Caractérisation de l’ADNc et de l’ADN génomique codant l’intégrine plaquettaire αIIb‐β3 chez un cheval atteint de Thrombasthénie de Glanzmann

La thrombasthénie de Glanzmann (TG) est une maladie caractérisée par un défaut d’agrégation plaquettaire. C’est une maladie génétique autosomale récessive causée par une anomalie du récepteur plaquettaire pour le fibrinogène. Ce récepteur est une intégrine localisée à la surface plasmatique qui est formée par un complexe composé des sous‐unités αIIb et β3. Nous avons identifié un cheval démontrant les caractéristiques clinicopathologiques de la TG. Des études par cytométrie de flux ont révélé une déficience au niveau de la portion αIIb du récepteur. Ces résultats suggèrent une ou plusieurs mutations au niveau du gène codant pour cette portion αIIb du récepteur. L’objectif de notre étude était de caractériser l’ADNc et l’ADN génomique codant pour les gènes ITGA2B et ITGB3 codant respectivement pour les deux sous‐unités αIIb et β3 chez un cheval atteint de la TG. L’ADNc a été synthétisé par RT‐PCR en utilisant l’ARN total récolté à partir des plaquettes. L’ADN génomique a été extrait à partir des globules blancs. Des amorces spécifiques ont été utilisées pour l’amplification par PCR d’ITGA2B et d’ITGB3. Les séquences d’ADNc et d’ADN génomique de notre patient ont été caractérisées par séquençage et comparées par l’analyse BLAST (GenBank). Une substitution d’une guanine par une cytosine a été mise en évidence au niveau de l’exon 2 d’ITGA2B amenant à la substitution d’une arginine (Arg72) par une proline (Pro72). Ce changement d’acide aminé pourrait résulter en une conformation structurelle anormale qui amènerait à une sous‐unité αIIb inactive. L’analyse de l’ADN génomique a démontré que ce cheval était homozygote pour cette mutation. Le séquençage de l’ADN génomique des parents et de la grand‐mère du patient a démontré que ces individus étaient hétérozygotes pour cette mutation. Le séquençage d’ITGB3 n’a démontré aucune anomalie.

Caractérisation de la fonction des complexes histone déacétylases Rpd3S et Set3C

La chromatine est essentielle au maintien de l’intégrité du génome, mais, ironiquement, constitue l’obstacle principal à la transcription des gènes. Plusieurs mécanismes ont été développés par la cellule pour pallier ce problème, dont l’acétylation des histones composant les nucléosomes. Cette acétylation, catalysée par des histones acétyl transférases (HATs), permet de réduire la force de l’interaction entre les nucléosomes et l’ADN, ce qui permet à la machinerie transcriptionnelle de faire son travail. Toutefois, on ne peut laisser la chromatine dans cet état permissif sans conséquence néfaste. Les histone déacétylases (HDACs) catalysent le clivage du groupement acétyle pour permettre à la chromatine de retrouver une conformation compacte. Cette thèse se penche sur la caractérisation de la fonction et du mécanisme de recrutement des complexes HDACs Rpd3S et Set3C. Le complexe Rpd3S est recruté aux régions transcrites par une interaction avec le domaine C-terminal hyperphosphorylé de Rpb1, une sous-unité de l’ARN polymérase II. Toutefois, le facteur d’élongation DSIF joue un rôle dans la régulation de cette association en limitant le recrutement de Rpd3S aux régions transcrites. L’activité HDAC de Rpd3S, quant à elle, dépend de la méthylation du résidu H3K36 par l’histone méthyltransférase Set2. La fonction du complexe Set3C n’est pas clairement définie. Ce complexe est recruté à la plupart de ses cibles par l’interaction entre le domaine PHD de Set3 et le résidu H3K4 di- ou triméthylé. Un mécanisme indépendant de cette méthylation, possiblement le même que pour Rpd3S, régit toutefois l’association de Set3C aux régions codantes des gènes les plus transcrits. La majorité de ces résultats ont été obtenus par la technique d’immunoprécipitation de la chromatine couplée aux biopuces (ChIP-chip). Le protocole technique et le design expérimental de ce type d’expérience fera aussi l’objet d’une discussion approfondie.

Caractérisation de DKK1 comme antigène tumoral et manipulation des lymphocytes T CD8 : utilisation de la voie de Wnt en immunothérapie du cancer

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie.

Caractérisation de l’infection naturelle à Cryptosporidium spp. chez le chien et le chat vus en établissement vétérinaire

Cryptosporidium spp. est un protozoaire parasite du système gastro-intestinal largement répandu chez les vertébrés et causant la cryptosporidiose, une zoonose occasionnant des troubles digestifs sévères pouvant entrainer la mort chez les individus immunodéficients. Au Canada, la déclaration de cette maladie est obligatoire depuis l’an 2000. Ainsi, il est pertinent de mieux comprendre l’infection chez les animaux de compagnie, puisqu’ils sont potentiellement un réservoir du parasite. Durant l’année 2008, des échantillons fécaux provenant de 1 202 chats (n = 371) et chiens (n = 831) de la province du Québec ont été analysés par comptage des ookystes de Cryptosporidium spp. au moyen de la technique de centrifugation en solution de sulfate de zinc. Dans cette étude,la prévalence de Cryptosporidium spp. chez les chats (28/371 : 7,55 %) et chez les chiens(88/831 : 10,59 %) de compagnie confirme leur potentiel en tant que réservoir du parasite. Au Québec, de par leur nombre, les chats sont potentiellement un réservoir zoonotique du parasite plus important que celui des chiens, bien qu’il n’existe pas de différence significative entre la prévalence du parasite chez le chat et le chien pour l’année 2008. L’âge (p = 0,0001) et l’infection concomitante par Giardia spp. (p = 0,0001) se sont avérés être des facteurs associés avec la présence de Cryptosporidium spp. chez le chien. Parmi l’ensemble des variables testées chez le chat (l’âge, le sexe, la saison et l’infection concomitante par Giardia spp.), aucune n’a été associée de manière significative à la présence du parasite chez le chat. Ceci peut être dû au nombre limité d’individus testés pour cette espèce. Un suivi de l’excrétion des ookystes de Cryptosporidium spp. chez deux chats suggère que l’excrétion des ookystes peut se faire sur une période de sept mois et que le taux d’excrétion varie dans le temps. Le diagnostic moléculaire des espèces et génotypes de Cryptosporidium spp. isolés à partir des échantillons de matières fécales devait être réalisé par la technique de PCR emboîtée des fragments des gènes ARNr 18S et HSP70 et du séquençage des produits de PCR. Aucun résultat positif n’a toutefois été obtenu. Afin d’augmenter la puissance statistique des analyses épidémiologiques sur la prévalence de Cryptosporidium spp., il serait nécessaire à l’avenir de travailler sur un nombre d’animaux beaucoup plus important.

Caractérisation de l’ubiquitin-fold modifier (UFM1) dans un modèle C. elegans

L’ubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protéine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont très peu d’homologie de séquence, mais partagent des similarités remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme l’Ub et la majorité des autres Ubls, UFM1 se lie de façon covalente à ses substrats par l’intermédiaire d’une cascade enzymatique. Il est de plus en plus fréquemment rapporté que les protéines Ubls sont impliquées dans des maladies humaines. Le gène Ufm1 est surexprimé chez des souris de type MCP développant une ischémie myocardique et dans les îlots de Langerhans de patients atteints du diabète de type 2. UFM1 et ses enzymes spécifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservés chez les métazoaires et les plantes suggérant un rôle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modèle animal le plus simple utilisé en biologie. Sa morphologie, ses phénotypes visibles et ses lignées cellulaires ont été décrits de façon détaillée. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gènes sur la longévité. Ce modèle nous permet de facilement manipuler l’expression du gène Ufm1 et de mieux connaître ses fonctions. En diminuant l’expression du gène ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de l’ARN interférence par alimentation, nous n’avons observé aucun problème morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possédaient un nombre de progéniture normal. Cependant, les vers sauvage exposés à l’ARNi d’ufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrôles et ce, de façon indépendante de la voie de signalisation de l’insuline/IGF. Chez le C. elegans la longévité et la résistance au stress cellulaire sont intimement liées. Nous n’avons remarqué aucun effet d’ufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress protéotoxique. Il est également nécessaire au maintien de l’intégrité neuronale au cours du vieillissement des animaux. L’ensemble de nos données nous renseigne sur les fonctions putatives du gène Ufm1.

Exploration pathologique des souris transgéniques porteuses du gène VPU de VIH-1

L‟infection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le système immunitaire et conduit à une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par conséquent, entraîne un état d‟immunodéficience. Cette immunodéficience permet l'établissement d‟infections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associées au Sida. Ces patients peuvent aussi développer des lymphomes, lésions du système nerveux central et une atteinte rénale. L'ampleur et la sévérité des conditions associées observées chez les patients infectés par le VIH-1 ne peuvent être imputées seulement au processus infectieux et à la déplétion des cellules T CD4+. Ceci suggère que les produits des gènes de régulation pourraient avoir des effets cytopathogènes. Cependant, les études sur la physiopathogenèse induite par le VIH ou ses différents gènes ont été difficiles à mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infectés par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider à disséquer le rôle des différents composants du génome viral et les mécanismes pathogénétiques impliqués. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modèle de souris transgéniques pour le gène vpu. Vpu code pour une phosphoprotéine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions à la surface cellulaire, induit la dégradation des CD4, induit la régulation négative des CMH-1, augmente la susceptibilité à la mort cellulaire des lymphocytes T infectés par le VIH et favorise la réplication virale en empêchant les mécanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractérisé pathologiquement un modèle de souris transgéniques porteuses du gène vpu du VIH-1. Nos résultats démontrent que l‟expression de vpu chez les souris transgéniques induit le développement spontané d‟une hyperplasie lymphoïde pansystémique, une splénomégalie avec une hyperplasie lymphoïde folliculaire évoluant en lésions prémalignes et malignes qui présentent certaines similarités avec la maladie de Castleman et une iv glomérulonéphrite mesangioproliférative qui rappelle certaines altérations de néphropathie associée au VIH chez les patients infectés. L‟ensemble des altérations démontre que les souris Tg/vpu développent une activation chronique et non spécifique du système immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une dérégulation de l‟IL-6 et une hyperplasie du réseau de cellules métallophiliques pourraient être impliquées. D‟autres résultats obtenus sur les évaluations du fonctionnement du système immunitaire de la rate et du thymus mettent en évidence une susceptibilité augmentée des lymphocytes des tissus lymphoïdes aux effets apoptotiques de la dexaméthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules d‟organes lymphoïdes ainsi qu‟une réaction inflammatoire (Schwartzman) exacerbée et des anomalies dans la réaction d‟hypersensibilité retardée expérimentale. Ce modèle transgénique reproduit plusieurs anomalies rencontrées chez les patients infectés par le VIH et ouvre de nouvelles hypothèses sur la pathogenèse de l‟infection par le VIH.

Caractérisation de la voie d'activation des interférons de type I

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

Analyse des protéines cellulaires incorporées dans les particules matures du virus de l’Herpès simplex de type 1

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l’hôte de façon très variée et plusieurs types vont même jusqu’à incorporer certaines protéines cellulaires. Nous avons récemment effectué la première analyse protéomique du virion mature de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de déterminer que jusqu’à 49 protéines cellulaires différentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de déterminer leur importance dans le cycle de réplication d’HSV-1, nous avons mis au point un système de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relâché dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqué à la GFP ainsi que des petits ARN interférents (pARNi) ciblant spécifiquement ces protéines cellulaires. Cette approche nous a permis de démontrer que 17 des protéines identifiées précédemment jouaient un rôle critique dans la réplication d’HSV-1, suggérant ainsi que leur incorporation dans le virus n’est pas aléatoire. Nous avons ensuite examiné le rôle d’une de ces protéines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protéine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de réplication de plusieurs virus humains. À l’aide de pARNi ainsi que de différentes lignées cellulaires, dont une lignée DDX3X thermosensible, nous avons démontré que l’inhibition de DDX3X résultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de l’expression des gènes viraux. Nous avons aussi démontré que la fraction de DDX3X incorporée dans le virion contribuait activement au cycle infectieux d’HSV-1. Ces résultats confirment l’intérêt de notre approche afin d’étudier les interactions hôte-pathogène en plus de démontrer la contribution des protéines cellulaires incorporées à HSV-1 dans l’infection virale.

Caractérisation moléculaire du rôle de Lhx2 dans le développement de l'oeil et du cerveau

Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales.

Investigating the role of potential genetic markers that can predict risk for steroid refractory inflammatory bowel disease

Contexte - La variation interindividuelle de la réponse aux corticostéroïdes (CS) est un problème important chez les patients atteints de maladies inflammatoires d’intestin. Ce problème est bien plus accentué chez les enfants avec la prévalence de la corticodépendance extrêmement (~40 %) élevée. La maladie réfractaire au CS a des répercussions sur le développement et le bien-être physique et psychologique des patients et impose des coûts médicaux élevés, particulièrement avec la maladie active comparativement à la maladie en rémission, le coût étant 2-3 fois plus élevé en ambulatoire et 20 fois plus élevé en hôpital. Il est ainsi primordial de déterminer les marqueurs prédictifs de la réponse aux CS. Les efforts précédents de découvrir les marqueurs cliniques et démographiques ont été équivoques, ce qui souligne davantage le besoin de marqueurs moléculaires. L'action des CS se base sur des processus complexes déterminés génétiquement. Deux gènes, le ABCB1, appartenant à la famille des transporteurs transmembraneaux, et le NR3C1, encodant le récepteur glucocorticoïde, sont des éléments importants des voies métaboliques. Nous avons postulé que les variations dans ces gènes ont un rôle dans la variabilité observée de la réponse aux CS et pourraient servir en tant que les marqueurs prédictifs. Objectifs - Nous avons visé à: (1) examiner le fardeau de la maladie réfractaire aux CS chez les enfants avec la maladie de Crohn (MC) et le rôle des caractéristiques cliniques et démographiques potentiellement liés à la réponse; (2) étudier l'association entre les variantes d'ADN de gène ABCB1 et la réponse aux CS; (3) étudier les associations entre les variantes d'ADN de gène NR3C1 et la réponse aux CS. Méthodes - Afin d’atteindre ces objectifs, nous avons mené une étude de cohorte des patients recrutés dans deux cliniques pédiatriques tertiaires de gastroentérologie à l’Ottawa (CHEO) et à Montréal (HSJ). Les patients avec la MC ont été diagnostiqués avant l'âge de 18 ans selon les critères standard radiologiques, endoscopiques et histopathologiques. La corticorésistance et la corticodépendance ont été définies en adaptant les critères reconnus. L’ADN, acquise soit du sang ou de la salive, était génotypée pour des variations à travers de gènes ABCB1 et NR3C1 sélectionnées à l’aide de la méthodologie de tag-SNP. La fréquence de la corticorésistance et la corticodépendance a été estimée assumant une distribution binomiale. Les associations entre les variables cliniques/démographiques et la réponse aux CS ont été examinées en utilisant la régression logistique en ajustant pour des variables potentielles de confusion. Les associations entre variantes génétiques de ABCB1 et NR3C1 et la réponse aux CS ont été examinées en utilisant la régression logistique assumant différents modèles de la transmission. Les associations multimarqueurs ont été examinées en utilisant l'analyse de haplotypes. Les variantes nongénotypées ont été imputées en utilisant les données de HAPMAP et les associations avec SNPs imputés ont été examinées en utilisant des méthodes standard. Résultats - Parmi 645 patients avec la MC, 364 (56.2%) ont reçu CS. La majorité de patients étaient des hommes (54.9 %); présentaient la maladie de l’iléocôlon (51.7%) ou la maladie inflammatoire (84.6%) au diagnostic et étaient les Caucasiens (95.6 %). Huit pourcents de patients étaient corticorésistants et 40.9% - corticodépendants. Le plus bas âge au diagnostic (OR=1.34, 95% CI: 1.03-3.01, p=0.040), la maladie cœxistante de la région digestive supérieure (OR=1.35, 95% CI: 95% CI: 1.06-3.07, p=0.031) et l’usage simultané des immunomodulateurs (OR=0.35, 95% CI: 0.16-0.75, p=0.007) ont été associés avec la corticodépendance. Un total de 27 marqueurs génotypés à travers de ABCB1 (n=14) et NR3C1 (n=13) ont été en l'Équilibre de Hardy-Weinberg, à l’exception d’un dans le gène NR3C1 (rs258751, exclu). Dans ABCB1, l'allèle rare de rs2032583 (OR=0.56, 95% CI: 0.34-0.95, p=0.029) et génotype hétérozygote (OR=0.52, 95% CI: 0.28-0.95 p=0.035) ont été négativement associes avec la dépendance de CS. Un haplotype à 3 marqueurs, comprenant le SNP fonctionnel rs1045642 a été associé avec la dépendance de CS (p empirique=0.004). 24 SNPs imputés introniques et six haplotypes ont été significativement associés avec la dépendance de CS. Aucune de ces associations n'a cependant maintenu la signification après des corrections pour des comparaisons multiples. Dans NR3C1, trois SNPs: rs10482682 (OR=1.43, 95% CI: 0.99-2.08, p=0.047), rs6196 (OR=0.55, 95% CI: 0.31-0.95, p=0.024), et rs2963155 (OR=0.64, 95% CI: 0.42-0.98, p=0.039), ont été associés sous un modèle additif, tandis que rs4912911 (OR=0.37, 95% CI: 0.13-1.00, p=0.03) et rs2963156 (OR=0.32, 95% CI: 0.07-1.12, p=0.047) - sous un modèle récessif. Deux haplotypes incluant ces 5 SNPs (AAACA et GGGCG) ont été significativement (p=0.006 et 0.01 empiriques) associés avec la corticodépendance. 19 SNPs imputés ont été associés avec la dépendance de CS. Deux haplotypes multimarqueurs (p=0.001), incluant les SNPs génotypés et imputés, ont été associés avec la dépendance de CS. Conclusion - Nos études suggèrent que le fardeau de la corticodépendance est élevé parmi les enfants avec le CD. Les enfants plus jeunes au diagnostic et ceux avec la maladie coexistante de la région supérieure ainsi que ceux avec des variations dans les gènes ABCB1 et NR3C1 étaient plus susceptibles de devenir corticodépendants.

Rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l'ADN

Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rôle crucial dans l’organisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus récemment, le rôle des centrosomes dans la régulation de l’entrée en mitose a été mis en évidence. Les centrosomes semblent également contribuer à l’activation du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions de l’ADN en servant de point de rencontre pour les régulateurs du cycle cellulaire et les gènes de réponse aux dommages à l’ADN. L’amplification du nombre de centrosomes est une caractéristique des cellules tumorales mais de façon intéressante, elle constitue aussi une réponse des cellules aux dommages à l’ADN. Les mécanismes qui régulent l’homéostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l’ADN, le recrutement et/ou l’activation au niveau des centrosomes des kinases impliquées dans les voies de signalisation de ce point de contrôle ont été étudiés par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos résultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En réponse à l’activation du point de contrôle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqués dans la régulation de ce point de contrôle, une analyse comparative des protéomes de centrosomes purifiés a également été réalisée par spectrométrie de masse. Pour étudier plus particulièrement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons développer des outils moléculaires qui serviront à déterminer le rôle de la sous population de CHK2 localisée aux centrosomes 1) dans la régulation de l’entrée en mitose au cours d’un cycle normal 2) dans l’activation et la stabilité du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions l’ADN et 3) dans l’homéostasie et la dynamiques des centrosomes en réponse aux dommages à l’ADN. Cette étude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la réponse cellulaire au stress génotoxiques anti-cancereux et de révéler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2.

Study of cox1 trans-splicing in Diplonema papillatum mitochondria

Diplonema papillatum est un organisme unicellulaire qui vit dans l’océan. Son génome mitochondrial possède une caractéristique spéciale: tous les gènes sont brisés en de multiples fragments qui s’appellent modules. Chaque module est codé par un chromosome différent. L’expression d’un gène exige des épissages-en-trans qui assemblent un ARN messager complet à partir de tous les modules du gène. Nous avons précédemment montré que le gène cox1 est encodé dans neuf modules avec six Us non encodés entre le module 4 et le module 5 de l’ARN messager mature [1]. Nous n’avons identifié aucune séquence consensus connue de site d’épissage près des modules. Nous spéculons qu’un ARN guide (gRNA) a dirigé l’épissage-en-trans du gène cox1 par un mécanisme qui est semblable à l’édition d’ARN par l’insertion/la suppression des Us chez les kinétoplastides, le groupe sœur des diplonémides. Nous avons trouvé que les six Us sont ajoutés au bout 3’ de l’ARN d’une façon semblable à ceux ajoutés par le TUTase lors de l’édition de l’insertion des Us chez les kinétoplastides. Nous avons construit des profils de gRNA de l’épissage-en-trans avec les expressions régulières basé sur notre connaissance des gRNAs dans l’édition d’ARN chez les kinétoplastides. Selon la complémentarité partielle entre le gRNA et les deux modules adjacents, nous avons généré des amorces pour RT-PCR visant à détecter des séquences qui sont assorties à un des profils de gRNA. Une expérience pilote in vitro n’a pas permis de reconstituer l’épissage-en-trans des modules 3, 4, et 5, suggérant que nous devons améliorer nos techniques.

L'oeuvre latine attribuée à Jacotin dans les sources des XVe et XVIe siècles : transcription critique et analyse

La version intégrale de cette thèse est disponible uniquement pour consultation individuelle à la Bibliothèque de musique de l’Université de Montréal (http://www.bib.umontreal.ca/MU).

Étude des corrélats neurobiologiques des effets à long terme des commotions cérébrales liées au sport

L’âge, le génotype et les traumatismes crâniens (TCC) sont trois facteurs de risque majeurs du développement de la maladie d’Alzheimer (MA). Avec une accumulation d’évidences démontrant la persistance d’anomalies cérébrales suite aux plus légers des TCC, qui affichent d’ailleurs la plus haute incidence, il devient impératif de tester l’hypothèse selon laquelle même les commotions cérébrales puissent interagir avec l’âge et les gènes afin de précipiter la neurodégénération. Trente ex-athlètes de haut niveau (âge M = 60 ans), dont la moitié a subi des commotions cérébrales il y a plus de 30 ans, ont été évalués en neuropsychologie, en neuroimagerie multimodale ainsi qu’en génétique. De nombreuses mesures neuroanatomiques, dont l’expansion du volume des ventricules latéraux, se trouvent à corréler avec divers déficits cognitifs (mémoire différée et de reconnaissance) détectés chez les participants commotionnés. D’un intérêt particulier, certains de ces résultats sont modulés par le polymorphisme nucléotidique simple du gène Apolipoprotéine E. Ces résultats appuient l’hypothèse selon laquelle la commotion cérébrale chez de jeunes athlètes serait un facteur de risque de neurodégénération dans le vieillissement normal.

Amélioration de l'exactitude de l'inférence phylogénomique

L’explosion du nombre de séquences permet à la phylogénomique, c’est-à-dire l’étude des liens de parenté entre espèces à partir de grands alignements multi-gènes, de prendre son essor. C’est incontestablement un moyen de pallier aux erreurs stochastiques des phylogénies simple gène, mais de nombreux problèmes demeurent malgré les progrès réalisés dans la modélisation du processus évolutif. Dans cette thèse, nous nous attachons à caractériser certains aspects du mauvais ajustement du modèle aux données, et à étudier leur impact sur l’exactitude de l’inférence. Contrairement à l’hétérotachie, la variation au cours du temps du processus de substitution en acides aminés a reçu peu d’attention jusqu’alors. Non seulement nous montrons que cette hétérogénéité est largement répandue chez les animaux, mais aussi que son existence peut nuire à la qualité de l’inférence phylogénomique. Ainsi en l’absence d’un modèle adéquat, la suppression des colonnes hétérogènes, mal gérées par le modèle, peut faire disparaître un artéfact de reconstruction. Dans un cadre phylogénomique, les techniques de séquençage utilisées impliquent souvent que tous les gènes ne sont pas présents pour toutes les espèces. La controverse sur l’impact de la quantité de cellules vides a récemment été réactualisée, mais la majorité des études sur les données manquantes sont faites sur de petits jeux de séquences simulées. Nous nous sommes donc intéressés à quantifier cet impact dans le cas d’un large alignement de données réelles. Pour un taux raisonnable de données manquantes, il appert que l’incomplétude de l’alignement affecte moins l’exactitude de l’inférence que le choix du modèle. Au contraire, l’ajout d’une séquence incomplète mais qui casse une longue branche peut restaurer, au moins partiellement, une phylogénie erronée. Comme les violations de modèle constituent toujours la limitation majeure dans l’exactitude de l’inférence phylogénétique, l’amélioration de l’échantillonnage des espèces et des gènes reste une alternative utile en l’absence d’un modèle adéquat. Nous avons donc développé un logiciel de sélection de séquences qui construit des jeux de données reproductibles, en se basant sur la quantité de données présentes, la vitesse d’évolution et les biais de composition. Lors de cette étude nous avons montré que l’expertise humaine apporte pour l’instant encore un savoir incontournable. Les différentes analyses réalisées pour cette thèse concluent à l’importance primordiale du modèle évolutif.