Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.

Molekulare Mechanismen der cAMP-vermittelten Signaltransduktion

Zusammenfassung - Der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert viele fundamentale zelluläre Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Energiemetabolismus und Genexpression. In eukaryotischen Zellen vermittelt die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) die meisten biologischen Funktionen von cAMP. Die PKA besteht aus jeweils zwei regulatorischen (R) und katalytischen (C) Untereinheiten, die zusammen einen inaktiven Holoenzymkomplex bilden, der durch cAMP aktiviert wird. In dieser Arbeit wurde die Bindung von cAMP und cAMP-Analoga an die R Untereinheit der PKA unter funktionellen und mechanistischen Aspekten untersucht. Eine neue, auf Fluoreszenzpolarisation basierende Methode wurde entwickelt, um die Affinität von cAMP-Analoga in einem homogenen Ansatz schnell, reproduzierbar und nicht radioaktiv zu quantifizieren. Zur detaillierten Untersuchung des Bindungsmechanismus von cAMP und cAMP Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden thermodynamische Studien im direkten Vergleich mittels isothermaler Titrationskalorimetrie und kinetischen Analysen (Oberflächenplasmonresonanz, SPR) durchgeführt, wodurch thermodynamische Signaturen für das Bindungsverhalten der Nukleotide an die R Untereinheit der PKA erhalten werden konnten. Durch Interaktionsstudien an mutagenisierten R Untereinheiten wurde der intramolekulare Aktivierungsmechanismus der PKA in Bezug auf cAMP-Bindung, Holoenzymkomplex-Formierung und -Aktivierung untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit zwei Modellen der cAMP-induzierten Konformationsänderung verglichen, und ein Aktivierungsmechanismus postuliert, der auf konservierten hydrophoben Aminosäuren basiert. Für in vivo Untersuchungen wurden zusammen mit Kooperationspartnern membranpermeable, fluoreszierende cAMP Analoga entwickelt, die Einblicke in die Dynamik der cAMP-Verteilung in Zellen erlauben. Neu entwickelte, Festphasen gebundene cAMP-Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden in einem (sub)proteomischen Ansatz dazu genutzt, natürliche Komplexe der R Untereinheit und des PKA-Holoenzyms aus Zelllysaten zu isolieren und zu identifizieren. Diese Untersuchungen fließen letztlich in einem systembiologischen Ansatz zusammen, der neue Einblicke in die vielschichtigen cAMP gesteuerten Netzwerke und Regulationsprozesse erlaubt.

Effects of tillage on processes of organic matter sequestration

To increase the organic matter (OM) content in the soil is one main goal in arable soil management. The adoption of tillage systems with reduced tillage depth and/or frequency (reduced tillage) or of no-tillage was found to increase the concentration of soil OM compared to conventional tillage (CT; ploughing to 20-30 cm). However, the underlying processes are not yet clear and are discussed contradictorily. So far, few investigations were conducted on tillage systems with a shallow tillage depth (minimum tillage = MT; maximum tillage depth of 10 cm). A better understanding of the interactions between MT implementation and changes in OM transformation in soils is essential in order to evaluate the possible contribution of MT to a sustainable management of arable soils. The objectives of the present thesis were (i) to compare OM concentrations, microbial biomass, water-stable aggregates, and particulate OM (POM) between CT and MT soils, (ii) to estimate the temporal variability of water-stable aggregate size classes occurring in the field and the dynamics of macroaggregate (>250 µm) formation and disruption under controlled conditions, (iii) to investigate whether a lower disruption or a higher formation rate accounts for a higher occurrence of macroaggregates under MT compared to CT, (iv) to determine which fraction is the major agent for storing the surplus of OM found under MT compared to CT, and (v) to observe the early OM transformation after residue incorporation in different tillage systems simulated. Two experimental sites (Garte-Süd and Hohes Feld) near Göttingen, Germany, were investigated. Soil type of both sites was a Haplic Luvisol. Since about 40 years, both sites receive MT by a rotary harrow (to 5-8 cm depth) and CT by a plough (to 25 cm depth). Surface soils (0-5 cm) and subsoils (10-20 cm) of two sampling dates (after fallow and directly after tillage) were investigated for concentrations of organic C (Corg) and total N (N), different water-stable aggregate size classes, different density fractions (for the sampling date after fallow only), microbial biomass, and for biochemically stabilized Corg and N (by acid hydrolysis; for the sampling date after tillage only). In addition, two laboratory incubations were performed under controlled conditions: Firstly, MT and CT soils were incubated (28 days at 22°C) as bulk soil and with destroyed macroaggregates in order to estimate the importance of macroaggregates for the physical protection of the very labile OM against mineralization. Secondly, in a microcosm experiment simulating MT and CT systems with soil <250 µm and with 15N and 13C labelled maize straw incorporated to different depths, the mineralization, the formation of new macroaggregates, and the partitioning of the recently added C and N were followed (28 days at 15°C). Forty years of MT regime led to higher concentrations of microbial biomass and of Corg and N compared to CT, especially in the surface soil. After fallow and directly after tillage, a higher proportion of water-stable macroaggregates rich in OM was found in the MT (36% and 66%, respectively) than in the CT (19% and 47%, respectively) surface soils of both sites (data shown are of the site Garte-Süd only). The subsoils followed the same trend. For the sampling date after fallow, no differences in the POM fractions were found but there was more OM associated to the mineral fraction detected in the MT soils. A large temporal variability was observed for the abundance of macroaggregates. In the field and in the microcosm simulations, macroaggregates were found to have a higher formation rate after the incorporation of residues under MT than under CT. Thus, the lower occurrence of macroaggregates in CT soils cannot be attributed to a higher disruption but to a lower formation rate. A higher rate of macroaggregate formation in MT soils may be due to (i) the higher concentrated input of residues in the surface soil and/or (ii) a higher abundance of fungal biomass in contrast to CT soils. Overall, as a location of storage of the surplus of OM detected under MT compared to CT, water-stable macroaggregates were found to play a key role. In the incubation experiment, macroaggregates were not found to protect the very labile OM against mineralization. Anyway, the surplus of OM detected after tillage in the MT soil was biochemically degradable. MT simulations in the microcosm experiment showed a lower specific respiration and a less efficient translocation of recently added residues than the CT simulations. Differences in the early processes of OM translocation between CT and MT simulations were attributed to a higher residue to soil ratio and to a higher proportion of fungal biomass in the MT simulations. Overall, MT was found to have several beneficial effects on the soil structure and on the storage of OM, especially in the surface soil. Furthermore, it was concluded that the high concentration of residues in the surface soil of MT may alter the processes of storage and decomposition of OM. In further investigations, especially analysis of the residue-soil-interface and of effects of the depth of residue incorporation should be emphasised. Moreover, further evidence is needed on differences in the microbial community between CT and MT soils.

Bedeutung der C- und N-Rhizodeposition für das mikrobielle Wachstum und den mikrobiellen Umsatz von C und N in der Rhizosphäre in Abhängigkeit von der Entfernung zur Wurzel

Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung des C und N mit Herkunft aus der Rhizodeposition für das mikrobielle Wachstum und den C- und N-Umsatz in der Rhizosphäre in Abhängigkeit von der Entfernung zur Wurzel zu untersuchen. Dazu wurde als wesentliche methodische Voraussetzung ein künstliches Rhizosphärensystem entwickelt, um die durch die Rhizodeposite induzierten Prozesse an der Grenzfläche zwischen Wurzeloberfläche und Boden zu untersuchen. Dieses eingesetzte Rhizosphärensystem wurde nach einem Vorbild eines in schon vielfältigen Untersuchungen der Rhizosphäre eingesetzten Systems von GAHOONIA und NIELSEN (1991) konzipiert. Zur Verfolgung der pflanzlichen C- und N-Rhizodeposition im Boden wurden 13C- und 15N-Tracer-Isotopen-Techniken zur Isotopenmarkierung der Testpflanzen eingesetzt. Zur Probenahme des Rhizosphärenbodens in räumlichen Abstand zur künstlichen Rhizoplane wurde eine Schneidvorrichtung nach FITZ et al. (2003) eingesetzt, die es ermöglicht frische Bodenproben in definiertem Abstand zur künstlichen Rhizoplane zu schneiden. Das Rhizosphärensystem wurde in 13C- und 15N-Doppelmarkierungsexperimenten mit Lolium perenne, Triticum aestivum und Avena sativa eingesetzt.Das unterschiedliche Ansprechen der mikrobiellen Gemeinschaft auf den Substrateintrag in unterschiedlicher Entfernung zur Wurzel zeigte komplexe Wechselwirkungen in Bezug auf das mikrobielle Wachstum, den mikrobiellen Umsatz, den Substrateintrag aus der Rhizodeposition und den stimulierten Abbau der nativen organischen Bodensubstanz. Der Eintrag von Rhizodepositen stellt daher eine bedeutende Funktion in der Regulation der mikrobiellen Biomasse und der Prozesse des Umsatzes der organischen Bodensubstanz während und wahrscheinlich bis nach der Vegetationsperiode dar. Die simultane Verfolgung von Rhizodepositions-C und -N im Boden und deren Funktionen innerhalb der Rhizosphäre, gerade im Hinblick auf die mikrobielle Biomasse und den Umsatz der organischen Substanz im Boden, führt zu einem besseren Verständnis der komplexen wechselseitigen Prozesse zwischen Pflanze und Boden.

Mikrobielle Nutzung von Ernteresten in Bodensäulen und Litterbags

Die vorliegende Arbeit untersuchte die Einflüsse der Bodenart und Einarbeitungstiefe von Streu auf die mikrobielle Nutzung und ihren Abbau. Anhand einer Kohlenstoffsequestrierung wurde die Verlagerung streubürtigen Kohlenstoffes in die Fraktionen CO2-C, SOC, extrahierbaren Kohlenstoff, Cmik und POM-C betrachtet. Aufgrund der Analyse der δ13C-CO2 Werte der Bodenrespiration, im Rahmen der Sequestrierung des streubürtigen Kohlenstoffes, war der Anteil der streubürtigen Bodenrespiration und somit die gesamte, zu erwartende Bodenrespiration bekannt. Durch die, bei der Kohlenstoffsequestrierung, ermittelten Werte konnte eine Plausibilitätsprüfung an vier Methoden zur Erfassung der Bodenrespiration, auf ihre Genauigkeit und mögliche Artefakte hin, durchgeführt werden. Des Weiteren wurden in einem anschließenden Freilandversuch unter subtropischen Bedingungen die Einflüsse verschiedener Dünger und Feldfrüchte, in Abhängigkeit der Streuqualität, auf den Streuabbau und die mikrobielle Besiedelung hin untersucht. Im ersten Versuch (Kapitel 3), wurde anhand eines Säulenversuches der Einfluss der Einarbeitungstiefe, in Anhängigkeit der Bodenart, auf den Streuabbau untersucht. Dieses ist von großer Bedeutung, da auf landwirtschaftlich genutzten Flächen Streu und so genannte "Grüne Dünger" durch den Einsatz unterschiedlicher Bodenbearbeitungssysteme, wie z.B. der Kreiselegge oder dem Wendepflug, in unterschiedliche Tiefen eingearbeitet werden. Die Verlagerung streubürtigen mikrobiellen Kohlenstoffes per Pilzhyphen, über eine Distanz von bis zu 20 cm wurde innerhalb dieser Arbeit das erste Mal gezeigt. Bisherige Studien zeigten einzig einen Transport von streubürtigem Kohlenstoff per Pilzhyphen, über eine kurze Distanz von der Detritussphäre in den angrenzenden Boden. Der höhere Anteil streubürtigen mikrobiellen Kohlenstoffes innerhalb der von der Streuschicht weiter entfernten Schichten im sandigen Boden, im Vergleich zum lehmigen Boden zeigte, dass das feine Porenvolumen des lehmigen Bodens den Transport Streubürtigen Kohlenstoffes per Pilzhyphen grundsätzlich behindert. Diese Annahme wurde durch die stärkere Abnahme des Anteils streubürtigen mikrobiellen Kohlenstoffes, mit zunehmender Entfernung zur Streuschicht, im lehmigen Boden im Vergleich zum sandigen Boden unterstützt. Es ist davon auszugehen, dass der sandige Boden zusätzlich durch die höhere Porosität eine erhöhte Sauerstoffdurchlässigkeit und somit, in den tieferen Schichten bessere Wachstumsbedingungen für Mikroorganismen bietet als der lehmige Boden. Durch die Ausbreitung substratbürtigen mikrobiellen Kohlenstoffes wurde im sandigen Boden mehr streubürtiger Kohlenstoff durch Mikroorganismen inkorporiert als im lehmigen Boden. Ein weiterer Grund für die geringere Verlagerung von streubürtigem Kohlenstoff in die mikrobielle Biomasse des lehmigen Bodens ist wahrscheinlich der bessere physikalische Schutz durch den höheren Tonanteil. Durch die Einarbeitung der Streu stieg in allen Ansätzen der Gehalt an Ergosterol, welcher ein wesentlicher Indikator für die Präsenz saprotropher Pilze ist. Besonders stark ausgeprägt war der Anstieg des Ergosterolgehaltes, sowie des Ergosterol / mikrobielle Biomasse C – Quotienten, wenn Streu in die untere Schicht (15 - 20 cm) ein-gearbeitet wurde. Diese tiefenspezifischen Unterschiede wurden bisher in noch keinem weiteren Versuch beobachtet und können auf die Entwicklung unterschiedlicher pilzlicher Gemeinschaften zurück zu führen sein. Es ist jedoch wahrscheinlicher, dass pilzliche Nekromasse in den oberen Bodenschichten schneller umgesetzt wird und somit bei der Ergosterolbestimmung nicht mit erfasst wird. Da der Umsatz der pilzlichen Nekromasse im porösen sandigen Boden, aufgrund der höheren Sauerstoffverfügbarkeit und des geringeren physikalischen Schutzes, vermutlich höher ist als im lehmigen Boden, wird diese Annahme durch den im sandigen Boden geringeren Gehalt an mikrobiellen Kohlenstoff unterstützt. Wie erwartet, überstieg die Mineralisation der Streu im sandigen Boden die der im lehmigen Boden. Jedoch anders als erwartet, unterschied sich die Mineralisation in Abhängigkeit der Einarbeitungstiefe, mit einer erhöhten Mineralisation bei Einarbeitung der Streu in 0 - 5 cm Tiefe, einzig im sandigen Boden. Die Berechnung des Ertragskoeffizienten zeigte, dass die Substratsnutzungseffizienz der Mikroorganismen im sandigen Boden signifikant geringer war als die im lehmigen Boden. Die Zugabe von Streu führte in beiden Böden, verstärkt jedoch im lehmigen Boden, zu einem positiven Priming Effekt, der in beiden Bö-den stärker ausgeprägt war, als Streu in 0–5 cm Tiefe eingearbeitet wurde. Trotz Abnahme der SOC-bürtigen mikrobiellen Biomasse stieg die Mineralisation des SOC stark an. Es ist anzunehmen, dass extrazelluläre Enzyme wie Cellulase und Lignin modifizierende Enzy-me, produziert von saprotrophen Pilzen, zum Abbau von Cellolose und Lignin der Streu, zum Teil sehr effizient SOC abbauen. Im zweiten Versuch (Kapitel 4) wurde anhand des gleichen Säulenversuches (Versuch 1; Kapitel 3) der Einfluss der Entfernung von CO2-hot-spots im Boden zur Bodenoberfläche, in Abhängigkeit der Bodenart, auf vier verschiedene Methoden zur Erfassung der Bodenrespiration betrachtet. Zusätzlich wurde durch eine Plausibilitätsprüfung anhand der Kohlenstoffbilanz, basierend auf der in Versuch 1 durchgeführten Kohlenstoffsequestrierung, die Genauigkeit der vier Methoden in Abhängigkeit der Bodenart überprüft. Für beide Ansätze mit sandigem Boden zeigen IR und PAS eine deutliche Überschätzung der mit NaOH und GC bestimmten Bodenrespiration. Die Überschätzung durch IR ist dabei auf die durch die dynamische Haube verursachten Turbulenzen und deren Auswirkungen auf den porösen sandigen Boden zurück zu führen. Bei geringen Respirationsraten, wie bei der Kontrolle, zeigt die Messung mittels IR trotz Turbulenzen, verursacht durch den Ventilator der Haube, keine Überschätzung. Die Überschätzung durch PAS hingegen kann nicht auf Turbulenzen, verursacht durch die dynamische Haube, zurück geführt werden, da bei den Analysen mit PAS und GC identische Hauben, höher und größer als bei IR, eingesetzt wurden und die Bodenrespiration durch GC nicht überschätzt wurde. Im Gegensatz zu beiden sandigen Ansätzen überschätzt IR die Bodenrespiration im lehmigen Boden nicht. NaOH hingegen unterschätzt die Bodenrespiration, wenn Streu in 15-20 cm Tiefe des lehmigen Bodens eingearbeitet ist. Dieses ist dadurch zu erklären, dass, bedingt durch die geringere Porosität sowie das höhere Wasserhaltevermögen und dem daraus resultierenden geringeren Luft gefüllten Porenvolumen, die Diffusion von CO2 im lehmigen Boden langsamer ist als im sandigen Boden. Nach Absorption des CO2 der Haubenluft diffundiert das CO2 des CO2-hot-spots in 15-20 cm Tiefe, entlang des Diffusionsgradienten, aufgrund des Diffusionswiderstandes in lehmigen Boden langsamer zur Oberfläche als im sandigen Boden oder wenn der CO2-hot-spot direkt unter der Bodenoberfläche liegt. Da bei der Messung mit der dynamischen Haube diese nur kurz auf der Fläche verbleibt, beeinflusst der Diffusionsgradient diese Messungen nicht. Hinzukommt, dass bei den Messsystemen, die in Kombination mit der dynamischen Haube eingesetzt werden, im Gegensatz zur Absorption durch Lauge keine CO2 Abreicherung stattfindet und die Diffusion von CO2 aus dem Boden über lange Zeit bis zu hohen CO2 Konzentration in der Haube linear bleibt. Alle drei mit einer dynamischen Haube kombinierten Methoden zeigen mit Korrelations-koeffizienten zwischen 0,90 und 0,93 starke Korrelationen mit NaOH. Während PAS die Bodenrespiration im Verhältnis zu NaOH immer überschätzt, tritt eine Überschätzung durch GC nur bei Mineralisationsraten unter 500 mg m-2 h-1 und für IR bei Mineralisations-raten über 40 mg m-2 h-1 ein. Die Plausibilitätsprüfung zeigt, dass für sandigen Boden, mit NaOH und GC eine sehr exakte Wiederfindung von Kohlenstoff erreicht wird, wohingegen IR und PAS in der Wiederfindung von Kohlenstoff bei deutlich über 100 % liegen. Für den lehmigen Boden hingegen ist nach Entfernung der CO2-hot-spots zur Bodenoberfläche zu differenzieren. Befindet sich der CO2-hot-spot direkt unter der Bodenoberfläche ist die Wiederfindung von Kohlenstoff für NaOH, GC und IR sehr exakt. Befindet sich der CO2-hot-spot jedoch in 15-20 cm Tiefe, ist die Wiederfindung des Kohlenstoffes durch NaOH deutlich unter 100 %. Die Wiederfindung durch PAS liegt sowohl für den sandigen als auch für den lehmigen Boden immer deutlich über 100 %. Im dritten Versuch (Kapitel 5), wurde anhand eines Litterbag-Versuches im Norden des Omans, der Einfluss verschiedener Dünger und Feldfrüchte auf den Abbau von Streu auf landwirtschaftlich genutzten Flächen in Abhängigkeit der Streuqualität betrachtet. Bei dem Großteil bisheriger Streuabbauversuche, unter gemäßigten und subtropischen Klimaten, stand der Abbau von Streu im Wald im Fokus der Betrachtung. Die wenigen Versuche zum Streuabbau auf landwirtschaftlich genutzten Flächen beschränken sich auf die gemäßigten Klimate. Wohingegen der Abbau von Streu, sowie der Einfluss von Dünger und Feldfrucht unter subtropischen Bedingungen, zum ersten mal mit der vorliegenden Arbeit fokussiert wurde. Der Verlust an organischem Material war verglichen mit Versuchen un-ter gemäßigten Klimaten, bei allen vier Streuarten, generell hoch. Der höhere Abbau von Luzernen- und Maisstreu im Vergleich zu Raps- und Weizenstreu ist auf Unterschiede der Streuqualität zurückzuführen. Neben der Verwertbarkeit durch Mikroorganismen beeinflusst die Streuqualität zusätzlich die "Schmackhaftigkeit" der Streu für Organismen der Mesofauna. Wodurch ein selektiver Transport und/oder Grazing von Mikroorganismen stattfindet. Der geringere Abbau der Luzernenstreu verglichen mit Maisstreu jedoch ist nicht auf die Streuqualität sondern auf die geringere mikrobielle Besiedelung der Luzernenstreu während der Versuchszeit zurückzuführen. Der Unterschied im Grad der mikrobiellen Besiedelung kann durch die erhobenen Daten nicht erklärt werden. Es ist jedoch davon auszugehen, dass Leguminosen Substanzen wie z.B. Polyphenole enthalten, welche die mikrobielle Biomasse und im Besonderen die pilzliche Biomasse in beachtlichem Umfang inhibitieren. Ebenso wenig ist der höhere Abbau von Weizenstreu verglichen mit Rapsstreu durch die Streuqualität zu begründen. Eine mögliche Erklärung für den geringeren Abbau der Rapsstreu kann ihr hoher Aluminium Gehalt sein. Es ist jedoch wahrscheinlicher, dass die Rapsstreu organische Substanzen wie Glucosinolate enthält, welche den mikrobiellen Streuabbau inhibitieren. Während der Hemicellulosegehalt am Ende des Versuches nicht durch die Streuqualität beeinflusst war, zeigten Cellulose und Lignin quali-tätsabhängige Effekte. Der stärkere Abbau von Cellulose bei Luzernen- und Maisstreu ist auf den anfänglich höheren Stickstoffgehalt zurückzuführen, wodurch die Produktion und Aktivität von Cellulose degradierenden Enzymen, wie Exo-Cellulase, Endo-Cellulase und Xylanase, anstieg. Es ist davon auszugehen, dass die Differenzen im Celluloseabbau von Luzernen- und Maisstreu im Vergleich zu Raps- und Weizenstreu, neben Unterschieden im anfänglichen Stickstoffgehalt, auf den höheren Schutz von Cellulose durch Lignin in Raps- und Weizenstreu zurückzuführen sind. Während der initial geringe Stickstoffgehalt den Ligninabbau in Raps- und Weizenstreu unterstützt, ist die relative Anreicherung von Lignin in Luzernen- und Maisstreu hingegen auf den initial hohen Stickstoffgehalt zurückzuführen. Dem entgegen hat die Zusammensetzung weiterer Nährstoffe einen sehr geringen Effekt. Es ist jedoch möglich, dass stärkere Effekte durch den Eintrag von Boden in die Litterbags durch Organismen der Mesofauna, Wurzelwachstum oder physikalische Verlagerung überdeckt werden. Während unter organische Düngung, die pilzliche Biomasse ansteigt, fördert der leicht verfügbare Stickstoff der mineralischen Düngung die Bildung bakterieller Biomasse. Der höher Gehalt an pilzlicher Biomasse unter organischer Düngung zeigte keinen generellen Effekt auf den Abbau von Kohlenstoff. Er führte jedoch zu einer Veränderung in der Streuzusammensetzung. Die verringerte Abnahme bzw. verstärkte Zunahme der Nährstoffgehalte bei organischer Düngung ist durch den Eintrag dünger-bürtiger Nährstoffe, im Besonderen durch die verstärkte Bildung pilzlicher Hyphen in die Litterbags hinein, zu erklären. Trotz höherer Gehalte an pilzlicher Biomasse war der Ligningehalt am Ende des Versuches unter organischer Düngung höher als unter mineralischer Düngung. Diese ist auf den Eintrag düngerbürtiger Pilze zurückzuführen, welche eine geringere Lignindegradierungseffizienz aufweisen. Der Einfluss der Feldfrucht auf den Streuabbau äußert sich durch höhere Gehalte mikrobieller und im Besonderen pilzlicher Biomasse, und durch geringere Gehalte an N, P, Ca, Na und K in, im Litterbag verbleiben-der Streu, unter dem Anbau von Mohrrüben. Der Anstieg der pilzlichen Biomasse führt, ebenso wie bei der organischen Düngung zu keinem generellen Anstieg der Kohlenstoffdegradation, zeigt jedoch einen selektiven Effekt auf den Abbau von Cellulose. Der Einfluss, sowohl auf die mikrobielle Biomasse, als auch auf den Nährstoffgehalt, zeigt die Bedeutung der Unterschiede im Wurzelwachstum, der Rhizodeposition sowie des Nährstoffbedarfs in Abhängigkeit der Feldfrucht. Trotz großer Unterschiede der Streuarten im anfänglichen Gehalt mikrobieller Biomasse war dieser am Ende des Versuches für alle Streuarten identisch. Dieses war Folge eines starken Anstiegs der pilzlichen Biomasse bei Luzernen- und Maisstreu sowie einer Abnahme der pilzlichen Biomasse bei Raps- und Weizenstreu, welche zuvor noch nicht beobachtet wurde. Dieses macht den Einfluss der anfänglichen mikrobiellen Biomasse auf deren Entwicklung während des Streuabbauprozesses im Boden deutlich. Es ist anzunehmen, dass ein Teil der anfänglichen pilzlichen Biomasse der Raps- und Weizenstreu, welche sich unter gemäßigten Klimaten entwickelte, unter subtropischen Bedingungen nicht überlebensfähig war. Generell war der Streuabbau durch Pilze dominiert. Es zeigte sich jedoch, dass Unterschiede im Pflanzenmaterial einen Einfluss auf die bakterielle Biomasse hatten, Unterschiede in Düngung und Feldfrucht hingegen die pilzliche Biomasse und die bakterielle Biomasse beeinflussten.

Genetic variation of and environmental effects on inducibility of resistance in tomatoes (Solanum lycopersicum L.) to Phytophthora infestans (Mont) de Bary

Many plant strengtheners are promoted for their supposed effects on nutrient uptake and/or resistance induction (IR). In addition, many organic fertilizers are supposed to enhance plant health and several studies have shown that tomatoes grown organically are more resistant to late blight, caused by Phytophthora infestans to tomatoes grown conventionally. Much is known about the mechanisms underlying IR. In contrast, there is no systematic knowledge about genetic variation for IR. Therefore, the following questions were addressed in the presented dissertation: (i) Is there genetic variation among tomato genotypes for inducibility of resistance to P. infestans? (ii) How do different PS compare with the chemical inducer BABA in their ability to IR? (iii) Does IR interact with the inducer used and different organic fertilizers? A varietal screening showed that contrary to the commonly held belief IR in tomatoes is genotype and isolate specific. These results indicate that it should be possible to select for inducibility of resistance in tomato breeding. However, isolate specificity also suggests that there could be pathogen adaptation. The three tested PS as well as two of the three tested organic fertilisers all induced resistance in the tomatoes. Depending on PS or BABA variety and isolate effects varied. In contrast, there were no variety and isolate specific effects of the fertilisers and no interactions with the PS and fertilisers. This suggests that the different PS should work independent of the soil substrate used. In contrast the results were markedly different when isolate mixtures were used for challenge inoculations. Plants were generally less susceptible to isolate mixtures than to single isolates. In addition, the effectiveness of the PS was greater and more similar to BABA when isolate mixtures were used. The fact that the different PS and BABA differed in their ability to induce resistance in different host genotype -pathogen isolate combinations puts the usefulness of IR as a breeding goal in question. This would result in varieties depending on specific inducers. The results with the isolate mixtures are highly relevant. On the one hand they increase the effectiveness of the resistance inducers. On the other hand, measures that increase the pathogen diversity such as the use of diversified host populations will also increase the overall resistance of the hosts. For organic tomato production the results indicate that it is possible to enhance the tomato growing system with respect to plant health management by using optimal fertilisers, plant strengtheners and any measures that increase system diversity.

Spezifität der quantitativen Resistenz von Blättern und Früchten der Tomate (Lycopersicon ssp. L.) gegenüber Phytophthora infestans (Mont.) de Bary.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Resistenzforschung bei Tomaten gegenüber P. infestans zu leisten, um erste Grundlagen für eine mögliche Züchtungsstrategie auf Basis unterschiedlicher quantitativer Resistenzen zu erarbeiten. Hierzu wurde untersucht, inwieweit unterschiedliche qualitative und quantitative Resistenzen bei Tomatenblättern und -früchten vorliegen, und ob hierfür verantwortliche Mechanismen identifiziert werden können. Zudem wurde untersucht, ob isolatspezifische quantitative Resistenzen identifiziert werden können. Zu diesem Zweck wurde mit einer erweiterten Clusteranalyse, basierend auf einer modifizierten Sanghvi-T2 Distanz, ein statistisches Verfahren entwickelt, welches die Identifikation von quantitativen, isolatspezifischen Resistenzen unter der Berücksichtigung der Variabilität ermöglicht. Des weiteren wurde geprüft, inwieweit zwischen den Resistenzausprägungen auf dem Blatt und den Resistenzausprägungen auf der Frucht ein Zusammenhang besteht und inwieweit die im Labor beobachteten Resistenzen unter Freilandbedingungen eine Rolle spielen. Im Labortest wurde die qualitative und quantitative Blattresistenz von 109 Akzessionen aus elf Lycopersicon und Solanum Arten gegenüber zwölf unterschiedlich aggressiven und teilweise auch unterschiedlich virulenten P. infestans Isolaten untersucht (Kap. 3). Die Früchte von 38 Tomatensorten wurden auf ihre Resistenz gegenüber drei P. infestans Isolaten geprüft. Zusätzlich wurde der Einfluss der Fruchtnachreife auf die Resistenzeigenschaften der Tomatenfrüchte gegenüber P. infestans analysiert (Kap. 4). Insgesamt 40 Sorten wurden auch unter Feldbedingungen auf Blatt- und Fruchtbefall untersucht (Kap. 5). Die frühen Stadien der Infektion von Tomatenblättern mit P. infestans Sporangien wurden mikroskopisch bei acht Tomatensorten mit unterschiedlichen quantitativen Reaktionsprofilen und drei Isolaten untersucht (Kap. 6). Hierzu wurden die Entwicklungsstadien von P. infestans Sporangien nach 24h, 48h und 60h nach der Inokulation auf und im Blatt mit der Calcofluor und der KOH - Anilin Blau Färbung sichtbar gemacht. Das Auftreten und die Lokalisation von H2O2 im Blatt nach 48h und 60h nach der Inokulation in Reaktion auf die Infektion wurde mithilfe einer DAB (3,3′ - Diaminobenzidine) Färbung untersucht. Es wurden einige, z.T. auch wahrscheinlich neue, qualitative Blattresistenzen gegenüber P. infestans gefunden, jedoch war keine der 109 Akzessionen vollständig resistent gegenüber allen Isolaten. Für die quantitative Resistenz von Blättern lagen in vielen Fällen isolatspezifische Unterschiede vor. Die Sorte x Isolat Interaktionen konnten mit Hilfe der erweiterten Clusteranalyse erfolgreich analysiert werden und die Akzessionen in Gruppen mit unterschiedlichen quantitativen Resistenzprofilen bzgl. der Interaktion mit den Isolaten und des Resistenzniveaus eingeteilt werden. Für die Fruchtresistenz konnten keine qualitativen Resistenzen gegenüber den drei getesteten Isolaten gefunden werden. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Tomatensorten in ihrer quantitativen Resistenz und Sorten und Isolate interagierten signifikant. Auch für die Fruchtresistenz konnten Gruppen mit unterschiedlichen quantitativen Reaktionsprofilen gebildet werden. Insgesamt nimmt die Anfälligkeit von Tomatenfrüchten mit zunehmender Reife kontinuierlich und signifikant ab. Unter Laborbedingungen korrelierten nur die Sporulationskapazität der Früchte und der prozentuale Blattbefall. Im Feldversuch über zwei Jahre und mit bis zu 40 Tomatensorten war der Zusammenhang hoch signifikant, jedoch asymptotisch, d.h. bereits bei sehr geringem Blattbefall war der Fruchtbefall sehr hoch. Bei den Tomatenherkünften, die sowohl im Labor als auch im Feld auf ihre Anfälligkeit getestet wurden, erschienen die Blattanfälligkeiten ähnlich, während kein klarer Zusammenhang zwischen der Fruchtanfälligkeit im Feld und im Labor bestand. Die Entwicklung von P. infestans auf der Blattoberfläche war unabhängig von der Sorte. Sowohl beim Eindringen und der Etablierung von P. infestans ins Blatt als auch bei der damit verbunden H2O2 Aktivität im Wirt wurden deutliche isolat- und sortenspezifische Effekte gefunden, die aber nur zum Teil mit den quantitativen Unterschieden der Blattresistenz korrespondierten. Sorten, die bei hoher Resistenz unterschiedliche Reaktionsprofile aufweisen, sind grundsätzlich interessante Kreuzungspartner, um die quantitative Resistenz gegenüber P. infestans zu verbessern. Hier sind vor allem Sorten, die sich auch in ihrer H2O2 Aktivität unterscheiden von Interesse.

Optimierung der aminozucker-spezifischen δ13C-Analyse in Böden- und Pflanzenmaterialien zur Erfassung des Umsatzes von mikrobiellen Residuen

In der vorliegenden Arbeit wurde eine LC-IRMS Methode zur aminozucker-spezifischen δ13C-Analyse in Pflanzenmaterialien optimiert und etabliert, um die Bildung und den Umsatz von mikrobiellen Residuen in Boden- und Pflanzenmaterialien mit hoher Genauigkeit erfassen zu können. Weiterhin wurde mit der etablierten Methode ein Pilzwachstumsexperiment durchgeführt. Der Fokus dieser Arbeit lag jedoch auf der Methodenentwicklung. Ziel des ersten Artikels war es eine HPLC-Umkehrphasen-Methode zur simultanen Bestimmung von Muraminsäure, Mannosamin, Galaktosamin und Glucosamin so hingehend zu verbessern, dass an verschieden HPLC-Systemen zuverlässige Ergebnisse für alle vier Aminozucker in Boden- und Pflanzenhydrolysaten erhalten werden. Dafür wurde zunächst die mobile Phase optimiert. So wurde der Tetrahydrofurananteil erhöht, was kürzere Retentionszeiten und eine bessere Trennung zwischen Muraminsäure und Mannosamin zur Folge hatte. Weiterhin wurde ein höheres Signal durch das Herabsetzen der Extinktionswellenlänge und der Anpassung der OPA-Derivatisierungsreaktionszeit erzielt. Nach Optimierung der genannten Parameter erfolgte die Validierung der Methode. Für Muraminsäure wurde eine Bestimmungsgrenze (LOQ) von 0,5 µmol l-1 was 0,13 µg ml -1 entspricht und für die drei anderen Aminozucker 5,0 µmol l-1 (entspricht 0,90 µg ml)erhalten. Weiterhin wurden Wasser und Phosphatpuffer als Probenlösungsmittel getestet, um den Einfluss des pH-Wertes auf die OPA-Reaktion zu testen. Zur aminozucker-spezifischen δ13C–Analyse am IRMS ist eine HPLC-Methode mit einer kohlenstofffreien mobilen Phase notwendig, andernfalls kann aufgrund des hohen Hintergrundrauschens kein vernünftiges Signal mehr detektiert werden. Da die im ersten Artikel beschriebene Umkehrphasenmethode einen kohlenstoffhaltigen Eluenten enthält, musste eine ebenso zuverlässige Methode, die jedoch keine organische Lösungsmittel benötigt, getestet und mit der schon etablierten Methode verglichen werden. Es gibt eine Reihe von HPLC-Methoden, die ohne organische Lösungsmittel auskommen, wie z. B. (1) Hochleistungsanionenaustauschchromatographie (HPAEC), (2) Hochleistungskationenaustauschchromatographie (HPCEC) und (3) die Hochleistungsanionenausschlusschromatographie (HPEXC). Ziele des zweiten Artikels waren (1) eine zuverlässige Purifikations- und Konzentrierungsmethode für Aminozucker in HCl-Hydrolysaten und (2) eine optimale HPLC-Methode zu finden. Es wurden fünf Aufarbeitungsmethoden zur Purifikation und Konzentrierung der Probenhydrolysate und vier HPLC-Methoden getestet. Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass für Detektoren mit geringer Empfindlichkeit (z.B. IRMS) eine Konzentrierung und Purifikation insbesondere von Muraminsäure über ein Kationenaustauscherharz sinnvoll ist. Eine Basislinientrennung für alle Aminozucker war nur mit der HPAEC möglich. Da mit dieser Methode gute Validierungsdaten erzielt wurden und die Aminozuckergehalte mit der Umkehrphasenmethode vergleichbar waren, stellt die HPAEC die Methode der Wahl zur aminozucker-spezifischen δ13C–Analyse am IRMS dar. Der dritte Artikel befasst sich mit der Optimierung der aminozucker-spezifischen δ13C–Analyse mittels HPAEC-IRMS in Pflanzenhydrolysaten sowie mit der Bestimmung des Umsatzes von saprotrophen Pilzen in verschieden Substraten. Die in der Literatur beschriebene HPAEC-IRMS- Methode ist für die aminozucker-spezifische δ13C–Analyse in Bodenhydrolysaten jedoch nicht in Pflanzenhydrolysaten geeignet. In Pflanzenhydrolysaten wird der Glucosaminpeak von Peaks aus der Matrix interferiert. Folglich war das erste Ziel dieses Artikels, die Methode so zu optimieren, dass eine aminozucker-spezifische δ13C–Analyse in Pflanzenhydrolysaten möglich ist. Weiterhin sollten mit der optimierten HPAEC-IRMS-Methode die Bildung und der Umsatz von saprotrophen Pilzen bestimmt werden. Durch Erhöhung der Säulentemperatur und durch Herabsetzung der NaOH-Konzentration konnte eine Basislinientrennung erzielt werden. Die Validierungsparameter waren gut und die bestimmten Aminozuckergehalte waren mit der Umkehrphasen-HPLC-Methode vergleichbar. Zur Bestimmung der Bildung und des Umsatzes von saprotrophen Pilzen auf verschiedenen Substraten wurden Lentinula edodes P., Pleurotus ostreatus K. und Pleurotus citrinopileatus S. auf Mais-Holz- und auf Weizen-Holz-Substrat für vier Wochen bei 24 °C kultiviert. Dieser Pilzwachstumsversuch zeigte, dass 80% des neu gebildeten pilzlichen Glucusamins maisbürtig und nicht holzbürtig waren. Weiterhin wurde der bevorzugte Abbau von Maissubstrat im Vergleich zu Weizensubstrat an diesem Versuch verdeutlicht. Außerdem lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass die beobachtete zunehmende δ13C Anreicherung in dem neu gebildeten pilzlichen Glucosamin während der vier Wochen auf die Inkorporation des angereichten 13C aus dem Substrat und eher weniger auf kinetische Isotopeneffekte zurückzuführen ist.

Translationskontrolle in der Spermatogenese von Drosophila: Charakterisierung eines regulatorischen mRNP-Komplexes

Während der Spermatogenese von Drosophila werden viele mRNAs zwar vor der Meiose transkribiert, dann aber durch Komplexbildung mit Proteinen stillgelegt und erst am Ende der Spermienentwicklung durch Veränderung desselben für die Translation freigegeben. Ein Beispiel hierfür ist die Mst87F mRNA. Während das cis-agierende Sequenzelement in der RNA seit langem bekannt ist, gestaltete sich die Suche nach den trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen schwierig. In meiner Diplomarbeit (Stinski, 2007) waren mithilfe von präparativen Shift-Experimenten (Auftrennung von RNP-Komplexen im elektrischen Feld) zwei vielversprechende Kandidaten identifiziert worden, die Proteine Exuperantia (Exu) und Purity of Essence (Poe). Ziel der vorliegenden Dissertation war zum einen die Aufklärung der Funktion dieser Kandidatenproteine und zum anderen die Identifizierung weiterer Kandidaten, die an der Komplexbildung und damit an der Regulation beteiligt sind. Dabei war die Hoffnung, sowohl Proteine zu finden, die die Repression vermitteln, als auch solche, die am Ende die Aktivierung ermöglichen. Durch eine Affinitätsreinigung, in der Mst87F-RNA mit einem ms2-Tag versehen über das MS2-Maltose binding protein an eine Amylose-Matrix gebunden und schließlich die Komplexe mit Maltose wieder eluiert wurden, ließen sich erneut das Exu-Protein und drei neue Kandidaten identifizieren: CG3213, CG12470 und CG1898. Das Protein Exu hat eindeutig eine Funktion bei der Translationskontrolle: seine Abwesenheit führt zum Abbau der kontrollierten mRNAs. Die Inkubation mit exu-defizientem Protein-Extrakt (aus Hoden) unterstützt keine RNP-Komplexbildung und aufgereinigtes Exu-His Fusionsprotein kann auch nicht direkt an die Mst87F mRNA binden. Ein exu-defizienter Proteinextrakt lässt sich aber durch die Zugabe von rekombinantem Exu-His komplettieren und es entsteht wieder ein starker mRNP-Komplex. Dies beweist, dass das Experiment im Prinzip korrekt verläuft und dass Exu für die Komplexbildung entscheidend ist. Darüber hinaus konnten durch eine Co-Immunpräzipitation mit dem Exu-GFP Fusionsprotein sowohl interagierende Proteine als auch in die RNP-Komplexe einbezogene mRNAs nachgewiesen werden. Vielversprechende Kandidatenproteine stammen von den Genen CG3213, dfmr1 und CG12470. Die durch cDNA-Synthese in den Komplexen nachgewiesenen mRNAs sind in aller Regel solche, die der Translationskontrolle unterworfen sind. Damit ist gezeigt, dass Exu Teil eines großen Proteinkomplexes ist oder zumindest mit ihm assoziiert ist, der auf viele translationskontrollierte Transkripte Einfluss nimmt. Die Mst87F mRNA wird zum Zeitpunkt der Translationsaktivierung sekundär polyadenyliert, das heißt ihre Länge wird größer und heterogen. In einer Mutante für das Kandidatengen poe wurde diese sekundäre Polyadenylierung plötzlich nicht mehr beobachtet und die RNA blieb auch bei Translationsaktivierung so groß wie in den frühen Stadien. So ergab sich die Möglichkeit, endlich zu prüfen, ob die sekundäre Polyadenylierung für die Translationsaktivierung von essentieller Bedeutung ist. Eine Serie von Fusionskonstrukten mit funktionstüchtigem TCE verhielten sich alle gleich. Die sekundäre Polyadenylierung fand nicht statt, aber das Transkript des Fusionsgens wurde zum richtigen Zeitpunkt translatiert. Somit ist dieser Prozess zumindest nicht generell für eine Translation zu diesem späten Zeitpunkt in der Spermiogenese notwendig. Ein quantitativer Effekt kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnten mit antisense Konstrukten mutante Phänotypen erzeugt werden. Solche Männchen waren ausnahmslos steril, was die Wichtigkeit des Proteins Poe für den Prozess der Spermienreifung belegt. Die Defekte zeigen sich spät während der Individualisierung, was mit der vermuteten Funktion übereinstimmen würde. Das Kandidatenprotein dFMR1 bindet allein an die Mst87F RNA und trägt zur Stärke des beobachtbaren Komplexes bei. Die Komplexbildung zeigt Salzabhängigkeit, wie sie für dFMR1 in anderen Zusammenhängen dokumentiert wurde. Dies unterstützt die obige Aussage und suggeriert, dass dFMR1 die Basis für den Komplexaufbau bildet. Das CPEB-homologe Kandidatenprotein Orb2 bindet ebenfalls allein an die Mst87F mRNA, hat aber keinen Einfluss auf die Repression oder die sekundäre Polyadenylierung. Eine Beteiligung an der Regulation wäre demnach eindeutig unterschiedlich zu der in anderen Fällen dokumentierten Rolle. Die Expression der Kandidatengene CG1898, CG3213 und CG12470 ist konform mit einer unterschiedlichen Beteiligung an der Translationskontrolle. Das erste Protein ist nur in prämeiotischen Stadien, das zweite durchgängig und das dritte nur in postmeiotischen Stadien nachzuweisen, was einer Funktion bei der Stillegung, während der gesamten inaktiven Phase bzw. bei der Aktivierung entsprechen könnte. Die verschiedenen Experimente identifizieren in mehreren Fällen die gleichen Kandidatenproteine und untermauern damit deren Bedeutung. Sie lassen vielfach konkrete Schlüsse auf die Art der Interaktionen zu, welche in einem Schema zusammengefasst werden.

Auswirkung der Rückführung von Kurzumtriebsplantagen in Acker- und Grünlandnutzung auf Boden C-Fraktionen

Bei der Rückführung von Kurzumtriebsplantagen (KUP) in konventionelle landwirtschaftliche Nutzung erfolgt zur Saatbettvorbereitung für die Folgekulturen eine intensive Bodenbearbeitung, um Wurzeln und Erntereste zu zerkleinern und in den Boden einzuarbeiten. Dies erhöht einerseits die Mineralisierung der unter KUP akkumulierten organischen Bodensubstanz (OBS), andererseits werden dem Boden hohe Mengen an Kohlenstoff (C) mit den Ernteresten zugeführt. In dieser Arbeit wurde an den Standorten Georgenhof Pappel, Georgenhof Weide und Wachtum Pappel in einem Feldversuch untersucht, wie sich unterschiedliche Bodenbearbeitungstiefen von 5, 15 und 30 cm während der Rückführung der langjährig bewirtschafteten KUPs in Acker- und Grünlandnutzung auf die C-Dynamik im Boden auswirken. Im Mittelpunkt stand dabei die Überprüfung der Annahme, ob durch eine reduzierte Bodenbearbeitung und eine nachfolgende Grünlandnutzung die Mineralisierung der OBS gemindert werden kann. Die nach der letzten Holzernte auf den Flächen verbliebenen und in den Boden eingearbeiteten oberirdischen Erntereste führten dem Boden, neben der in der zerkleinerten Wurzelbiomasse gespeicherten C-Menge von 1-9 t C ha-1, zusätzlich zwischen 12 und 17 t C ha-1 zu. Der Anstieg der freien, leichten organischen Fraktion des Bodens direkt nach dem Umbruch der Flächen sowie im Zuge der Bodenbearbeitung verfügbar gewordene leicht abbaubare organische Verbindungen, steigerten die mikrobielle Aktivität. Dies führte trotz der intensiven Bodenbearbeitung zu einer Erhöhung des mit Makroaggregaten assoziierten C nach dem Fräsen der Flächen. Die erneute Bodenbearbeitung der Ackerparzellen ein Jahr nach dem Umbruch führte an allen Standorten und in allen Bearbeitungstiefen durch die Zerstörung von Makroaggregaten jedoch zu einer Abnahme des C in dieser Fraktion. Demgegenüber zeigte sich durch die ausbleibende Bodenbearbeitung unter Grünlandnutzung auf beiden Flächen am Georgenhof eine bessere Stabilisierung des C in den Makroaggregaten. Am Standort Wachtum nahm der C in der Makroaggregatfraktion auch unter Grünland ab, da die Aggregierung und somit auch die physikalische Stabilisierung der organischen Substanz in diesem sandigeren Boden gering ist. Dies spiegelte sich in Verlusten von 10% in der leichten organischen Fraktion wider. Die mikrobielle Biomasse nahm innerhalb eines Jahres an allen Standorten ab, verursacht durch die abnehmende Verfügbarkeit der organischen Substanz, was sich in gesunkenen Cmik/Corg Verhältnisse niederschlug. Dennoch hat ein Jahr nach dem Umbruch der KUPs die in den Ernteresten gespeicherte C Menge auf allen Flächen im Zuge des fortschreitenden mikrobiellen Abbaus um bis zu 23 t C ha-1 abgenommen. Da sich keine Änderung in der Gesamtkohlenstoffmenge des Mineralbodens feststellen ließ, wurden mögliche Mineralisationsverluste der OBS durch Abbauprodukte der Erntereste ausgeglichen. Am Standort Georgenhof Weide zeigte sich dabei in den tiefen Fräsvarianten eine geringere Abnahme der in den Ernteresten gespeicherten C-Menge gegenüber den flachen Fräsvarianten. Ebenso deutete ein höheres C/N Verhältnis der Erntereste unter Grünland gegenüber Ackernutzung auf allen drei Flächen auf einen verlangsamten Abbau der Erntereste hin. In einem Inkubationsversuch im Labor wurde das hohe N-Immobilisierungspotential der eingearbeiteten Kronen- und Wurzelreste insbesondere zu Abbaubeginn der Erntereste nachgewiesen. Eine ansteigende N-Immobilisierung nach einer zusätzlichen N-Gabe deutete an, dass eine N-Düngung im Feld möglicherweise erst nach Abbau der leicht verfügbaren Verbindungen der Erntereste empfehlenswert ist. Höhere Ergosterol/Cmik Verhältnisse nach Einarbeitung der Erntereste zeigten den gestiegenen Anteil an saprotrophen Pilzen in der mikrobiellen Gemeinschaft an. Ein Jahr nach der Rückführung der KUPs in landwirtschaftliche Nutzung deuteten die C-Verluste aus den labilen Bodenfraktionen erste Verluste des organischen Kohlenstoffs des Mineralbodens an. Allerdings ließ sich noch kein eindeutiger Einfluss der unterschiedlichen Frästiefen oder Nachnutzungen auf die C-Fraktionen im Mineralboden feststellen, so dass sich im Hinblick auf die anfangs gestellte Annahme einer verringerten C-Mineralisierung durch eine reduzierte Bodenbearbeitung noch keine Aussage treffen lässt.

Untersuchungen zur Biofilmbildung bei dem klinischen Isolat Enterococcus faecalis 1.10

In der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmbildung bei einem klinischen Isolat von Enterococcus faecalis untersucht. Der Prozess der Biofilmbildung ist in mehrere Abschnitte unterteilt und beinhaltet zu Beginn eine Anhaftung von Zellen an Oberflächen. Dieser adhäsive Schritt wird unter anderem durch Pili vermittelt. Pili bei Grampositiven Mikroorganismen sind kovalent mit der Zellwand verknüpfte Proteinstrukturen, die eine Anheftung an biotische und abiotische Oberflächen sowie den Zell-Zell-Kontakt vermitteln. Bei den Analysen dieser Doktorarbeit lag ein besonderes Interesse bei eben diesen Pili, die für Enterococcus faecalis die Namen Ebp (endocarditis and biofilm associated pili) und Bee (biofilm enhancer in enterococci) tragen. Codiert werden sie durch die entsprechenden ebp-/bee-Loci, deren Aufbau unter den Grampositiven Mikroorganismen hochkonserviert ist. Die Loci bestehen aus Pilusuntereinheiten-codierenden Genen und colokalisierten Pilus-spezifischen Sortase Genen. Während in der Regel drei verschiedene Pilusuntereinheiten vorliegen, kann die Anzahl der Sortasen zwischen einer und zwei variieren. Bei den Experimenten wurde neben einer Komplementationsstudie zu einer Bee-Pilus Defekt-Mutante (1.10.16) das Hauptaugenmerk auf die Analyse des zweiten Pilus (Ebp) gelegt, um die Pilisituation bei Isolat 1.10 im Detail darzustellen Zusätzlich sollten weitere Oberflächenassoziierte Proteinstrukturen bei Isolat 1.10 detektiert werden, die gegebenenfalls an der Biofilmbildung beteiligt sind. Weitere Versuche zur Charakterisierung des Bee-Pilus wurden im Laufe dieser Arbeit durchgeführt, blieben jedoch bisher erfolglos. Die Biofilm-/Pilus-Defekt-Mutante 1.10.16 zeigte aufgrund einer Punktmutation (Pm) in der Pilus-spezifischen Sortase 1 des bee-Locus eine geschwächte Fähigkeit zur Anheftung an abiotische Oberflächen, sowie das Fehlen der Bee2 Untereinheit im Pilus. Nach Komplementation der Mutante (1.10.16K) mit dem Wildtyp-srt1 Gen, wurde die starke Biofilmbildungsfähigkeit zurück erlangt. Die Experimente zeigten, dass der Pilus-Defekt auf die Pm im srt1 Gen zurückzuführen war und der Bee-Pilus in Stamm 1.10.16K wieder korrekt gebildet wurde. Zu sehen war dies in Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen und ebenfalls im massenspektrometrischen Nachweis aller 3 Pilusuntereinheiten im Bee-Pilus charakteristischen High-Molecular-Weight Komplex (~ 250 kDa). Durch Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass zwei Gene des ebp-Locus (ebpR und ebpC) bei Isolat 1.10 durch die Insertion von IS-Elementen IS1062 und IS6770 inaktiviert wurden. Der proteinbiochemische Nachweis über Pilusspezifische Antikörper gegen die Untereinheiten des Ebp-Pilus verlief negativ. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die mRNA der beiden inaktivierten Gene nicht gebildet wurde. Dies führte folglich zum vollständigen Verlust des Ebp-Pilus bei Isolat 1.10. Zusammen mit den Ergebnissen der Komplementation konnte somit der große Einfluss mindestens eines intakten Pilus auf die Biofilmbildung gezeigt werden. Sind beide Pili durch Insertionen bzw. Mutationen inaktiviert, kommt es zu einer deutlichen Abnahme der Biofilmbildungsstärke. Dass trotzdem noch ein Biofilm gebildet wurde, zeigt den multifaktoriellen Zusammenhang bzw. Einfluss im Biofilmbildungsprozess. Über das gezielte Markieren von Oberflächenproteinen intakter Zellen mittels der Oberflächenbiotinylierung, konnten in der SDS-PAGE Unterschiede im Bandenmuster im Vergleich zur unbehandelten Probe erkannt werden. Die massenspektrometrische Identifikation dieser Proteine erfolgte bisher nicht, jedoch sind diese vorläufigen Ergebnisse vielversprechender Natur für die Identifikation und Aufklärung der Oberflächenproteinsituation bei Isolat 1.10.

Der Einfluss organischer Düngung auf die mikrobielle Biomasse und deren Residuen in unterschiedlichen Nutzungssystemen

Die Gabe von organischem Dünger beeinflusst die Menge und die Zusammensetzung der organischen Substanz im landwirtschaftlich genutzten Boden. Dies wirkt sich auch auf den Umfang der mikrobiellen Biomasse im Boden und ihrer Gemeinschaftsstruktur aus. Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Untersuchung von mineralischer und organischer Düngung auf die der mikrobiellen Gemeinschaft im Oberboden, Unterboden und unter subtropischen Bedingungen. Der Fokus der Arbeit lag zum einen in der Bestimmung der physiologischen Substratnutzungsdiversität der mikrobiellen Gemeinschaft, zum anderen in der Untersuchung der mikrobiellen Biomasse und deren Residuen nach organischer Düngung. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass das Substratnutzungsmuster der mikrobiellen Gemeinschaft sich signifikant zwischen langfristiger Rottemistdüngung und mineralischer Düngung unterscheidet. Diese Trennung wurde hauptsächlich durch die erhöhte Mineralisation von Kohlenhydraten und Aminosäuren gesteuert. Auch wurden der Boden pH-Wert und der Gehalt an organischer Substanz im Boden als Hauptmechanismen für die Unterscheidung der Düngevarianten identifiziert. Wenn auch die multi-SIR Methode keine Effekte von biodynamischen Präparaten auf die Funktion der mikrobiellen Gemeinschaft zeigen konnte, so war eine Trennung zwischen den Düngeintensitäten bei Rottemistdüngung mit biodynamischen Präparaten und mineralischer Düngung möglich. In Bezug dazu war die multi-SIR Methode empfindlicher, als die Bestimmung der mikrobiellen Biomasse oder des organischen Kohlenstoffs im Boden. Ergänzend dazu wurde der Substratnutzungsdiversitätsindex nach langjähriger mineralischer Düngung gegenüber der Rottemistdüngung verringert. Dies könnte auf eine Verminderung der Bodenfruchtbarkeit hindeuten. Auch wurde untersucht, inwieweit die Düngung mit Rottemist die Speicherung des organischen Materials (SOC und N) im Unterboden, einem weltweit bedeutenden C-Speicher, beeinflusst. Ein steigendes C/N-Verhältnis ging einher mit einer Verringerung der mikrobiellen Residualmasse am gesamten organischen Kohlenstoff mit der Tiefe. Langfristige organische Düngung führte zu einer Erhöhung des Verhältnisses pilzlicher zu bakterieller Residuen im Oberboden und steigerte den Gehalt an bakteriellen Residuen im Unterboden gegenüber mineralischer Düngung. Da keine Steigerung des gesamten organischen Kohlenstoffs im Unterboden vorliegt, kann eine Erhöhung des mikrobiellen Umsatzes im Unterboden bei organischer Düngung vermutet werden. Daneben sank das Verhältnis der pilzlichen zu bakteriellen Residuen von 2,6 im Oberboden auf 2,1 im Unterboden. Weitere Untersuchungen sind hier noch nötig, um die Rolle von mikrobiellen Residuen im Unterboden zu zeigen. Des Weiteren wurden die Auswirkungen von mit Aktivkohle und Tanninen angereichertem Ziegenkot auf die mikrobielle Biomasse, ihre Residuen und des organischem Kohlenstoff im Boden untersucht. Die Applikation der Aktivkohle sowie der Tannine erfolgte als Futterzusatz und direkt auf dem Feld. Nach zweijähriger Versuchsdauer unter subtropischen Bedingungen stieg die mikrobielle Biomasse im Boden nach organischer Düngung am stärksten an, gefolgt von den mikrobiellen Residuen und dem organischen Kohlenstoff. Der Anteil des Ergosterols an der gesamten mikrobiellen Biomasse deutete darauf hin, dass der Boden durch einen hohen Gehalt an saprotrophischen Pilzen gekennzeichnet war. Eine Dominanz der bakteriellen Residualmasse lässt einen schnellen Abbau der pilzlichen Residuen vermuten. Auch hatte die Aktivkohle einen positiven Einfluss auf die organische Bodensubstanz und die Zugabe von Tanninen erhöhte den extrahierbaren Stickstoff im Boden. Doch gab es keine Effekte durch die unterschiedlichen Applikationsmethoden auf dem Versuchsfeld. Es wurde gezeigt, dass die organische Düngung sich positiv auf die Bodenqualität auswirkt. Nicht nur das physiologische Profil der mikrobiellen Gemeinschaft wird verändert, sondern auch die mikrobiellen Residuen im gesamten Bodenprofil (0 – 100 cm) werden durch organische Düngung im Vergleich zur mineralischen Düngung erhöht. Die Rolle der mikrobiellen Biomasse und ihrer Residuen als Anzeiger für die Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur wurde in der vorliegenden Arbeit dargestellt. Dies zeigt einmal mehr, dass diese als Indikator für Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur herangezogen werden können. Speziell in Nutzungssystemen mit einem schnellen Umsatz der organischen Substanz, wie unter ariden subtropischen Bedingungen, bildet die Bestimmung der mikrobiellen Biomasse und ihrer Residuen eine Möglichkeit, die Dynamik der mikrobiellen Biomasse und der organischen Substanz durch Düngung zu dokumentieren.

Vom Biofilm zur planktonischen Lebensform

Im ersten Teil dieser Dissertation stand die Analyse der Motilitätsentwicklung bei Vertretern der Gattung Methylobacterium im Vordergrund. Diese zu den pink pigmentierten fakultativ methylotrophen Mikroorganismen (PPFMs) gehörenden Prokaryoten sind in der Umwelt weit verbreitet. Besonders häufig besiedeln die Mikroben pflanzliche Oberflächen und können als so genannte Phytosymbionten in einer wechselseitigen Beziehung zu pflanzlichen Organismen stehen. In aquatischer Umgebung können Methylobakterien Flagellen aufweisen. Hierbei handelt es sich um spezielle Fortbewegungsorganellen, die den Mikroben eine aktive Beweglichkeit ermöglichen. Die Ausbildung polarer Einzelflagellen bei Methylobacterium-Zellen in planktonischer Lebensweise konnte unter Anwendung verschiedener mikroskopischer Techniken dokumentiert werden. Quantitative Beweglichkeitsstudien zeigten einen charakteristischen Entwicklungsverlauf, korreliert mit den Wachstumsphasen der Bakterienkulturen und machten deutlich, dass die Motilitätsrate durch Umweltfaktoren, wie z. B. die Nährstoffversorgung, beeinflusst werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Pflanzen-assoziierten PPFMs in der Lage sind, zwischen einer sessilen und planktonischen Lebensweise zu wechseln und dass sowohl die zelluläre Beweglichkeit als auch die Biofilm-Bildung der Prokaryoten ein reversibles, reaktivierbares Verhalten darstellt. Weiterhin konnte belegt werden, dass die Motilität der epiphytischen Mikroben bezüglich der Besiedelung von Pflanzen, z. B. bei der Ausbreitung auf Keimblatt-Oberflächen von Sonnenblumen (Helianthus annuus), keine zentrale Rolle spielt und eine endophytische Lebensweise unwahrscheinlich ist. Ziel der Arbeit war weiterhin die Charakterisierung und Identifizierung eines aus der Phyllosphäre der Echten Feige (Ficus carica, Standort Griechenland) isolierten Bakterien-Stammes (Mtb. sp. Fc1). Die fakultativ methylotrophe Stoffwechseleigenschaft, sowie die auffällige rötliche Pigmentierung belegen, dass es sich um einen Vertreter der PPFMs handelt. Die Analyse morphologischer, physiologischer und biochemischer Eigenschaften bestätigte in Übereinstimmung mit molekularphylogenetischen Untersuchungen zur Klassifizierung und taxonomischen Einordnung, dass es sich um Pflanzen-assoziierte Mikroben der Gattung Methylobacterium handelt. Analysen der 16S rDNA sowie partieller Sequenzen der für Methylobakterien etablierten Marker-Gene mxaF und gyrB verdeutlichten die phylogenetische Stellung und die evolutionären Beziehungen des Ficus-Isolates. Obwohl enge Verwandtschaftsverhältnisse zu anderen Methylobacterium-Arten ermittelt werden konnten, war eine Identifizierung als valide beschriebene Spezies nicht möglich. Die Resultate legen den Schluss nahe, dass es sich um eine neue, unbeschriebene Spezies der epiphytisch lebenden Methylobakterien handelt.

Untersuchungen zur Dynamik des Lipid-Metabolismus von Dictyostelium discoideum

Die soziale Waldamöbe Dictystelium discoideum ist ein etablierter Modellorganismus zur Erforschung grundlegender zellbiologischer Prozesse. Innerhalb der letzten Jahre konnte dabei insbesondere das Wissen zum Lipidmetabolismus umfassend erweitert werden. In diesem Zusammenhang spielt besonders eine Enzymgruppe eine wichtige Rolle: die LC/VLC-Acyl-CoA-Synthetasen. Diese übernehmen dabei die Aufgabe Fettsäuren zu aktivieren, um sie so dem Zellmetabolismus überhaupt erst zugänglich zu machen. D. discoideum verfügt über insgesamt vier dieser Enzyme: FcsA, FcsB, FcsC und das Bubblegum-Enzym Acsbg1. Während die FcsA und FcsB bereits in vorangegangenen Arbeiten untersucht wurden, werden die FcsC und die Acsbg1 in dieser Arbeit erstmals biologisch charakterisiert. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation der Proteine zeigen, dass die meisten LC/VLC-Acyl-CoA-Synthetase auf Endosomen und im Cytoplasma gefunden werden können (FcsA, FcsC und Acsbg1), während die FcsB als Transmembranprotein über das ER zu den Peroxisomen transportiert wird. Die Acsbg1 akkumuliert dabei zusätzlich an der Plasmamembran. Funktionell konnte gezeigt werden, dass neben der FcsA auch die Acsbg1 an der Bereitstellung von Acyl-CoA für Triacylglyceridsynthese beteiligt ist. Dabei besitzt die FcsA die Hauptenzymaktivität und kompensiert den Verlust der Acsbg1 in acsbg1- Zellen. In fcsA-/acsbg1- Zellen dagegen kommt der Verlust der Acsbg1 durch eine zusätzliche Verringerung des TAG-Gehaltes der Doppel-KOs im Vergleich zu fcsA- Zellen zum tragen. Alle vier Enzyme beeinflussen die Phagozytose. Dabei zeigen fcsA- und fcsC- Zellen eine gesteigerte Phagozytose in Gegenwart von der gesättigten Fettsäure Palmitinsäure im Kulturmedium. Auch der knockout der Acsbg1 wirkt sich positiv auf die Phagozytoserate aus, jedoch kommt auch nur dieser zum tragen, wenn neben der Acsbg1 auch die FcsA ausgeschaltet wird. Die FcsB dagegen zeigt eine dramatische Reduktion der Partikelaufnahme in nicht Fettsäure gefütterten Zellen. Durch die Zugabe einer exogenen Fettsäure kann dieser Effekt nicht kompensiert werden. Auch der zusätzliche Verlust der FcsA-Enzymaktivität verändert dieses Verhalten in Palmitinsäure inkubierten Zellen nicht. In fcsA-/fcsB- konnte zudem ein Defekt beim Abbau von Triacylglyceriden gefunden werden. Dieser Defekt liefert erste Hinweise für ein Modell, das den Abbau von LD gespeicherten Lipiden durch Autophagozytose in D. discoideum beschreibt. Peroxisomen sind wichtige Organellen für die Detoxifikation und die Oxidation von Fettsäuren. Durch das Ausschalten der Acaa1, der Thiolase, die den letzten Schritt der β-Oxidation in Peroxisomen katalysiert, zeigte sich ein verlangsamter Triacylglycerol-Abbau sowie eine verringerte Degradation des Etherlipids UKL und von Sterolestern, was auf eine Beteiligung der Peroxisomen beim Abbau von langkettigen Fettsäuren schließen lässt. Bei dem Versuch durch das Ausschalten des pex19-Gens eine Zelllinie zu generieren, die keine Peroxisomen besitzt, wurde die Organelle überraschender Weise, wenn auch mit einer vom Wildtyp abweichenden Morphologie, weiterhin vorgefunden. Dieser Befund korrelierte mit dem Resultat, dass trotzdem das pex19-Gen erfolgreich unterbrochen wurde, dennoch eine intakte Kopie des Gens nachgewiesen werden konnte. Dementsprechend sollte die erschaffene pex19- Zelllinie als knockdown und nicht als knockout gewertet werden. Der pex19 knockdown zeigte beim Abbau von Triacylglyceriden eine ähnliche Verlangsamung wie acaa1- Zellen. Zusätzlich wurde eine Verringerung der Synthese des Etherlipids UKL beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Lipid im Peroxisom gebildet wird. Auch die Phagozytose und das Wachstum auf Bakterienrasen waren im pex19 knockdown dramatisch reduziert. Durch die Überexpression von Pex19-GFP im knockdown Hintergrund konnten die physiologischen Defekte in den meisten so generierten Zelllinien ausgeglichen werden. Lipid Droplets sind Organellen, die in Eukaryoten und Prokaryoten als Speicher für Neutralfette dienen und ebenfalls als Ort der Lipidsynthese fungieren. Um diese Aufgaben erfüllen zu können, besitzen sie auf ihrer Oberfläche Proteine, die für die Regulierung dieser Prozesse notwendig sind. Durch die weiterführende Analyse von Kandidatenproteinen, die durch eine proteomische Analyse von aufgereinigten LDs identifiziert wurden, konnte für vier weitere Proteine (Plsc1, Net4, Lip5 und Nsdhl) die LD-Assoziation durch GFP-Fusionsproteine bestätigt werden. Bei der Charakterisierung von plsc1 knockouts zeigte sich eine verminderte Fähigkeit beim Wachstum auf Bakterienrasen sowie eine erhöhte Phagozytoserate in Gegenwart einer exogenen Fettsäure, was auf eine Involvierung des Proteins in die Phospholipidsynthese hindeutet. Die bisher einzige identifizierte LD-assoziierte Lipase Lip5 nimmt nur eine untergeordnete Rolle bei der Hydrolyse von Triacylglycerolen und Sterolestern ein, da in KO-Mutanten nur ein milder Defekt beim Abbau beider Substanzen beobachtet werden konnte. Die LD-Lokalisation von Net4 ist evolutionär konserviert und kann nicht nur in D. discoideum beobachtet werden, sondern auch in humanen Zellen. Welche Funktion das Protein auf der LD-Oberfläche ausübt, konnte nicht geklärt werden. Allerdings kann ein direkter Einfluss auf den TAG- und Sterolaufbau ausgeschlossen werden. LDs stehen in engem Kontakt mit anderen Organellen, die in den Lipidmetabolismus involviert sind, wie mit den Mitochondrien oder dem ER. Durch Perilipin-Hybridproteine können künstliche, stabile Verbindungen zwischen LDs und diesen Organellen hergestellt werden. Dabei zeigte Perilipin ein sehr starkes Targeting-Potenzial, durch welches es notwendig war, als zweite Hybridhälfte ein Transmembranprotein zu wählen. Die Analyse eines Hybrids, das eine dauerhafte Verbindung von LDs und dem ER herstellt, wies dabeieine Reduktion der LD-Größe auf, wobei der Gesamt-TAG-Gehalt der Zellen unbeeinflusst blieb. Durch die starke Affinität von Perilipin für die Assoziation an LDs konnten durch die Generierung von Hybriden andere Proteine an die LD-Oberfläche dirigiert werden. Auf diese Weise konnte erfolgreich die LC-Acyl-CoA-Synthetase FcsA auf das LD transplantiert werden.

Clustering compositional data trajectories

Our essay aims at studying suitable statistical methods for the clustering of compositional data in situations where observations are constituted by trajectories of compositional data, that is, by sequences of composition measurements along a domain. Observed trajectories are known as “functional data” and several methods have been proposed for their analysis. In particular, methods for clustering functional data, known as Functional Cluster Analysis (FCA), have been applied by practitioners and scientists in many fields. To our knowledge, FCA techniques have not been extended to cope with the problem of clustering compositional data trajectories. In order to extend FCA techniques to the analysis of compositional data, FCA clustering techniques have to be adapted by using a suitable compositional algebra. The present work centres on the following question: given a sample of compositional data trajectories, how can we formulate a segmentation procedure giving homogeneous classes? To address this problem we follow the steps described below. First of all we adapt the well-known spline smoothing techniques in order to cope with the smoothing of compositional data trajectories. In fact, an observed curve can be thought of as the sum of a smooth part plus some noise due to measurement errors. Spline smoothing techniques are used to isolate the smooth part of the trajectory: clustering algorithms are then applied to these smooth curves. The second step consists in building suitable metrics for measuring the dissimilarity between trajectories: we propose a metric that accounts for difference in both shape and level, and a metric accounting for differences in shape only. A simulation study is performed in order to evaluate the proposed methodologies, using both hierarchical and partitional clustering algorithm. The quality of the obtained results is assessed by means of several indices