小亚基(SSU)构成的16聚体。每个大亚基有四个活性中心，具有双向催化功能，其编码基因位于叶绿体基因组大单拷贝区;小亚基功能还不清楚，它由核基因组编码且有几个拷贝;未成熟小亚基N端有一段transit peptide，靠它的定向跨越叶绿体膜。迄今为止，取自几种植物材料的这二种亚基的氨基酸顺序和编码基因的核苷酸顺序分析业已完成。为该酶的遗传操作奠定了必要的基础。 由于Rubisco与人类利用太阳能和提高作物产量直接相关，所以成为通过生物技术进行改造的重大项目。 巢状假囊细菌(Anacyslis nidulans) R2是一种不含限制性内切酶的单细胞原核生物，能营光合作用，其Rubisco大亚基的氨基酸顺序与玉米的LSU同源性高达80%，但是第四个活性部位(Leu 456位)与玉米不同(Sys, 459位)，由此导致其对CO2的亲合力降低。另一方面，其rbcL与rbcS仅相隔93个bp，且同属一个操纵子。这意味着有可能用同源DNA片段等位交换的办法来改造其rbcL基因。 根据现有的资料，设计出玉米rbcL与兰藻rbcS定向重组于pUC119的兰图：先从pANP1155中切出0.7kb含蓝藻rbcS的PstI-HindIII片段，克隆进pUC119的lacZ启动子下游得pTAS28，采用Reverse primer作引物进行核苷酸顺序分析，确认蓝藻rbcS基因座落在pTAS28正链上。随后从pZmc460中切出包含玉米rbcL基因1.7kb的BglII-HincII片段，将它插入pTAS28的HincⅡ-BamHⅠ双酶切位点，得到pTMN3;为了比较，在另一个质粒pTMN7于1.7kb片段之前加进0.1kb的PstI-HaeIII蓝藻DNA。根据玉米rbcL基因核苷酸顺序（1218-1251）合成一个Oligonucleotide probe，对这三个质粒的总RNA抽提物进行Northern Blot，得到明显的杂交斑点;接着用菌体总蛋白冻干品进行了Western分析，并以新鲜的玉米和烟草叶片为对照，得到阳性结果。显然这二种基因重组之后仍能在宿主E. coli中正常表达。 真正的挑战应是下一步用上述二种质粒转化兰藻A. nidulans R2，考查其能否整合进基因组并表现出较低的氧化酶活性。

豌豆Lhcb2 基因的克隆、表达、功能分析及其克隆化蛋白与色素体外重组系统的建立

Lhcb2基因是LHCII基因家族中的一个重要成员。目前，对于其特性、结构和功能还不清楚。本文对豌豆Lhcb2基因的克隆、表达、功能及其在大肠杆菌中的表达产物与色素在体外的重组进行了比较系统的探讨，主要的结果如下： 1．采用RT-PCR技术，从豌豆幼叶中克隆了一个约800 bp的Lhcb2 cDNA。以特异探针进行Southern杂交的结果初步证明，Lhcb2基因以单拷贝形式存在于豌豆基因组中，这在文献中尚未见报道。 2．不同光照时间和温度对豌豆幼苗进行处理的RT-PCR，Northem blotting分析表明，Lhcb2基因转录水平上的表达受光照的控制，且明显地表现出对光照时间的依赖性。用400 μmolm-2.s-1的白光照射0～1.5小时Lhcb2基因未见表达，而在光照2小时以上则大量表达，推测该基因的表达可能要求某种(或某些)需光中间物的合成和积累。温度对Lhcb2基因的表达亦有显著的影响，相同的光照处理，4 ℃下Lhcb2基因的表达量比25℃下的表达量低一倍左右。 3．将豌豆Lhcb2基因反向插入植物表达载体pBIl21中，构建CaMV 35S启动子控制下反义Lhcb2基因的植物表达载体pBIantiLhcb2，通过农杆菌LBA4404介导，在Kan浓度为100 mg／L的筛选培养基上，获得120个抗Kan阳性植株。PCR检测表明至少有80个抗性植株为PCR阳性反应。Southern blotting分析表明，外源反义Lhcb2基因已整合到烟草基因组中。转基因植株在表型上主要表现为三大类型：叶色类似于未转基因的绿色植株、叶色发黄的植株、叶色发白甚至枯死的植株。这几类转基因植株光谱特性的分析表明，Lhcb2基因不仅影响光能的捕获，而且还可能参与激发能分配的调节作用。 4．将豌豆的Lhcb2基因亚克隆至原核表达载体pET-3d上，通过定点突变使其在大肠杆菌BL2l(DE3)中得到高效表达，其表达量约占大肠杆菌总蛋白的40％，并经纯化后获得了电泳纯的Lhcb2蛋白。应用改进的液氮／室温冻融重组方法将纯化的蛋白与色素进行体外重组，建立了高效的重组系统。实验结果表明重组后所获得的LHCB2单体与用生化方法从菠菜类囊体膜中分离纯化的天然LHC II单体相比较，其在部分变性胶的电泳行为，低温荧光发射光谱和激发光谱，以及室温吸收光谱和CD光谱的特征等方面都非常相似，说明大量表达的Lhcb2蛋白与色素已成功地重组，并具有与天然的LHCII单体相类似的组成和结构，这在国际上尚属首次。在此基础上又构建了N端和C端氨基酸残基缺失的突变体，并对这些缺失的氨基酸残基在LHCB2中的可能作用进行了初步的研究。结果表明，N端的前12个氨基酸残基、C端的前10个氨基酸残基和第11位的色氨基酸残基对LHCB2单体的形成不是必需的。 此外，从菠菜中纯化了LHCII，并对其多肽和色素组成及其光谱特性进行了比较系统的研究。同时对用不同浓度OGP和Mg2+处理所获得的不同聚集程度的LHCII的光谱特性进行了研究，并对Mg2+在其中的可能作用进行了初步的探讨。

转Rubisco 活化酶大型同工酶基因(rca)水稻的光合作用特性研究

Rubisco 是催化光合暗反应第一步反应的酶，是唯一能将CO2 转变成碳水化合物的酶，由它固定和最后转化成的碳水化合物提供了植物、动物和微生物的食物和能量。但是，Rubisco 催化该反应的效率十分低，使之成为光合作用的限速步骤。由于Rubisco 的合成和催化过程十分复杂，人们很难通过直接改造Rubisco 提高植物固定CO2 的能力。而Rubisco 活化酶能活化Rubisco，使植物在生理CO2 浓度下具有最大的CO2 同化速率，因此研究活化酶有重要意义。水稻活化酶有2 个同工酶，大型同工酶比小型同工酶C 端多37 个氨基酸，其中包括两个Cys 残基。这两个Cys 残基的存在使活化酶大型同工酶对ADP 的存在更加敏感，其活性在硫氧还蛋白的介导下能被基质中氧化还原状态的变化所调节。由于活化酶大型同工酶对调节Rubisco 的活性具有的这种特殊作用，在本研究中，将活化酶大型同工酶rca基因用正义和反义引入水稻基因组，获得了过量表达活化酶大型同工酶基因和反义抑制活化酶基因表达的转基因植株，对其光合作用进行了生理和生化分析。 本研究的主要结果如下： Rubisco 活化酶大型同工酶基因的克隆：从水稻镇恢249 中克隆了1525 bp 的活化酶大型同工酶cDNA 序列。经过测序，它与报道的粳稻品种活化酶大型同工酶cDNA 序列（rca）完全相同。 构建了4 个植物表达载体：3 个为过量表达rca的载体，分别是pCBUbirca，pCBSrca 和 pCBSUbirca ，其中rca分别在水稻中高效表达的玉米Ubiquitin 启动子、受光调控的Rubisco 小亚基基因启动子和由这两个启动子构成的双启动子控制下表达; 1 个在Ubiquitin 启动子控制的反义rca载体，即 pCBUbi-antirca。 获得了转化rca的水稻再生植株：用日本晴，台北309，武育梗7 号和籼稻品种培矮64S 水稻成熟种子诱导愈伤组织。用改良的农杆菌浸染法将rca基因转化这些愈伤组织，在潮霉素筛选压力下获得抗性愈伤组织，经过2 天的干燥处理后，转入到含山梨醇的高渗分化培养基上培养，能迅速获得大量的芽和转化体再生植株。 获得了转rca基因的水稻植株：抗性愈伤组织和再生水稻幼苗的叶片经GUS 染色呈蓝黑色。PCR 扩增转基因水稻基因组内的潮霉素基因和rca，大部分转基因水稻中含有841 bp 的潮霉素基因片段和1525 bp 长的rca cDNA 片段。251 粒T1 代转基因水稻种子中189粒呈现潮霉素抗性，抗性种子/非抗性种子的比率约为3：1，接近孟德尔分离规律。Southern杂交表明rca序列已整合到水稻基因组，一般含1－2个拷贝。Western 杂交显示Rubisco 活化酶含量在转pCBUbi －antirca 的水稻中和对照比，几乎看不出，被反义抑制;转pCBUbirca 的水稻与对照含量相差无几;转pCBSUbirca，pCBSrca 载体的水稻中活化酶的含量比对照有极显著的增加。 T1 代转rca水稻的光合作用发生显著变化：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻在饱和光强下的Rubisco 初始活性、羧化效率、光合速率都明显高于对照，但是表观量子效率、色素含量和Rubisco 总活性与对照相似。两者相比，前者比后者更高;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻饱和光强下的光合速率、表观量子效率、羧化效率、Rubisco 初始活性明显降低，色素含量和Rubisco 总活性基本不变;转pCBUbirca 的水稻中，光合作用的各项参数与对照基本相似。 T1 代转rca水稻的叶绿素荧光明显改变：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻ΦPSII 的值明显高于对照，而且前者qP 的值明显高于对照。两者相比，前者的ΦPSII 和qP 的值比后者高;转反义rca的水稻ΦPSII，F′v/F′m，qP 值和对照比都明显降低，但qN 的值升高;转pCBUbirca 载体的水稻中，叶绿素荧光的各项参数与对照基本相似。 转rca基因的水稻生长发育的变化：转pCBUbirca 载体的水稻整个生长发育过程与对照相似;转化pCBSrca 和pCBSUbirca 载体的水稻和对照比，植株高大，生长发育速度加快，抽穗、开花和结籽的时间提前。两者本身相比，前者比后者明显;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻生长发育延迟，植株矮小，种子败育。 由上可见，Rubisco 活化酶大型同工酶rca基因在Rubisco 小亚基基因启动子、Ubiquitin 基因启动子和Rubisco 小亚基基因启动子共同控制下正义转入水稻的转基因植物光合作用的参数最好，光合效率提高，植物表型最好，生长发育加快，提前开花结籽。这一研究可能为获得高光合效率和高产量的水稻奠定了基础。