Le rôle des cellules gliales de Müller dans la mort des cellules ganglionnaires de la rétine par des mécanismes cellulaires non-autonomes

Les cellules gliales sont essentielles au fonctionnement du système nerveux. Dans la rétine, les cellules gliales de Müller assurent à la fois l’homéostasie du tissu et la protection des neurones, notamment celle des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). L’hypothèse principale de la thèse est que les cellules de Müller joueraient un rôle primordial dans la survie neuronale tant au plan de la signalisation des neurotrophines/proneurotrophines par suite d’une blessure que lors des mécanismes d’excitotoxicité. Contrairement au brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le nerve growth factor (NGF) n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs après une section du nerf optique. Le premier objectif de la thèse a donc été de localiser les récepteurs p75NTR et TrkA du NGF dans la rétine adulte et d’établir leur fonction respective en utilisant des ligands peptidomimétiques agonistes ou antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs. Nos résultats ont démontré que TrkA est surexprimé par les CGRs après l’axotomie, tandis que p75NTR est spécifiquement exprimé par les cellules de Müller. Alors que NGF n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs, l’activation spécifique de TrkA par des ligands peptidomimétique est nettement neuroprotectrice. De façon surprenante, le blocage sélectif de p75NTR ou l’absence de celui-ci protège les CGRs de la mort induite par l’axotomie. De plus, la combinaison de NGF avec l’antagoniste de p75NTR agit de façon synergique sur la survie des CGRS. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le récepteur p75NTR exprimé par les cellules gliales de Müller peut grandement influencer la survie neuronale. Ensuite, nous avons voulu déterminer l’effet des proneurotrophines dans la rétine adulte. Nous avons démontré que l’injection de proNGF induit la mort des CGRs chez le rat et la souris par un mécanisme dépendant de p75NTR. L’expression de p75NTR étant exclusive aux cellules de Müller, nous avons testé l’hypothèse que le proNGF active une signalisation cellulaire non-autonome qui aboutit à la mort des CGRs. En suivant cette idée, nous avons montré que le proNGF induit une forte expression du tumor necrosis factor α (TNFα) dans les cellules de Müller et que l’inhibition du TNF bloque la mort neuronale induite par le proNGF. L’utilisation de souris knock-out pour la protéine p75NTR, son co-récepteur sortiline, ou la protéine adaptatrice NRAGE a permis de montrer que la production de TNF par les cellules gliales était dépendante de ces protéines. Le proNGF semble activer une signalisation cellulaire non-autonome qui cause la mort des neurones de façon dépendante du TNF in vivo. L’hypothèse centrale de l’excitotoxicité est que la stimulation excessive des récepteurs du glutamate sensibles au N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) est dommageable pour les neurones et contribue à plusieurs maladies neurodégénératives. Les cellules gliales sont soupçonnées de contribuer à la mort neuronale par excitotoxicité, mais leur rôle précis est encore méconnu. Le dernier objectif de ma thèse était d’établir le rôle des cellules de Müller dans cette mort neuronale. Nos résultats ont démontré que l’injection de NMDA induit une activation du nuclear factor κB (NF-κB) dans les cellules de Müller, mais pas dans les CGRs, et que l’utilisation d’inhibiteurs du NF-κB empêche la mort des CGRs. De plus, nous avons montré que les cellules de Müller en réaction à l’activation du NF-κB produisent la protéine TNFα laquelle semble être directement impliquée dans la mort des CGRs par excitotoxicité. Cette mort cellulaire se produit principalement par l’augmentation à la surface des neurones des récepteurs AMPA perméables au Ca2+, un phénomène dépendant du TNFα. Ces donnés révèlent un nouveau mécanisme cellululaire non-autonome par lequel les cellules gliales peuvent exacerber la mort neuronale lors de la mise en jeu de mécanismes excitotoxiques.

Étude des voies de signalisation en amont et en aval de la petite GTPase Rac1

Les évènements moléculaires en amont et en aval de la petite GTPase Rac1 menant à la migration cellulaire sont encore mal compris. La première partie du projet consiste à utiliser une approche protéomique non-biaisée pour tenter d’identifier les partenaires de Rac. Pour ce faire, nous avons développé une méthode de purification efficace et rapide de manière à maintenir les complexes protéiques transitoires intacts. Dans un deuxième temps, nous avons identifié des sites de phosphorylation sur la RacGEF atypique Dock5 en aval des intégrines. Afin de mieux comprendre le rôle de la phosphorylation de cette protéine, nous avons criblé une banque de kinases ce qui nous a permis d’identifier 14 kinases pouvant phosphoryler la région PXXP de Dock5. D’après nos résultats, ceci aurait comme effet de diminuer l’interaction entre Dock5 et ses partenaires contenant des domaines SH3. Ainsi, la phosphorylation de Dock5 régulerait la formation de complexes et le recrutement de Dock5 par des protéines adaptatrices.

Altérations métaboliques et nature des acides gras : implication dans la différenciation des cellules régénératives du tissu adipeux

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques.

Caractérisation d'une famille de récepteurs kinases impliqués dans le développement gamétophytique chez Arabidopsis thaliana

Au cours du développement des végétaux, de l’établissement de l’identité cellulaire des premiers organes au guidage du tube pollinique, la communication cellule à cellule est d’une importance capitale. En réponse, les voies de signalisation moléculaires sont élaborées pour la perception d’un signal extérieur et la transduction en une réponse génique via une cascade intracellulaire. Les récepteurs kinases font partie des protéines perceptrices des stimuli et constituent chez les plantes une catégorie de protéines avec une occurrence considérable, mais dont très peu d’informations détaillées sont disponibles à ce jour. Une famille de récepteurs kinases chez Arabidopsis thaliana, AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11), a été identifiée par orthologie à un récepteur spécifique aux ovaires chez une solanacéee sauvage, Solanum chacoense. La fonction présumée de cette famille de récepteurs kinases de type leucine-rich repeat, suggérée par son patron d’expression, implique les événements relatifs au développement des gamétophytes et à la reproduction. Afin de caractériser la fonction des quatre gènes de la famille (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c et AtORK11d) une stratégie d’analyse de mutants d’insertion de l’ADN-T et d’évaluation du mode d’action par complémentation bimoléculaire par fluorescence (BiFC) a été entreprise. Aucune fonction précise n’a pu être attribuée aux doubles mutants d’insertion, par contre la surexpression d’une construction dominante négative indique un rôle dans le développement gamétophytique. Il a aussi été démontré que les quatre récepteurs peuvent interagir par homodimérisation aussi bien que par hétérodimérisation. Une hypothèse de redondance fonctionnelle est ainsi mise à jour parmi la famille des gènes AtORK11.

Étude des voies d’internalisation de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli dans des lignées cellulaires

L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi. L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb, le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles cellulaires représentatifs des conditions in vivo.

Expression des nétrines dans la rétine de souris adulte

Les nétrines sont une petite famille de protéines de guidage axonal qui peuvent attirer des axones ou en repousser d’autres lors du développement neuronal. Lors du développement de la rétine, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont attirés vers une source de nétrines au niveau du disque optique leur permettant de quitter la rétine et de former le nerf optique. Afin de pouvoir caractériser le rôle des nétrines dans le système visuel adulte, nous avons investigué l’expression des nétrines et leurs récepteurs dans la rétine de souris adulte. Alors qu’aucune expression de la nétrine-1 n’a été détectée dans la rétine adulte, l’expression de la nétrine-3 a été abondamment détectée au niveau des CGR et des cellules amacrines. Nous démontrons aussi que les récepteurs des nétrines sont exprimés dans la rétine adulte. Alors que DCC semble être confiné au niveau des axones des CGR, néogénine est retrouvé dans les dendrites des CGR et des cellules horizontales. Quant aux protéines de la famille des récepteurs homologues à UNC-5, UNC5B a été détecté dans les somas des CGR et UNC5C dans les cellules de Müller. La découverte que nétrine-3 et ses récepteurs sont abondamment exprimés dans plusieurs types cellulaires de la rétine adulte leur suggère un rôle dans le fonctionnement du système visuel mature.

Les effets du lien social et du niveau de défense des ressources sur l’utilisation des tactiques producteur et chapardeur par les diamants mandarins

Plusieurs espèces s’alimentant en groupe ont un comportement correspondant au jeu producteur-chapardeur (P-C). Même si à l’origine ce jeu ne prenait pas en compte plusieurs éléments susceptibles d’être présents dans un groupe social, certaines études récentes suggèrent que des facteurs, notamment le niveau de défense des ressources et les liens sociaux, pourraient affecter ses prédictions. Notre étude avait pour but d’étudier les effets de ces facteurs en exposant des groupes de diamants mandarins à quatre traitements expérimentaux faisant varier la taille du groupe et le degré d’attachement des oiseaux. Notre étude est la première à montrer que le niveau de défense des ressources a un réel effet sur les fréquences d’utilisation des tactiques producteur et chapardeur. De fait, contrairement à ce qui est prédit dans le jeu P-C original, nous avons trouvé que la fréquence des chapardeurs n’augmente pas avec la taille du groupe dans un contexte favorisant la défense des ressources. Par ailleurs, nous n’avons pas trouvé d’effet significatif du lien social sur les fréquences d’utilisation des tactiques. Cependant, nos résultats suggèrent que les liens de couple changent le comportement individuel des sujets en ce qui a trait au chapardage et à l’agressivité : bien que le résultat soit non significatif, les individus chapardent davantage leur partenaire social que les autres membres du groupe, mais avec une agressivité plus faible. Les résultats obtenus sont prometteurs et ouvrent la voie à de nombreuses autres études sur l’effet des liens sociaux et la défense des ressources chez les espèces grégaires.

Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du développement des circuits d’interneurones GABAergiques dans le néocortex : rôle de la molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM)

Les interneurones GABAergiques constituent une population mineure de cellules par rapport aux neurones glutamatergiques dans le néocortex. Cependant ils contrôlent fortement l'excitabilité neuronale, la dynamique des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique. L'importance des circuits GABAergiques dans le processus fonctionnel et la plasticité des réseaux corticaux est soulignée par des résultats récents qui montrent que des modifications très précises et fiables des circuits GABAergiques sont associées à divers troubles du développement neurologique et à des défauts dans les fonctions cérébrales. De ce fait, la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliquant le développement des circuits GABAergiques est la première étape vers une meilleure compréhension de la façon dont les anomalies de ces processus peuvent se produire. La molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM) appartient à la super-famille des immunoglobulines de reconnaissance cellulaire et est impliquée dans des interactions homophiliques et hétérophiliques avec d’autres molécules. Même si plusieurs rôles de NCAM ont été démontrés dans la croissance neuronale, la fasciculation axonale, la formation et la maturation de synapses, de même que dans la plasticité cellulaire de plusieurs systèmes, le rôle de NCAM dans la formation des synapses GABAergiques reste inconnu. Ce projet visait donc à déterminer le rôle précis de NCAM dans le processus de maturation des synapses GABAergiques dans le néocortex, en modulant son expression à différentes étapes du développement. L’approche choisie a été de supprimer NCAM dans des cellules GABAergiques à paniers avant la maturation des synapses (EP12-18), pendant la maturation (EP16-24), ou durant le maintien de celles-ci (EP24-32). Les méthodes utilisées ont été le clonage moléculaire, l’imagerie confocale, la culture de coupes organotypiques et des techniques morphométriques de quantification de l’innervation GABAergique. Nos résultats montrent que l’inactivation de NCAM durant la phase de maturation des synapses périsomatiques (EP16-24) cause une réduction du nombre de synapses GABAergiques périsomatiques et du branchement de ces axones. En revanche, durant la phase de maintien (EP26-32), l’inactivation de NCAM n’a pas affecté ces paramètres des synapses GABAergiques. Or, il existe trois isoformes de NCAM (NCAM120, 140 et 180) qui pourraient jouer des rôles différents dans les divers types cellulaires ou à des stades développementaux différents. Nos données montrent que NCAM120 et 140 sont nécessaires à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Cependant, NCAM180, qui est l’isoforme la plus étudiée et caractérisée, ne semble pas être impliquée dans ce processus. De plus, l’inactivation de NCAM n’a pas affecté la densité des épines dendritiques ou leur longueur. Elle est donc spécifique aux synapses périsomatiques GABAeriques. Finalement, nos résultats suggèrent que le domaine conservé C-terminal KENESKA est essentiel à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Des expériences futures nous aiderons à mieux comprendre la mécanistique et les différentes voies de signalisation impliquées.

Approches algorithmiques pour l’inférence d’histoires de duplication en tandem avec inversions et délétions pour des familles multigéniques

[Français] Une fraction importante des génomes eucaryotes est constituée de Gènes Répétés en Tandem (GRT). Un mécanisme fondamental dans l’évolution des GRT est la recombinaison inégale durant la méiose, entrainant la duplication locale (en tandem) de segments chromosomiques contenant un ou plusieurs gènes adjacents. Différents algorithmes ont été proposés pour inférer une histoire de duplication en tandem pour un cluster de GRT. Cependant, leur utilisation est limitée dans la pratique, car ils ne tiennent pas compte d’autres événements évolutifs pourtant fréquents, comme les inversions, les duplications inversées et les délétions. Cette thèse propose différentes approches algorithmiques permettant d’intégrer ces événements dans le modèle de duplication en tandem classique. Nos contributions sont les suivantes: • Intégrer les inversions dans un modèle de duplication en tandem simple (duplication d’un gène à la fois) et proposer un algorithme exact permettant de calculer le nombre minimal d’inversions s’étant produites dans l’évolution d’un cluster de GRT. • Généraliser ce modèle pour l’étude d’un ensemble de clusters orthologues dans plusieurs espèces. • Proposer un algorithme permettant d’inférer l’histoire évolutive d’un cluster de GRT en tenant compte des duplications en tandem, duplications inversées, inversions et délétions de segments chromosomiques contenant un ou plusieurs gènes adjacents.

Implication des biofilms dans la rhinosinusite chronique et l’évaluation des traitements avec un modèle in vitro

Introduction : La chronicité de la rhinosinusite, sa résistance aux antibiotiques, et ses exacerbations aiguës laissent croire que les biofilms sont impliqués dans la rhinosinusite chronique. Objectifs : Nous avons évalué la capacité des bactéries Pseudomonas aeruginosa, staphylocoques à coagulase négative et Staphylococcus aureus à former des biofilms par un essai in vitro, et si cette capacité de formation a un lien avec l’évolution de la maladie. Nous avons évalué in vitro l’effet de la moxifloxacine, un antibiotique utilisé dans le traitement de la rhinosinusite chronique sur des biofilms matures de Staphylococcus aureus. Méthodes : Trent et une souches bactériennes ont été isolées de 19 patients atteints de rhinosinusite chronique et qui ont subit au moins une chirurgie endoscopique des sinus. L’évolution de la maladie a été notée comme "bonne" ou "mauvaise" selon l’évaluation du clinicien. La production de biofilm a été évaluée grâce à la coloration au crystal violet. Nous avons évalué la viabilité du biofilm après traitement avec la moxifloxacine. Ces résultats ont été confirmés en microscopie confocale à balayage laser et par la coloration au LIVE/DEAD BacLight. Résultat et Conclusion : Vingt deux des 31 souches ont produit un biofilm. La production d’un biofilm plus importante chez Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus était associée à une mauvaise évolution. Ceci suggère un rôle du biofilm dans la pathogenèse de la rhinosinusite chronique. Le traitement avec la moxifloxacine, à une concentration de 1000X la concentration minimale inhibitrice réduit le nombre des bactéries viables de 2 à 2.5 log. Ces concentrations (100 µg/ml - 200 µg/ml) sont faciles à atteindre dans des solutions topiques. Les résultats de notre étude suggèrent que l’utilisation de concentrations supérieure à la concentration minimale inhibitrice sous forme topique peut ouvrir des voies de recherche sur de nouveaux traitements qui peuvent être bénéfiques pour les patients atteints de forme sévère de rhinosinusite chronique surtout après une chirurgie endoscopique des sinus.

Rôle de la protéine phosphatase PPM1A dans l'homéostasie hépatique du glucose et des lipides

L’insuline est une hormone essentielle qui induit des réponses complexes dans l’organisme pour maintenir l’homéostasie du glucose et des lipides. La résistance à son action est un phénomène pathologique observé dans un large éventail de situations, allant de l’obésité et du syndrome métabolique à la stéatose hépatique et au diabète de type 2, qui aboutissent au développement de l’athérosclérose et de la mortalité. Des avancées remarquables ont été réalisées dans notre compréhension des mécanismes moléculaires responsables du développement de la résistance à l’action de l’insuline. En particulier, l’induction d’un stress cellulaire par des taux élevés d’acides gras libres (AGL) et des cytokines, via l’activation des protéines Ser/Thr kinases, qui augmente la phosphorylation sur des résidus sérine, des molécules critiques impliquées dans la signalisation insulinique (p. ex. IR, IRS et p85) et conduit à la diminution de la réponse cellulaire à l’insuline. Cependant, la plupart des chercheurs ont limité leur travail dans l’investigation du rôle des protéines kinases susceptibles de modifier la réponse cellulaire à l’insuline. Donc, peu de données sont disponibles sur le rôle des Protéines Ser/Thr phosphatases (PS/TPs), même si il est bien établi que la phosphorylation de ces protéines est étroitement régulée par un équilibre entre les activités antagonistes des Ser/Thr kinases et des PS/TPs. Parmi les PS/TPS, PPM1A (également connu sous le nom PP2Cα) est une phosphatase particulièrement intéressante puisqu’il a été suggéré qu’elle pourrait jouer un rôle dans la régulation du métabolisme lipidique et du stress cellulaire. Ainsi, en se basant sur des résultats préliminaires de notre laboratoire et des données de la littérature, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle PPM1A pourrait améliorer la sensibilité à l’insuline en diminuant l’activité des protéines kinases qui seraient activées par le stress cellulaire induit par l’augmentation des AGL. Ces effets pourraient finalement améliorer le métabolisme glucidique et lipidique dans l’hépatocyte. Ainsi, pour révéler le rôle physiologique de PPM1A à l’échelle d’un animal entier, nous avons généré un modèle animal qui la surexprime spécifiquement dans le foie. Nous décrivons ici notre travail afin de générer ce modèle animal ainsi que les premières analyses pour caractériser le phénotype de celui-ci. Tout d’abord, nous avons remarqué que la surexpression de PPM1A chez les souris C57BL/6J n’a pas d’effets sur le gain de poids sur une longue période. Deuxièmement, nous avons observé que PPM1A a peu d’effets sur l’homéostasie du glucose. Par contre, nous avons montré que sa surexpression a des effets significatifs sur l’homéostasie du glycogène et des triglycérides. En effet, nous avons observé que le foie des souris transgéniques contient moins de glycogène et de triglycérides que le foie de celles de type sauvage. De plus, nos résultats suggèrent que les effets de la surexpression de PPM1A pourraient refléter son impact sur la synthèse et la sécrétion des lipides hépatiques puisque nous avons observé que sa surexpression conduit à l’augmentation la triglycéridémie chez les souris transgéniques. En conclusion, nos résultats prouvent l’importance de PPM1A comme modulateur de l’homéostasie hépatique du glucose et des lipides. Des analyses supplémentaires restent cependant nécessaires pour confirmer ceux-ci et éclaircir l’impact moléculaire de PPM1A et surtout pour identifier ses substrats.

Élucidation des mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au peptide insulinotropique glucose-dépendant (GIP) dans les tumeurs du cortex de la glande surrénale

Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques.

Trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase chez Saccharomyces cerevisiæ : relation entre biogénèse de la télomérase et homéostasie des télomères

Le contrôle de la longueur des télomères est une étape critique régissant le potentiel réplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problème de fin de réplication, les chromosomes raccourcissent à chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit dans des séquences particulières appelées télomères. La longueur des télomères est en relation directe avec les capacités prolifératives des cellules et est responsable de la limite de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des cancers, la longueur des télomères va être maintenue par une enzyme spécialisée appelée télomérase. Encore aujourd’hui, comprendre la biogénèse de la télomérase et savoir comment elle est régulée reste un élément clé dans la lutte contre le cancer. Depuis la découverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqués dans sa maturation ont été identifiés. Cependant, comment ces facteurs sont intégrés dans le temps et dans l’espace, afin de produire une forme active de la télomérase, est une question restée sans réponse. Dans ce projet, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiæ comme modèle d’étude des voies de biogénèse et de trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase, en condition endogène. La première étape de mon travail fut d’identifier les facteurs requis pour l’assemblage et la localisation de la télomérase aux télomères en utilisant des techniques d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante ARN de la télomérase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition endogène, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggèrent que ce trafic sert de contrôle qualité puisqu’un défaut d’assemblage de la télomérase conduit à son accumulation cytoplasmique et prévient donc sa localisation aux télomères. De plus, nous avons identifié les voies d’import/export nucléaire de cet ARN. Dans une deuxième approche, nous avons réussi à développer une méthode de détection des particules télomérasiques in vivo en utilisant le système MS2-GFP. Notre iv étude montre que contrairement à ce qui a été précédemment décrit, la télomérase n’est pas associée de façon stable aux télomères au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au moment de la réplication des télomères, la télomérase se regroupe en 1 à 3 foci dont certains colocalisent avec les foci télomériques, suggérant que nous visualisons la télomérase active aux télomères in vivo. La délétion des gènes impliqués dans l’activation et le recrutement de la télomérase aux télomères entraine une forte baisse dans l’accumulation des foci d’ARN au sein de la population cellulaire. Nos résultats montrent donc pour la première fois la localisation endogène de l’ARN TLC1 in situ et in vivo et propose une vue intégrée de la biogenèse et du recrutement de la télomérase aux télomères.

Polymorphisme de la capside des papillomavirus appartenant à l’espèce 9 des alphapapillomavirus

Le gène L1 encode pour la protéine majeure de la capside des papillomavirus humains (VPH). L’information relative au polymorphisme de L1 pour les types autres que VPH- 16 est jusqu’ici limitée. Cet ouvrage explore le polymorphisme de L1 en comparant les séquences des types phylogénétiquement apparentés VPH-31, -33, -35 à VPH-16. Des spécimens génitaux recueillis de 732 femmes VIH-séropositives et 323 VIHséronégatives ont été criblés à le recherche d’ADN de VPH par PCR consensus au niveau du gène L1. Les échantillons positifs pour VPH-16 (n=74), -31 (n=74), -33 (n=37) et -35 (n=58) étaient analysés par PCR-séquençage pour la totalité du gène L1. Le nombre de nucléotides substitués pour L1 variait de 19 pour VPH-33 à 52 pour VPH-31. Le rapport du nombre de variantes sur le nombre d’isolats testés était plus élevé pour VPH-31 (56.4%, p=0.05) et VPH-35 (60.3%, p=0.04) comparativement à VPH-16 (40.5%), alors que ce ratio était inférieur pour VPH-33 mais sans différence statistiquement significative (24.3%, p=0.14). La distance entre les variantes était plus grande à l’intérieur des cinq boucles présumément exposées à la surface de la protéine L1 que dans la séquence à l’extérieur (p<0.01) Des variations synonymes étaient observées chez 1.7% (95% CI 1.1- 2.3) des nucléotides intra-boucles et 2.4% (95% CI 1.2-3.7) de ceux extra-boucles. Les variations non-synonymes étaient rencontrées pour 1.8% (95% CI 1.1-2.5) des nucléotides intra-boucles et 0.2% (95% CI 0-0.4) pour les nucléotides extra-boucles. Les ratios dN/dS étaient inférieurs à 1.0 pour les régions extra-boucles et encore davantage pour les régions intra-boucles. Ces résultats suggèrent que les séquences des régions hypervariables de L1 ont été sélectionnées positivement.

Révision taxonomique de la famille des Harrimaniidae (Hemichordata: Enteropneusta) incluant les descriptions de sept espèces de la côte Est du Pacifique

Cette étude comparative est une révision de la famille des Harrimaniidae basée sur les caractères morphologiques d'espèces connues et nouvelles provenant des collections de William E. Ritter, Theodore H. Bullock et Kandula P. Rao rassemblées au cours du 20e siècle. Les descriptions présentées ici portent le total des genres de cinq à neuf par l'ajout de Horstia n. gen., Mesoglossus n. gen., Ritteria n. gen et Saxipendium, un genre auparavant attribué à la famille monospécifique des Saxipendidae. Le nombre d'espèces est porté à 34 par la description de cinq nouvelles espèces du Pacifique oriental: Horstia kincaidi, Mesoglossus intermedius, Mesoglossus macginitiei, Protoglossus mackiei et Ritteria ambigua. La description d'une sixième espèce, Stereobalanus willeyi Ritter et Davis, 1904 (nomen nudum) est présentée ici pour la première fois, ainsi qu'une description abrégée de Saxipendium coronatum. Quatre espèces précédemment attribuées au genre Saccoglossus sont transférées au genre Mesoglossus: M. bournei, M. caraibicus, M. gurneyi, et M. pygmaeus et Saccoglossus borealis est transféré au genre Harrimania. Une hypothèse phylogénétique sur la famille des Harrimaniidae est émise, présentant l'évolution possible des caractères morphologiques au sein du groupe. Finalement, des notes sur la distribution géographique étendue mais discontinue de plusieurs espèces suggère que les entéropneustes auraient pu avoir une distribution ancienne continue et plus grande qui aurait été fragmentée par la suite.