The involvement of nitric oxide in bovine follicular development and ovulation

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins.

Développement de nouveaux sels Binol-imidazoliums : de la catalyse asymétrique aux applications biologiques

Le 1,1'-bi-2-naphtol ou Binol, présentant une chiralité axiale, est un ligand très utilisé en catalyse asymétrique. Au cours des vingt dernières années, le Binol a servi de synthon à l’élaboration de très nombreux ligands permettant la catalyse asymétrique de tous types de réactions, allant de l’hydrogénation, à l’alkylation, en passant par diverses réactions péricycliques. Le grand intérêt pour ce ligand vient de sa versatilité et des nombreuses possibilités de fonctionnalisation qu’il offre, permettant d’altérer ses propriétés catalytiques à volonté, aussi bien en modifiant son caractère électronique, qu’en introduisant des facteurs stériques autour du site catalytique. Parallèlement aux développements de la catalyse par des dérivés de Binol, le domaine des liquides ioniques a connu un intérêt croissant ces dernières années. Les liquides ioniques, sels dont le point de fusion est inférieur à 100°C, cumulent de nombreuses qualités convoitées : faible pression de vapeur, stabilité thermique et chimique et fort pouvoir de solvatation. Dû à ces propriétés, les liquides ioniques ont principalement été étudiés dans l’optique de développer une gamme de solvants recyclables. Alors que les propriétés des liquides ioniques sont facilement modulables en fonction de l’anion et du cation choisi, le concept de liquide ionique à tâche spécifique va plus loin et propose d’introduire directement, sur le cation ou l’anion, un groupement conférant une propriété particulière. En suivant cette approche, plusieurs ligands ioniques ont été rapportés, par simple couplage d’un cation organique à un ligand déjà connu. Étonnamment, le Binol a fait l’objet de très peu de travaux pour l’élaboration de ligands ioniques. Dans cette thèse, nous proposons l’étude d’une famille de composés de type Binol-imidazolium dont les unités Binol et imidazolium sont séparées par un espaceur méthylène. Différents homologues ont été synthétisés en variant le nombre d’unités imidazolium et leur position sur le noyau Binol, la longueur de la chaîne alkyle portée par les unités imidazolium et la nature du contre-anion. Après une étude des propriétés thermiques de ces composés, l’utilisation des Binol-imidazoliums en tant que ligands dans une réaction asymétrique d’éthylation d’aldéhydes aromatique a été étudiée en milieu liquide ionique. La réaction a été conduite en solvant liquide ionique dans le but de recycler aussi bien le ligand Binol-imidazolium que le solvant, en fin de réaction. Cette étude nous a permis de démontrer que la sélectivité de ces ligands ioniques dépend grandement de leur structure. En effet, seuls les Binols fonctionnalisés en positions 6 et 6’ permettent une sélectivité de la réaction d’éthylation. Alors que les dérivés de Binol fonctionnalisés en positions 3 et 3’ ne permettent pas une catalyse énantiosélective, il a déjà été rapporté que ces composés avaient la capacité de complexer des anions. D’autre part, il a déjà été rapporté par notre groupe, que les composés comportant des unités imidazolium pouvaient permettre le transport d’anions à travers des bicouches lipidiques en fonction de leur amphiphilie. Ceci nous a amenés à la deuxième partie de cette thèse qui porte sur les propriétés ionophores des Binols fonctionnalisés en positions 3 et 3’ par des unités imidazoliums. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’étude de la relation structure-activité et au mécanisme de transport de ces composés. Le transport d’anions étant un processus clé dans la biologie cellulaire, l’activité biologique des composés présentant une activité ionophore dans des systèmes modèles (liposomes) a été étudiée par la suite. L’activité antibactérienne des nos composés a été testée sur quatre souches de bactéries. Il s’est avéré que les composés Binol-imidazolium sont actifs uniquement sur les bactéries Gram positives. Finalement, la cytotoxicité des composés présentant une activité antibactérienne a été étudiée sur des cellules humaines.

Regulation of gene expression in the dinoflagellate Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste.

Développement de nouvelles formulations d’antifongiques et évaluation de l’activité sur Candida spp. et Aspergillus spp.

Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse de doctorat avaient pour but de mettre au point des nouvelles formulations d’antifongiques sous forme de nanoparticules polymériques (NP) en vue d’améliorer l’efficacité et la spécificité des traitements antifongiques sur des souches sensibles ou résistantes de Candida spp, d’Aspergillus spp et des souches de Candida albicans formant du biofilm. Dans la première partie de ce travail, nous avons synthétisé et caractérisé un polymère à base de polyester-co-polyéther branché avec du poly(éthylène glycol) (PEG-g-PLA). En plus d’être original et innovant, ce co-polymère a l’avantage d’être non-toxique et de posséder des caractéristiques de libération prolongée. Trois antifongiques couramment utilisés en clinique et présentant une biodisponibilité non optimale ont été choisis, soient deux azolés, le voriconazole (VRZ) et l’itraconazole (ITZ) et un polyène, l’amphotéricine B (AMB). Ces principes actifs (PA), en plus des problèmes d’administration, présentent aussi d’importants problèmes de toxicité. Des NP polymériques encapsulant ces PA ont été préparées par une technique d’émulsion huile-dans-l’eau (H/E) suivie d’évaporation de solvant. Une fois fabriquées, les NP ont été caractérisées et des particules de d’environ 200 nm de diamètre ont été obtenues. Les NP ont été conçues pour avoir une structure coeur/couronne avec un coeur constitué de polymère hydrophobe (PLA) et une couronne hydrophile de PEG. Une faible efficacité de chargement (1,3% m/m) a été obtenue pour la formulation VRZ encapsulé dans des NP (NP/VRZ). Toutefois, la formulation AMB encapsulée dans des NP (NP/AMB) a montré des taux de chargement satisfaisants (25,3% m/m). En effet, le caractère hydrophobe du PLA a assuré une bonne affinité avec les PA hydrophobes, particulièrement l’AMB qui est le plus hydrophobe des agents sélectionnés. Les études de libération contrôlée ont montré un relargage des PA sur plusieurs jours. La formulation NP/AMB a été testée sur un impacteur en cascade, un modèle in vitro de poumon et a permis de démontrer le potentiel de cette formulation à être administrée efficacement par voie pulmonaire. En effet, les résultats sur l’impacteur en cascade ont montré que la majorité de la formulation s’est retrouvée à l’étage de collecte correspondant au niveau bronchique, endroit où se situent majoritairement les infections fongiques pulmonaires. Dans la deuxième partie de ces travaux, nous avons testé les nouvelles formulations d’antifongiques sur des souches planctoniques de Candida spp., d’Aspergillus spp. et des souches de Candida albicans formant du biofilm selon les procédures standardisées du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Les souches choisies ont démontré des résistances aux azolés et aux polyènes. Les études d’efficacité in vitro ont permis de prouver hors de tout doute que les nouvelles formulations offrent une efficacité nettement améliorée comparée à l’agent antifongique libre. Pour mettre en lumière si l’amélioration de l’efficacité antifongique était due à une internalisation des NP, nous avons évalué le comportement des NP avec les cellules de champignons. Nous avons procédé à des études qualitatives de microscopie de fluorescence sur des NP marquées avec de la rhodamine (Rh). Tel qu’attendu, les NP ont montré une localisation intracellulaire. Pour exclure la possibilité d’une simple adhésion des NP à la surface des levures, nous avons aussi confirmé leur internalisation en microscopie confocale de fluorescence. Il est important de noter que peu d’études à ce jour ont mis l’accent sur l’élaboration de nouvelles formulations d’antifongiques à base de polymères non toxiques destinées aux traitements des mycoses, donnant ainsi une grande valeur et originalité aux travaux effectués dans cette thèse. Les résultats probants obtenus ouvrent la voie vers une nouvelle approche pour contourner les problèmes de résistances fongiques, un problème de plus en plus important dans le domaine de l’infectiologie.

Mode d’action moléculaire de la toxine anti-tumorale : PS1Aa2 du bacille de Thuringe

Les parasporines sont des toxines Cry du bacille de Thuringe actives contre des cellules tumorales. Ce travail montre que la parasporine PS1Aa2 (Cry31Aa2) forme des pores dans des membranes artificielles, comme de nombreuses toxines Cry. Ceux-ci ont plusieurs niveaux de conductance dont les plus fréquents étaient de 11, 16 et 21 pS dans une solution de 150 mM KCl. Nos résultats de microspectrofluorométrie avec la sonde Fura-2 montrent que la présence de la PS1Aa2 peut produire des augmentations du calcium intracellulaire, la plupart du temps sous la forme d’oscillations calciques et parfois des augmentations soutenues. Ces réponses ont été observées en présence et en absence de calcium extracellulaire, dans les lignées tumorales HeLa et HepG2 et dans la lignée non tumorale HEK 293. Bien que quelques études aient montré que le calcium semble intervenir dans leur mode d’action, de telles oscillations calciques n’ont jamais été décrites auparavant pour des toxines Cry. Les expériences ont dû être faites à des concentrations beaucoup plus élevées de toxine que prévues sur la base des résultats publiés de cytotoxicité. Malgré la présence des fragments identifiés auparavant comme actifs, sa faible efficacité semble liée à la présence d’ADN dans les préparations qui entraîne la précipitation de la protéine. Les travaux futurs sur cette toxine seraient donc grandement facilités par une amélioration de sa méthode de préparation.

Gestion des ressources dans les réseaux cellulaires sans fil

L’émergence de nouvelles applications et de nouveaux services (tels que les applications multimédias, la voix-sur-IP, la télévision-sur-IP, la vidéo-sur-demande, etc.) et le besoin croissant de mobilité des utilisateurs entrainent une demande de bande passante de plus en plus croissante et une difficulté dans sa gestion dans les réseaux cellulaires sans fil (WCNs), causant une dégradation de la qualité de service. Ainsi, dans cette thèse, nous nous intéressons à la gestion des ressources, plus précisément à la bande passante, dans les WCNs. Dans une première partie de la thèse, nous nous concentrons sur la prédiction de la mobilité des utilisateurs des WCNs. Dans ce contexte, nous proposons un modèle de prédiction de la mobilité, relativement précis qui permet de prédire la destination finale ou intermédiaire et, par la suite, les chemins des utilisateurs mobiles vers leur destination prédite. Ce modèle se base sur : (a) les habitudes de l’utilisateur en terme de déplacements (filtrées selon le type de jour et le moment de la journée) ; (b) le déplacement courant de l’utilisateur ; (c) la connaissance de l’utilisateur ; (d) la direction vers une destination estimée ; et (e) la structure spatiale de la zone de déplacement. Les résultats de simulation montrent que ce modèle donne une précision largement meilleure aux approches existantes. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous nous intéressons au contrôle d’admission et à la gestion de la bande passante dans les WCNs. En effet, nous proposons une approche de gestion de la bande passante comprenant : (1) une approche d’estimation du temps de transfert intercellulaire prenant en compte la densité de la zone de déplacement en terme d’utilisateurs, les caractéristiques de mobilité des utilisateurs et les feux tricolores ; (2) une approche d’estimation de la bande passante disponible à l’avance dans les cellules prenant en compte les exigences en bande passante et la durée de vie des sessions en cours ; et (3) une approche de réservation passive de bande passante dans les cellules qui seront visitées pour les sessions en cours et de contrôle d’admission des demandes de nouvelles sessions prenant en compte la mobilité des utilisateurs et le comportement des cellules. Les résultats de simulation indiquent que cette approche réduit largement les ruptures abruptes de sessions en cours, offre un taux de refus de nouvelles demandes de connexion acceptable et un taux élevé d’utilisation de la bande passante. Dans la troisième partie de la thèse, nous nous penchons sur la principale limite de la première et deuxième parties de la thèse, à savoir l’évolutivité (selon le nombre d’utilisateurs) et proposons une plateforme qui intègre des modèles de prédiction de mobilité avec des modèles de prédiction de la bande passante disponible. En effet, dans les deux parties précédentes de la thèse, les prédictions de la mobilité sont effectuées pour chaque utilisateur. Ainsi, pour rendre notre proposition de plateforme évolutive, nous proposons des modèles de prédiction de mobilité par groupe d’utilisateurs en nous basant sur : (a) les profils des utilisateurs (c’est-à-dire leur préférence en termes de caractéristiques de route) ; (b) l’état du trafic routier et le comportement des utilisateurs ; et (c) la structure spatiale de la zone de déplacement. Les résultats de simulation montrent que la plateforme proposée améliore la performance du réseau comparée aux plateformes existantes qui proposent des modèles de prédiction de la mobilité par groupe d’utilisateurs pour la réservation de bande passante.

Amélioration des résultats cliniques en chirurgie cardiaque

Des éléments contributifs à plusieurs facettes de la chirurgie cardiaque ont été étudiés dans la présente thèse. Le premier manuscrit adresse la problématique de l’accident cérébro-vasculaire (ACV) post-opératoire. Nous avons analysé de façon rétrospective la médication prise en pré-opératoire de 6813 patients nécessitant une chirurgie de revascularisation coronarienne. Le but étant d’établir si la présence d’une médication précise (aspirine, inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine, statine, bêta-bloqueur) peut agir en pré-opératoire pour diminuer le risque d’ACV. En analyse multivariée, la combinaison de la prise de bêta-bloqueurs avec une statine a produit un ratio de cote de 0,37, suggérant un effet protecteur très important. Dans le deuxième manuscrit, je présente une étude ciblant les patients avec insuffisance mitrale ischémique modérée. Trente et un patients furent randomisés entre un traitement par pontages seuls vs pontages et annuloplastie mitrale restrictive. L’insuffisance mitrale a disparu en post-opératoire immédiat en présence de l’annuloplastie alors qu’aucun effet immédiat de la revascularisation coronarienne n’était noté sur l’insuffisance mitrale. Un an suivant la chirurgie, une insuffisance mitrale légère est réapparue chez le groupe ayant subi l’annuloplastie alors que les patients du groupe pontages seuls ont remodelé leur ventricule gauche et diminué l’importance de leur insuffisance mitrale au même niveau que le groupe annuloplastie. Aucun des marqueurs d’évolution clinique, tant au niveau symptomatique qu’au niveau de la survie ne diffère entre les groupes. La troisième étude est un suivi sur 20 ans des patients ayant eu des remplacements valvulaires mitraux ou aortiques avec une prothèse mécanique Carbomedics. Cette étude démontre une excellente survie avec un taux de complications valvulaires hémorragiques, thrombotiques, thrombo-emboliques, et d’endocardite favorable comparé aux autres types de prothèse et une absence de bris mécanique.

Rôle de la topoisomérase I dans la stabilité du génome chez Escherichia coli

Les topoisomérases (topos) de type IA jouent un rôle primordial dans le maintien et l’organisation du génome. Cependant, les mécanismes par lesquels elles contrôlent cette stabilité génomique sont encore à approfondir. Chez E. coli, les deux principales topoisomérases de type IA sont la topo I (codée par le gène topA) et la topo III (codée par le gène topB). Il a déjà été montré que les cellules dépourvues des topos I et III formaient de très longs filaments dans lesquels les chromosomes ne sont pas bien séparés. Comme ces défauts de ségrégation des chromosomes sont corrigés par l’inactivation de la protéine RecA qui est responsable de la recombinaison homologue, il a été émis comme hypothèse que les topoisomérases de type IA avaient un rôle dans la résolution des intermédiaires de recombinaison afin de permettre la séparation des chromosomes. D’autre part, des études réalisées dans notre laboratoire démontrent que le rôle majeur de la topoisomérase I est d’empêcher la formation des R-loops durant la transcription, surtout au niveau des opérons rrn. Ces R-loops on été récemment identifiés comme des obstacles majeurs à l’avancement des fourches de réplication, ce qui peut provoquer une instabilité génomique. Nous avons des évidences génétiques montrant qu’il en serait de même chez nos mutants topA. Tout récemment, des études ont montré le rôle majeur de certaines hélicases dans le soutien aux fourches de réplication bloquées, mais aussi une aide afin de supprimer les R-loops. Chez E. coli, ces hélicases ont été identifiées et sont DinG, Rep et UvrD. Ces hélicases jouent un rôle dans la suppression de certains obstacles à la réplication. Le but de ce projet était de vérifier l’implication de ces hélicases chez le mutant topA en utilisant une approche génétique. Étonnamment, nos résultats montrent que la délétion de certains de ces gènes d’hélicases a pour effet de corriger plutôt que d’exacerber des phénotypes du mutants topA qui sont liés à la croissance et à la morphologie des nucléoides et des cellules. Ces résultats sont interprétés à la lumière de nouvelles fonctions attribuées aux topoisomérases de types IA dans la stabilité du génome.

Ethnobotanique de la Nation crie d'Eeyou Istchee et variation géographique des plantes médicinales antidiabétiques

Le diabète de type 2 affecte en moyenne 29% de la population adulte crie d’Eeyou Istchee (CEI). Afin d’identifier les plantes médicinales possédant un potentiel antidiabétique, des interviews ont été réalisés dans les communautés CEI de Wemindji et Oujé-Bougoumou. Utilisant une approche quantitative, les espèces mentionnées ont été classées et comparées à la pharmacopée des communautés avoisinantes. Seize et 25 plantes ont été mentionné à Wemindji et Oujé-Bougoumou, respectivement. Sept nouvelles espèces de plantes et une de champignon se sont ajoutées à la liste des espèces à potentiel antidiabétique, bien que la plupart de celles mentionnées pendant les interviews soit en communes à la pharmacopée CEI générale, démontrant ainsi leur importance culturelle. Des analyses phytochimiques sur deux de ces espèces, Rhododendron groenlandicum et Sarracenia purpurea, ont été réalisées à partir d’échantillons récoltés à différents endroits du territoire eeyouch. Bien qu’aucun patron n’ait été détecté dans la variation des composantes biologiquement actives chez S. purpurea, les composés phénoliques chez R. groenlandicum, particulièrement la (+)-catéchine, l’(-)-epicatéchine et la quercétine-3-galactoside, varient spatialement en fonction de paramètres d’insolation telles la radiation solaire ou la photopériode. Les échantillons de cette dernière espèce, testés in vitro dans le bioessai de l’adipogenèse des cellules adipocytes murines 3T3-L1, augmentent l’accumulation intracellulaire des triglycérides, leur conférant ainsi une activité diabétique semblable à la rosiglitazone. Cependant, cette activité était plus faible dans les échantillons à haute teneur en quercétine, cela pouvant ainsi avoir un impact sur la qualité d'un produit de santé naturel fabriqué à partir de cette espèce.

ApoB et résistance à l'insuline : association avec l'activation du système IL-1β

INTRODUCTION : Il a été démontré que le nombre de lipoprotéines apolipoprotéine B (apoB) est un prédicteur du développement du diabète de type 2 (DT2), mais le mécanisme est inconnu. La résistance à l'insuline (RI) et l'hyperinsulinémie compensatoire (HI) entraînent l’épuisement des cellules β et la progression vers le DT2. De plus, l'activation du système de l'interleukine -1β (IL- 1β) est impliquée dans la pathophysiologie du DT2. Notre objectif était donc d'étudier si l’apoB est associé à la RI et à l’HI chez les humains et si cette corrélation est médiée par l’activation du système IL-1β. MÉTHODOLOGIE : 47 femmes ménopausées, non diabétiques, obèses ou en surpoids et 28 hommes, âgés de 45 à 74 ans ont été recrutés. La sécrétion d'insuline (SI) et la sensibilité à l'insuline ont été mesurées par un clamp Botnia modifié. La 1ère et 2ème phase de SI furent mesurées lors d'un test de tolérance au glucose intraveineux (IVGTT) d’une heure, suivi d’un clamp hyperinsulinémique euglycémique (HEIC) de 3 heures (taux de perfusion d'insuline de 75 mU/m2/min) pour mesurer la sensibilité à l'insuline lors des 30 dernières minutes du clamp (état d'équilibre). La sensibilité à l'insuline est exprimée comme étant le taux de perfusion de glucose (GIR) seul ou divisé par le taux d’insuline à l’état d’équilibre (M/I). RÉSULTATS : Chez les femmes, l’apoB à jeun corrélait avec une augmentation de la 2e phase de SI, la SI totale et la sécrétion totale de C-peptide (r=0,202; r=0,168; r=0,204) et avec une diminution de la sensibilité à l'insuline (GIR r=-0,299; M/I r=-0,180) indépendamment de l'adiposité. L’IL-1Ra à jeun (indicateur de l’activation du système IL-1β) corrélait positivement avec la 2e phase, la SI totale et la sécrétion totale de C-peptide (r=0,217; r=0,154; r=0,198) et négativement avec la sensibilité à l'insuline (GIR r=-0,304; M/I r=-0,214). L’IL-1Ra était également corrélée avec l'apoB (r=0,352). Une fois corrigé pour l'IL-1Ra, toutes les associations entre l'apoB et les indices de sensibilité à l'insuline et de SI ont été perdues. Malgré des glycémies similaires, il n’y avait pas de corrélation de l’apoB avec les indices mesurés chez les hommes. CONCLUSION : L’apoB est associé à l’HI et la RI chez les femmes non diabétiques obèses et en surpoids, potentiellement via l'activation du système IL-1β. Ces différences sexuelles doivent être prises en compte dans l'exploration de la physiopathologie du DT2.

Profilage Moléculaire de la Scoliose Idiopathique de l’Adolescent

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation la plus fréquente en orthopédie pédiatrique. C'est une maladie qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin affectant plus sévèrement et majoritairement les filles à la puberté. Malgré de nombreuses années de recherches approfondies dans le domaine de la SIA, la cause n'a toujours pas été résolue. OBJECTIFS : Il a été démontré qu’il existe une dysfonction de la signalisation de la mélatonine par les protéines G inhibitrices (Gi) dans les ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA. Ceci a conduit à une stratification des patients en trois groupes fonctionnels. Le but de ce projet de maîtrise est d’établir les profils d’expression moléculaire correspondant à chacun des groupes fonctionnels. Les objectifs spécifiques sont d’identifier les gènes responsables de l’initiation de la SIA et du défaut différentiel observé dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi. MÉTHODES : Des ARNs ont été préparés à partir d’ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA sélectionnés pour chaque groupe fonctionnel et comparés aux ARNs obtenus d’ostéoblastes de sujets sains. En plus, des cellules sanguines (PBMCs) isolées d’une paire de jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose ont été étudiées pour comparer leur profil d’expression génétique. Nous avons utilisé des biopuces à ADN contenant un ensemble de 54,000 sondes permettant l’analyse du niveau d’expression de plus de 47,000 transcrits représentant 30,000 gènes humains bien caractérisés (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). Les gènes retenus ont par la suite été validés par qPCR sur un plus grand nombre de patients afin de tester la spécificité des profils d’expression pour chaque groupe de patients à partir des cellules osseuses dérivées lors de la chirurgie. RÉSULTATS: Le profilage moléculaire proposé permettra d’établir les fondements moléculaires de la SIA selon le test fonctionnel développé par le Dr Moreau et son équipe et d’identifier de nouveaux gènes associés à la SIA. Ce projet a permis de mettre en évidence des gènes possiblement impliqués dans le défaut de signalisation associé aux protéines Gi communs aux trois groupes, ainsi que des gènes spécifiques à certains groupes, pouvant contribuer au développement de certaines co-morbidités et/ou au risque d’aggravation des déformations rachidiennes. L’étude préliminaire des jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose a mis en évidence un nombre limité de gènes possiblement associés au défaut de signalisation observé chez la jumelle scoliotique, gènes dont l’expression pourrait être influencée par des modifications d’ordre épigénétique liées à l’environnement. CONCLUSION: Les données obtenues par des approches de transcriptomiques dans le cadre de ce projet soutiennent notre méthode de stratification fonctionnelle des patients SIA et ont conduit à l’identification de nouveaux gènes associés à la SIA. Ces résultats jettent un éclairage nouveau sur la SIA et contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes et facteurs impliqués dans l’étiologie de la SIA. À cet égard, nos résultats permettront éventuellement d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles et des traitements personnalisés compte tenu des profils moléculaires distincts observés pour chaque groupe de patients.

Rôle du régulateur Fur et des petits ARN non codants RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella

La régulation de l’homéostasie du fer est cruciale chez les bactéries. Chez Salmonella, l’expression des gènes d’acquisition et du métabolisme du fer au moment approprié est importante pour sa survie et sa virulence. Cette régulation est effectuée par la protéine Fur et les petits ARN non codants RfrA et RfrB. Le rôle de ces régulateurs est d’assurer que le niveau de fer soit assez élevé pour la survie et le métabolisme de Salmonella, et assez faible pour éviter l’effet toxique du fer en présence d’oxygène. Les connaissances concernant le rôle de ces régulateurs ont été principalement obtenues par des études chez S. Typhimurium, un sérovar généraliste causant une gastro-entérite chez les humains. Très peu d’informations sont connues sur le rôle de ces régulateurs chez S. Typhi, un sérovar humain-spécifique responsable de la fièvre typhoïde. Le but de cette étude était de déterminer les rôles de Fur, RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella, et de démontrer qu’ils ont une implication distincte chez les sérovars Typhi et Typhimurium. Premièrement, Fur, RfrA et RfrB régulent l’homéostasie du fer de Salmonella. Les résultats de cette étude ont démontré que Fur est requis pour la résistance au stress oxydatif et pour une croissance optimale dans différentes conditions in vitro. La sensibilité du mutant fur est due à l’expression des petits ARN RfrA et RfrB, et cette sensibilité est beaucoup plus importante chez S. Typhi que chez S. Typhimurium. Également, Fur inhibe la transcription des gènes codant pour les sidérophores en conditions riches en fer, tandis que les petits ARN RfrA et RfrB semblent être importants pour la production d’entérobactine et de salmochélines chez S. Typhi lors de conditions pauvres en fer. Ensuite, ces régulateurs affectent la virulence de Salmonella. Fur est important pour la motilité de Salmonella, particulièrement chez S. Typhi. Fur est nécessaire pour l’invasion des deux sérovars dans les cellules épithéliales, et pour l’entrée et la survie de S. Typhi dans les macrophages. Chez S. Typhimurium, Fur ne semble pas impliqué dans l’interaction avec les macrophages. De plus, les petits ARN RfrA et RfrB sont importants pour la multiplication intracellulaire de Salmonella dans les macrophages pour les deux sérovars. Finalement, la protéine Fur et les petits ARN RfrA et RfrB régulent l’expression de l’opéron fimbriaire tcf, absent du génome de S. Typhimurium. Un site de liaison putatif de la protéine Fur a été identifié dans la région promotrice de tcfA chez S. Typhi, mais une régulation directe n’a pas été confirmée. L’expression de tcf est induite par le fer et par Fur, et est inhibée par les petits ARN RfrA et RfrB. Ainsi, ces régulateurs affectent des gènes de virulence qui sont retrouvés spécifiquement chez S. Typhi. En somme, ce projet a permis de démontrer que les régulateurs de l’homéostasie du fer de Salmonella peuvent affecter la résistance de cette bactérie pathogène à différents stress, notamment le stress oxydatif, la croissance en conditions de carence en fer ainsi que la virulence. Ces régulateurs jouent un rôle distinct chez les sérovars Typhi et Typhimurium.

Étude pangénomique de la variabilité dans le nombre de copies liée à l’hypertension artérielle et ses anomalies métaboliques associées

L’hypertension artérielle essentielle (HTA) est une pathologie complexe, multifactorielle et à forte composante génétique. L’impact de la variabilité dans le nombre de copies sur l’HTA est encore peu connu. Nous envisagions que des variants dans le nombre de copies (CNVs) communs pourraient augmenter ou diminuer le risque pour l’HTA. Nous avons exploré cette hypothèse en réalisant des associations pangénomiques de CNVs avec l’HTA et avec l’HTA et le diabète de type 2 (DT2), chez 21 familles du Saguenay-Lac-St-Jean (SLSJ) caractérisées par un développement précoce de l’HTA et de la dyslipidémie. Pour la réplication, nous disposions, d’une part, de 3349 sujets diabétiques de la cohorte ADVANCE sélectionnés pour des complications vasculaires. D’autre part, de 187 sujets de la cohorte Tchèque Post-MONICA (CTPM), choisis selon la présence/absence d’albuminurie et/ou de syndrome métabolique. Finalement, 134 sujets de la cohorte CARTaGENE ont été analysés pour la validation fonctionnelle. Nous avons détecté deux nouveaux loci, régions de CNVs (CNVRs) à effets quantitatifs sur 17q21.31, associés à l’hypertension et au DT2 chez les sujets SLSJ et associés à l’hypertension chez les diabétiques ADVANCE. Un modèle statistique incluant les deux variants a permis de souligner le rôle essentiel du locus CNVR1 sur l’insulino-résistance, la précocité et la durée du diabète, ainsi que sur le risque cardiovasculaire. CNVR1 régule l’expression du pseudogène LOC644172 dont le dosage est associé à la prévalence de l’HTA, du DT2 et plus particulièrement au risque cardiovasculaire et à l’âge vasculaire (P<2×10-16). Nos résultats suggèrent que les porteurs de la duplication au locus CNVR1 développent précocement une anomalie de la fonction bêta pancréatique et de l’insulino-résistance, dues à un dosage élevé de LOC644172 qui perturberait, en retour, la régulation du gène paralogue fonctionnel, MAPK8IP1. Nous avons également avons identifié six CNVRs hautement hérités et associés à l'HTA chez les sujets SLSJ. Le score des effets combinés de ces CNVRs est apparu positivement et étroitement relié à la prévalence de l’HTA (P=2×10-10) et à l’âge de diagnostic de l’HTA. Dans la population SLSJ, le score des effets combinés présente une statistique C, pour l’HTA, de 0.71 et apparaît aussi performant que le score de risque Framingham pour la prédiction de l’HTA chez les moins de 25 ans. Un seul nouveau locus de CNVR sur 19q13.12, où la délétion est associée à un risque pour l’HTA, a été confirmé chez les Caucasiens CTPM. Ce CNVR englobe le gène FFAR3. Chez la souris, il a été démontré que l’action hypotensive du propionate est en partie médiée par Ffar3, à travers une interférence entre la flore intestinale et les systèmes cardiovasculaire et rénal. Les CNVRs identifiées dans cette étude, affectent des gènes ou sont localisées dans des QTLs reliés majoritairement aux réponses inflammatoires et immunitaires, au système rénal ainsi qu’aux lésions/réparations rénales ou à la spéciation. Cette étude suggère que l’étiologie de l’HTA ou de l’HTA associée au DT2 est affectée par des effets additifs ou interactifs de CNVRs.

Altération du couplage neurovasculaire par l'angiotensine II : évaluation du rôle de la signalisation calcique astrocytaire

Le couplage neurovasculaire (CNV) est un mécanisme d’homéostasie cérébrale régulant le débit sanguin cérébral (CBF) en fonction de l’activité neuronale. La manière dont il est altéré par l’angiotensine II (Ang II), une hormone synthétisée et relâchée dans la circulation systémique ou, alternativement, produite dans le cerveau grâce aux astrocytes, demeure à élucider. Ces cellules expriment le récepteur AT1 (rAT1) et participent à l’orchestration du CNV en relâchant des agents vasoactifs suivant la réponse calcique astrocytaire. Nous avons donc étudié le rôle de cette réponse dans l’altération du CNV induite par l’Ang II. Nous avons trouvé par fluxmétrie par laser Doppler que l’Ang II atténue (p<0.05) la réponse du CBF engendrée par l’activation des récepteurs métabotropes du glutamate du groupe I (mGluRI) du cortex chez la souris C57BL/6. De manière similaire, l’Ang II diminue l'élévation du CBF induite par la stimulation des vibrisses (p<0.05). Sur tranches de cerveaux en aiguë, la polarité de la réponse vasculaire induite par un agoniste mGluRI dans les artérioles parenchymateuses a été significativement renversée par l’Ang II de la vasodilatation vers la vasoconstriction. En parallèle, l’Ang II a augmenté les niveaux de calcium astrocytaire basaux et l’amplitude des réponses calciques (p<0.05). L’altération des réponses vasculaires et calciques maximales a été prévenue par le candesartan, antagoniste des rAT1. Nos résultats suggèrent que l’Ang II potentialise via les rAT1 la réponse calcique qui atteint un seuil favorisant la vasoconstriction par rapport à la vasodilatation, altérant ainsi l’augmentation du CBF en réponse à l’activité neuronale.

Régulation de l’activité transcriptionnelle des récepteurs des estrogènes (ER) par le récepteur à chimiokine CXCR4 et les récepteurs à activité tyrosine kinase ErbB2 et ErbB3

La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches.