Caracterização da comunidade bacteriana endofítica de citros por isolamento, PCR específico e DGGE

O objetivo deste trabalho foi caracterizar a comunidade bacteriana endofítica de plantas assintomáticas (escapes) e afetadas pela clorose variegada dos citros (CVC) por meio de isolamento em meio de cultura, técnica de gradiente desnaturante em gel de eletroforese (DGGE) e detecção de Methylobacterium mesophilicum e Xyllela fastidiosa por meio de PCR específico, para estudar esta comunidade e sua relação com a ocorrência da CVC. A análise da comunidade bacteriana via DGGE permitiu a detecção de X. fastidiosa, bem como Klebsiella sp. e Acinetobacter sp. como endófitos de citros. Foram observados também Curtobacterium sp., Pseudomonas sp., Enterobacter sp. e Bacillus spp. Utilizando primers específicos, Methylobacterium mesophilicum e X. fastidiosa também foram observadas, reforçando hipóteses de que estas bactérias podem estar interagindo no interior da planta hospedeira.

Leite instável não-ácido e composição do leite de vacas Jersey sob restrição alimentar

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da restrição alimentar na incidência do leite instável não-ácido (LINA) e na composição do leite de vacas Jersey. Foi realizado um experimento piloto de indução ao LINA, com oito vacas Jersey em lactação, confinadas e separadas em dois grupos, às quais havia sido fornecida uma dieta equilibrada ad libitum. Em dois períodos de 18 dias, foram fornecidos dois tratamentos com 100 e 60% das exigências nutricionais. Foram realizados os testes de acidez titulável e do álcool 76%; pH, densidade, crioscopia, caseína, gordura, proteína bruta, lactose, extrato seco total, número de células somáticas e produção de leite foram determinados. A restrição alimentar aumenta a ocorrência de LINA e diminui a produção de leite e a quantidade total dos componentes produzidos; entretanto, não altera os teores dos componentes lácteos.

Desempenho leiteiro de vacas alimentadas com caroço de algodão em dieta à base de palma forrageira

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da inclusão do caroço de algodão em dietas à base de palma forrageira (Opuntia ficus indica Mill.), sobre o desempenho de vacas da raça Holandesa em lactação. O experimento foi feito com cinco vacas, com média de 50 dias de lactação, distribuídas em quadrado latino 5x5. Os tratamentos experimentais foram constituídos da inclusão de caroço de algodão em 0, 6,25, 12,50, 18,75 e 25% da matéria seca da dieta. O caroço de algodão aumentou o consumo de matéria seca, extrato etéreo, nutrientes digestíveis totais, cálcio e fósforo; porém não afetou o consumo de proteína bruta e fibra em detergente neutro. O caroço de algodão aumentou a produção de leite corrigido para 3,5% de gordura (de 26,53 para 31,68 kg por dia), e a produção de gordura do leite (de 0,86 para 1,09 kg por dia); não afetou, porém, a produção de leite sem correção (31,19 kg por dia), a porcentagem de gordura do leite (3,18%) e a eficiência alimentar (1,31 kg de leite corrigido por quilograma de matéria seca consumida). O caroço de algodão melhorou o desempenho animal, quando incluído em até 25% da matéria seca em dietas à base de palma forrageira.

Fontes protéicas e de amido com diferentes degradabilidades ruminais para alimentar vacas leiteiras

O objetivo deste trabalho foi avaliar fontes de amido (milho moído fino x milho processado como pipoca) e fontes protéicas (farelo de soja x uréia x farinha de peixe) com degradabilidades ruminais diferentes para alimentar vacas leiteiras. Foram utilizadas 56 vacas Holandesas com 112 dias em lactação. Os tratamentos foram: MFS (milho moído fino + farelo de soja); PFS (pipoca + farelo de soja); PFP (pipoca + farelo de soja + farinha de peixe); PU (pipoca + farelo de soja + uréia). O tratamento PFS não afetou a produção de leite, mas diminuiu o teor de gordura, a produção de gordura e o teor de proteína do leite. A produção de leite foi maior no tratamento PFS do que nos tratamentos PFP e PU. O tratamento PFP diminuiu o teor de gordura, a produção de gordura e de leite corrigida para 3,5% de gordura, mas aumentou o teor de proteína no leite.

Inestabilidad de la leche asociada a componentes lácteos y estacionalidad en vacas a pastoreo

El objetivo de este trabajo fue caracterizar rebaños lecheros que presentaban muestras de leche positivas a la prueba de alcohol sin estar ácidas, y compararlos con predios negativos a esta prueba, considerándose el efecto de la estacionalidad. Se estudiaron cuatro rebaños (tres positivos a la prueba de alcohol y uno negativo). En dos años, se muestreó leche durante tres meses en lactancias de invierno (época 1) y tres meses en lactancias de verano (época 2). En la dieta, se realizó análisis proximal relativo a EM, Ca, P, Mg y K. En leche, se determinó proteína, lactosa, Ca, P, Mg, K, pH, prueba de alcohol, acidez titulable y actividad proteásica. En casos negativos a la prueba de alcohol, se observó alta correlación entre proteína cruda láctea, proteína cruda en alimento, fósforo lácteo y lactosa. Los predios positivos a la prueba de alcohol se correlacionaron fuertemente con la menor concentración de materia seca y el alto contenido de fibra cruda, además presentaron menor concentración de proteína láctea. Ello indicaría que existió un efecto del manejo alimentario sobre la inestabilidad de la leche. Las lactancias desarrolladas durante la sequía estival sufren de un stress alimenticio, por lo cual podrían presentar inestabilidad láctea.

Perfil de ácidos graxos e estabilidade oxidativa do leite de vacas holandesas alimentadas com soja extrusada e selênio orgânico

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de dieta com alto teor de soja extrusada e selênio orgânico sobre o perfil de ácidos graxos e a estabilidade oxidativa do leite de vacas da raça Holandesa. Vinte e quatro vacas foram divididas em três blocos e distribuídas ao acaso em três tratamentos: dieta controle; dieta com 21% de soja extrusada e dieta com 21% de soja extrusada + 5 mg de selênio orgânico. O experimento teve duração de seis semanas. As vacas alimentadas com soja extrusada produziram leite com menor concentração de ácidos graxos de cadeias curta e média, maior concentração de ácidos graxos de cadeia longa, menor concentração de ácidos graxos saturados e maior concentração de ácidos graxos poliinsaturados e de ácido linoléico conjugado. A suplementação com selênio aumentou a sua concentração no leite e retardou o processo oxidativo do leite. A dieta com 21% de soja extrusada alterou o perfil de ácidos graxos do leite, aumentando sua susceptibilidade à oxidação; o enriquecimento com selênio minimizou esse efeito e influenciou positivamente a estabilidade do leite.

Improved diagnosis of periprosthetic joint infection by multiplex PCR of sonication fluid from removed implants.

The microbiological diagnosis of periprosthetic joint infection (PJI) is crucial for successful antimicrobial treatment. Cultures have limited sensitivity, especially in patients receiving antibiotics. We evaluated the value of multiplex PCR for detection of microbial DNA in sonication fluid from removed orthopedic prostheses. Cases of PJI in which the prosthesis (or part of it) was removed were prospectively included. The removed implant was sonicated, and the resulting sonication fluid was cultured and subjected to multiplex PCR. Of 37 PJI cases (17 hip prostheses, 14 knee prostheses, 4 shoulder prostheses, 1 elbow prosthesis, and 1 ankle prosthesis), pathogens were identified in periprosthetic tissue in 24 (65%) cases, in sonication fluid in 23 (62%) cases, and by multiplex PCR in 29 (78%) cases. The pathogen was detected in 5 cases in sonication fluid only (Propionibacterium acnes in all cases; none of these patients had previously received antibiotics) and in 11 cases by multiplex PCR only (all of these patients had previously received antibiotics). After exclusion of 8 cases caused by P. acnes or Corynebacterium species, which cannot be detected due to the absence of specific primers in the PCR kit, sonication cultures were positive in 17 cases and multiplex PCR sonication cultures were positive in 29 cases (59% versus 100%, respectively; P < 0.01). Among 19 cases (51%) receiving antibiotics, multiplex PCR was positive in all 19 (100%), whereas sonication cultures grew the organism in 8 (42%) (P < 0.01). Multiplex PCR of sonication fluid is a promising test for diagnosis of PJI, particularly in patients who previously received antibiotics. With modified primer sets, multiplex PCR has the potential for further improvement of the diagnosis of PJI.

Concentrações séricas hormonais em vacas azebuadas submetidas à baixa e alta ingestão alimentar

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da ingestão alimentar nas concentrações séricas de hormônios reprodutivos e metabólicos em vacas azebuadas. Dezoito vacas foram divididas em dois grupos: 170% (alta ingestão = A) e 66% (baixa ingestão = B) da dieta de manutenção. Com 21 dias nas dietas experimentais, as vacas tiveram o estro sincronizado. Posteriormente, os ovários foram avaliados por ultra-sonografia transretal e sangue foi coletado diariamente até o dia 7 do ciclo (ovulação = dia 1). Na análise estatística, utilizou-se o teste t. As vacas ganharam 1,1 kg por dia no grupo A e perderam 1,5 kg por dia de PV no grupo B. Apesar de não ter havido diferença entre os grupos no diâmetro máximo do folículo ovulatório, o grupo A apresentou pico pré-ovulatório de estradiol sérico menor. Não foi observada diferença entre os grupos quanto ao volume luteal e concentração sérica de progesterona no dia 7 do ciclo e de FSH, IGF-I e insulina séricos no período peri-ovulatório. As dietas experimentais não alteraram a função ovariana e as concentrações séricas de hormônios reprodutivos e metabólicos, com exceção do estradiol, sugerindo que, no grupo de alta ingestão, ocorreu maior metabolismo desse hormônio.

Combining RT-PCR-seq and RNA-seq to catalog all genic elements encoded in the human genome.

Within the ENCODE Consortium, GENCODE aimed to accurately annotate all protein-coding genes, pseudogenes, and noncoding transcribed loci in the human genome through manual curation and computational methods. Annotated transcript structures were assessed, and less well-supported loci were systematically, experimentally validated. Predicted exon-exon junctions were evaluated by RT-PCR amplification followed by highly multiplexed sequencing readout, a method we called RT-PCR-seq. Seventy-nine percent of all assessed junctions are confirmed by this evaluation procedure, demonstrating the high quality of the GENCODE gene set. RT-PCR-seq was also efficient to screen gene models predicted using the Human Body Map (HBM) RNA-seq data. We validated 73% of these predictions, thus confirming 1168 novel genes, mostly noncoding, which will further complement the GENCODE annotation. Our novel experimental validation pipeline is extremely sensitive, far more than unbiased transcriptome profiling through RNA sequencing, which is becoming the norm. For example, exon-exon junctions unique to GENCODE annotated transcripts are five times more likely to be corroborated with our targeted approach than with extensive large human transcriptome profiling. Data sets such as the HBM and ENCODE RNA-seq data fail sampling of low-expressed transcripts. Our RT-PCR-seq targeted approach also has the advantage of identifying novel exons of known genes, as we discovered unannotated exons in ~11% of assessed introns. We thus estimate that at least 18% of known loci have yet-unannotated exons. Our work demonstrates that the cataloging of all of the genic elements encoded in the human genome will necessitate a coordinated effort between unbiased and targeted approaches, like RNA-seq and RT-PCR-seq.

Rhizosphere bacterial communities of potato cultivars evaluated through PCR-DGGE profiles

The objective of this work was to determine the shifts on the PCR-DGGE profiles of bacterial communities associated to the rhizosphere of potato cultivars, in order to generate baseline information for further studies of environmental risk assessment of genetically modified potato plants. A greenhouse experiment was carried out with five potato cultivars (Achat, Bintje, Agata, Monalisa and Asterix), cultivated in pots containing soil from an integrated system for agroecological production. The experiment was conducted in a split plot randomized block design with five cultivars, three sampling periods and five replicates. Rhizosphere samples were collected in three sampling dates during plant development. DNA of rhizosphere microorganisms was extracted, amplified by PCR using bacterial universal primers, and analyzed through DGGE. Shifts on the rhizosphere bacterial communities associated to rhizosphere of different cultivars were related to both cultivar and plant age. Differences among rhizosphere bacterial communities were clearest at the earliest plant age, tending to decrease in later stages. This variation was detected among bacterial communities of the five tested cultivars. The characterization of soil microbial communities can be part of plant breeding programs to be used on studies of environmental risk assessment of genetically modified potatoes.

Medidas corporales y concentración sérica y folicular de lípidos y glucosa en vacas Brahman fértiles y subfértiles

El objetivo de este estudio fue evaluar las diferencias en las medidas corporales en vacas Brahman fértiles y subfértiles, establecer las diferencias en la concentración de colesterol, lipoproteínas y glucosa en suero y líquido folicular, y desarrollar un modelo para predecir subfertilidad en vacas Brahman a partir de las medidas corporales. Se seleccionaron vacas Brahman registradas, agrupadas en fértiles (15) y subfértiles (15) según historial reproductivo. Se tomaron muestras de suero y líquido folicular (diámetro >8 mm) para determinar colesterol, lipoproteínas, triacilgliceroles y glucosa. Las vacas subfértiles mostraron un fenotipo masculino, con medidas corporales mayores, y concentraciones de colesterol y HDL séricos y foliculares más bajas que las vacas fértiles. El colesterol y el HDL se correlacionaron positivamente entre los compartimientos en ambos grupos. La subfertilidad es más probable en vacas pesadas con hombros amplios y mayor perímetro torácico. El tamaño corporal en vacas Brahman subfértiles se relacionó con su apariencia, con cambios en los metabolitos séricos y foliculares y con las concentraciones de colesterol y HDL.

Exposure to bioaerosols in poultry houses at different stages of fattening: use of real-time PCR for airborne bacterial quantification

Previous studies have demonstrated that poultry-house workers are exposed to very high levels of organic dust and consequently have an increased prevalence of adverse respiratory symptoms. However, the influence of the age of broilers, on bioaerosol concentrations has not been investigated. To evaluate the evolution of bioaerosol concentration during the fattening period, bioaerosol parameters (inhalable dust, endotoxin and bacteria) were measured in 12 poultry confinement buildings in Switzerland, at 3 different stages of the birds' growth; Samples of air taken from within the breathing zones of individual poultry-house employees as they caught the chickens ready to be transported for slaughter, were also analysed. Quantitative PCR (Q-PCR) was used to assess the quantity of total airborne bacteria and total airborne Staphylococcus species. Bioaerosol levels increased significantly during the fattening period of the chickens. During the task of catching mature birds, the mean inhalable dust concentration for a worker was 31 ± 4.7 mg/m3, and endotoxin concentration was 11'080 ± 3436 UE/m3 air, more than ten-fold higher than the Swiss occupational recommended value (1000 UE/m3). The mean exposure level of bird catchers to total bacteria and Staphylococcus species measured by Q-PCR is also very high, respectively reaching values of 72 (± 11) x107 cells/m3 air and 70 (± 16) x106/m3 air. It was concluded that in the absence of wearing protective breathing apparatus, chicken catchers in Switzerland risk exposure beyond recommended limits for all measured bioaerosol parameters. Moreover, the use of Q-PCR to estimate total and specific numbers of airborne bacteria is a promising tool for evaluating any modifications intended to improve the safety of current working practices.

Relação entre características morfológicas e produção de leite em vacas da raça Gir

O objetivo deste trabalho foi determinar parâmetros genéticos relacionados a características morfológicas e suas correlações genéticas com a produção de leite, em vacas da raça Gir. Utilizaram-se 3.805 registros provenientes de 2.142 vacas. O modelo utilizado na análise de características morfológicas continha os efeitos fixos de rebanho, ano e estação de classificação, estádio da lactação e idade da vaca à classificação, além da identificação do classificador. Quanto à produção de leite, foram incluídos no modelo os efeitos fixos de rebanho, ano e estação de parição e idade da vaca ao parto. Os parâmetros genéticos foram obtidos por meio do aplicativo REMLF90. As estimativas de herdabilidade variaram de 0,09 a 0,54. A variabilidade genética aditiva da maioria das características é suficiente para que ganhos genéticos anuais significativos possam ser alcançados com o processo de seleção. As correlações genéticas entre as características morfológicas variaram de baixas a altas e, entre elas e a produção de leite, de baixas a moderadas. Altas correlações genéticas entre algumas características morfológicas implicam a possibilidade de exclusão de algumas delas do programa de melhoramento genético da raça Gir, no Brasil. As correlações genéticas entre produção de leite e algumas características morfológicas indicam que estas podem ser utilizadas na formação de índices de seleção.

Statistical significance of quantitative PCR.

BACKGROUND: PCR has the potential to detect and precisely quantify specific DNA sequences, but it is not yet often used as a fully quantitative method. A number of data collection and processing strategies have been described for the implementation of quantitative PCR. However, they can be experimentally cumbersome, their relative performances have not been evaluated systematically, and they often remain poorly validated statistically and/or experimentally. In this study, we evaluated the performance of known methods, and compared them with newly developed data processing strategies in terms of resolution, precision and robustness. RESULTS: Our results indicate that simple methods that do not rely on the estimation of the efficiency of the PCR amplification may provide reproducible and sensitive data, but that they do not quantify DNA with precision. Other evaluated methods based on sigmoidal or exponential curve fitting were generally of both poor resolution and precision. A statistical analysis of the parameters that influence efficiency indicated that it depends mostly on the selected amplicon and to a lesser extent on the particular biological sample analyzed. Thus, we devised various strategies based on individual or averaged efficiency values, which were used to assess the regulated expression of several genes in response to a growth factor. CONCLUSION: Overall, qPCR data analysis methods differ significantly in their performance, and this analysis identifies methods that provide DNA quantification estimates of high precision, robustness and reliability. These methods allow reliable estimations of relative expression ratio of two-fold or higher, and our analysis provides an estimation of the number of biological samples that have to be analyzed to achieve a given precision.

Improved detection of Rhodococcus coprophilus with a new quantitative PCR assay.

Agricultural practices, such as spreading liquid manure or the utilisation of land as animal pastures, can result in faecal contamination of water resources. Rhodococcus coprophilus is used in microbial source tracking to indicate animal faecal contamination in water. Methods previously described for detecting of R. coprophilus in water were neither sensitive nor specific. Therefore, the aim of this study was to design and validate a new quantitative polymerase chain reaction (qPCR) to improve the detection of R. coprophilus in water. The new PCR assay was based on the R. coprophilus 16S rRNA gene. The validation showed that the new approach was specific and sensitive for deoxyribunucleic acid from target host species. Compared with other PCR assays tested in this study, the detection limit of the new qPCR was between 1 and 3 log lower. The method, including a filtration step, was further validated and successfully used in a field investigation in Switzerland. Our work demonstrated that the new detection method is sensitive and robust to detect R. coprophilus in surface and spring water. Compared with PCR assays that are available in the literature or to the culture-dependent method, the new molecular approach improves the detection of R. coprophilus.