Discrimination of bacteriophage infected cells using locked nucleic acid fluorescent in situ hybridization (LNA-FISH)

Bacteriophage-host interaction studies in biofilm structures are still challenging due to the technical limitations of traditional methods. The aim of this study was to provide a direct fluorescence in situ hybridization (FISH) method based on locked nucleic acid (LNA) probes, which targets the phage replication phase, allowing the study of population dynamics during infection. Bacteriophages specific for two biofilm-forming bacteria, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter, were selected. Four LNA probes were designed and optimized for phage-specific detection and for bacterial counterstaining. To validate the method, LNA-FISH counts were compared with the traditional plaque forming unit (PFU) technique. To visualize the progression of phage infection within a biofilm, colony-biofilms were formed and infected with bacteriophages. A good correlation (r=0.707) was observed between LNA-FISH and PFU techniques. In biofilm structures, LNA-FISH provided a good discrimination of the infected cells and also allowed the assessment of the spatial distribution of infected and non-infected populations.

Genetic and Environmental Effects on the Abdominal Aortic Diameter Development

Abstract Background: Configuration of the abdominal aorta is related to healthy aging and a variety of disorders. Objectives: We aimed to assess heritable and environmental effects on the abdominal aortic diameter. Methods: 114 adult (69 monozygotic, 45 same-sex dizygotic) twin pairs (mean age 43.6 ± 16.3 years) underwent abdominal ultrasound with Esaote MyLab 70X ultrasound machine to visualize the abdominal aorta below the level of the origin of the renal arteries and 1-3 cm above the bifurcation. Results: Age- and sex-adjusted heritability of the abdominal aortic diameter below the level of the origin of the renal arteries was 40% [95% confidence interval (CI), 14 to 67%] and 55% above the aortic bifurcation (95% CI, 45 to 70%). None of the aortic diameters showed common environmental effects, but unshared environmental effects were responsible for 60% and 45% of the traits, respectively. Conclusions: Our analysis documents the moderate heritability and its segment-specific difference of the abdominal aortic diameter. The moderate part of variance was explained by unshared environmental components, emphasizing the importance of lifestyle factors in primary prevention. Further studies in this field may guide future gene-mapping efforts and investigate specific lifestyle factors to prevent abdominal aortic dilatation and its complications.

Empleo de óptica adaptativa y fluorescencia en un oftalmoscopio laser de barrido para el registro de células

Estudio elaborado a partir de una estancia en la Universidad de Rochester, Estados Unidos, de octubre del 2006 a enero del 2007. La estancia realizada en la Universidad de Rochester estuvo orientada al aprendizaje en profundidad del oftalmoscopio láser de barrido. El oftalmoscopio láser de barrido emplea una técnica confocal con la finalidad de visualizar diferentes estructuras retinianas en seres vivos. El instrumento diseñado y desarrollado en el Centro de Ciencias de la Visión incorpora un sistema de óptica adaptativa y fluorescencia. La óptica adaptativa aplicada en este oftalmoscopio tiene como objetivo corregir las aberraciones existentes en el ojo y así permitir observar detalles de la retina que de otra forma se verían emborronados. De esta forma se consigue alcanzar valores de resolución muy cercanos a los impuestos por difracción. Por otro lado el uso de fluorescencia tiene por objetivo el permitir la visualización de células y estructuras que, de no ser teñidas, son transparentes a la luz y visible. Esta técnica se ha estado utilizando principalmente en primates y ratas, aunque actualmente también se están llevando a cabo medidas de células de epitelio pigmentario en seres humanos ya que el pigmento contenido en estas células permite la aplicación de la fluorescencia sin necesidad de utilizar tinción.

Interfaz de usuario para un simulador de redes de Petri coloreadas

Aquest projecte presenta el desenvolupament d'una interficie d'usuari que permet visualitzar i interpretar, en forma de text o en forma gràfica, els resultats de la simulació de models de Xarxes de Petri Acolorides (XPAs). L'estudi de les solucions obtingudes mitjançant la simulació de models de XPAs, permetrà analitzar i evaluar tant el comportament com el rendiment del sistema modelat. La interficie ha estat programada en Visual C++.

High-resolution magnetic resonance imaging quantitatively detects individual pancreatic islets.

OBJECTIVE-We studied whether manganese-enhanced high-field magnetic resonance (MR) imaging (MEHFMRI) could quantitatively detect individual islets in situ and in vivo and evaluate changes in a model of experimental diabetes.RESEARCH DESIGN AND METHODS-Whole pancreata from untreated (n = 3), MnCl(2) and glucose-injected mice (n = 6), and mice injected with either streptozotocin (STZ; n = 4) or citrate buffer (n = 4) were imaged ex vivo for unambiguous evaluation of islets. Exteriorized pancreata of MnCl(2) and glucose-injected mice (n = 6) were imaged in vivo to directly visualize the gland and minimize movements. In all cases, MR images were acquired in a 14.1 Testa scanner and correlated with the corresponding (immuno)histological sections.RESULTS-In ex vivo experiments, MEHFMRI distinguished different pancreatic tissues and evaluated the relative abundance of islets in the pancreata of normoglycemic mice. MEHFMRI also detected a significant decrease in the numerical and volume density of islets in STZ-injected mice. However, in the latter measurements the loss of beta-cells was undervalued under the conditions tested. The experiments on the externalized pancreata confirmed that MEHFMRI could visualize native individual islets in living, anesthetized mice.CONCLUSIONS-Data show that MEHFMRI quantitatively visualizes individual islets in the intact mouse pancreas, both ex vivo and in vivo. Diabetes 60:2853-2860, 2011

Reproducibility of free-breathing cardiovascular magnetic resonance coronary angiography.

OBJECTIVE: Contemporary free-breathing non contrast enhanced cardiovascular magnetic resonance angiography (CMRA) was qualitatively and quantitatively evaluated to ascertain the reproducibility of the method for coronary artery luminal dimension measurements. SUBJECTS AND METHODS: Twenty-two healthy volunteers (mean age 32 +/- 7 years, 12 males) without coronary artery disease were imaged at 2 centers (1 each in Europe and North America) using navigator-gated and corrected SSFP CMRA on a commercial whole body 1.5T System. Repeat images of right (RCA, n = 21), left anterior descending (LAD, n = 14) and left circumflex (LCX, n = 14) coronary arteries were obtained in separate sessions using identical scan protocol and imaging parameters. True visible vessel length, signal-to-noise (SNR), contrast-to-noise ratios (CNR) and the average luminal diameter over the first 4 cm of the vessel were measured. Intra-observer, inter-observer and inter-scan reproducibility of coronary artery luminal diameter were determined using Pearson's correlation, Bland-Altman analysis and intraclass correlation coefficients (ICC). RESULTS: CNR, SNR and the mean length of the RCA, LAD and LCX imaged for original and repeat scans were not significantly different (all p > 0.30). There was a high degree of intra-observer, inter-observer and inter-scan agreements for RCA, LAD and LCX luminal diameter respectively on Bland-Altman and ICC analysis (ICC's for RCA: 0.98. 0.98 and 0.86; LAD: 0.89, 0.89 and 0.63; LCX: 0.95, 0.94 and 0.79). CONCLUSION: In a 2-center study, we demonstrate that free-breathing 3D SSFP CMRA can visualize long continuous segments of coronary vessels with highly reproducible measurements of luminal diameter.

Sistema esteganogràfic per imatges JPEG2000

En este proyecto se implementan tres algoritmos esteganográficos diferentes usando JPEG2000 como portador del mensaje, se calcula el rendimiento de cada uno de ellos y se comparan usando una gráfica. El objetivo es visualizar para unos casos específicos que el algoritmo basado en el producto de dos códigos lineales perfectos tiene mejor rendimiento que el obtenido con algoritmos como el F5 y el LSB.

Subcellular investigation of photosynthesis-driven carbon assimilation in the symbiotic reef coral Pocillopora damicornis.

Reef-building corals form essential, mutualistic endosymbiotic associations with photosynthetic Symbiodinium dinoflagellates, providing their animal host partner with photosynthetically derived nutrients that allow the coral to thrive in oligotrophic waters. However, little is known about the dynamics of these nutritional interactions at the (sub)cellular level. Here, we visualize with submicrometer spatial resolution the carbon and nitrogen fluxes in the intact coral-dinoflagellate association from the reef coral Pocillopora damicornis by combining nanoscale secondary ion mass spectrometry (NanoSIMS) and transmission electron microscopy with pulse-chase isotopic labeling using [(13)C]bicarbonate and [(15)N]nitrate. This allows us to observe that (i) through light-driven photosynthesis, dinoflagellates rapidly assimilate inorganic bicarbonate and nitrate, temporarily storing carbon within lipid droplets and starch granules for remobilization in nighttime, along with carbon and nitrogen incorporation into other subcellular compartments for dinoflagellate growth and maintenance, (ii) carbon-containing photosynthates are translocated to all four coral tissue layers, where they accumulate after only 15 min in coral lipid droplets from the oral gastroderm and within 6 h in glycogen granules from the oral epiderm, and (iii) the translocation of nitrogen-containing photosynthates is delayed by 3 h. IMPORTANCE: Our results provide detailed in situ subcellular visualization of the fate of photosynthesis-derived carbon and nitrogen in the coral-dinoflagellate endosymbiosis. We directly demonstrate that lipid droplets and glycogen granules in the coral tissue are sinks for translocated carbon photosynthates by dinoflagellates and confirm their key role in the trophic interactions within the coral-dinoflagellate association.

Bioinformática: interfaz gráfica para comparación de genomas vía web

El proyecto consiste en un entorno gráfico cuyo fin es el de visualizar, estudiar e interpretar la conservación de código genético existente entre los diferentes genomas. Una interface que permite cargar hasta ocho genomas para ser comparados en detalle, por pares o entre todos ellos a la vez. El gráfico que se muestra en la interfaz, representa los Maximal Unique Matchings entre cada par de genomas, lo que significa coincidencias de la mayor longitud posible no repetidas, en las secuencias de ADN de las especies comparadas. La finalidad es el estudio de las evoluciones que han ido apareciendo entre diferentes organismos o los genes que comparten unas especies con otras.

Desarrollo de una aplicación web para representación de datos de posicionamiento

En aquesta memòria s’explica el desenvolupament d’una eina útil que permet a l’usuari visualitzar en l’aplicació Google Maps les dades de posicionament captats en una sessió GPS. En aquest projecte, hem dissenyat una aplicació Web en la qual recollim les dades ingressades per l’usuari mitjançant un formulari. Un cop emmagatzemades aquestes dades en el servidor, la nostra eina hi executa l’aplicació encarregada del càlcul de les posicions. Aquesta és un script desenvolupat en MATLAB, que s’encarrega d’interpretar les dades subministrades per l’usuari, amb les quals es poden calcular les coordenades captades pel receptor GPS. Una vegada calculades, el software les emmagatzema en el servidor, en un arxiu .xml, que serà el que posteriorment interpretarà Google Maps gràcies al seu API. D’aquesta manera, l’usuari obtindrà el resultat visual de la sessió GPS que hagi decidit carregar sense necessitat des disposar de cap software específic per a la interpretació i el càlcul de les dades que hi ha capturat.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Behavior of endogenous tumor-associated macrophages assessed in vivo using a functionalized nanoparticle.

Tumor-associated macrophages (TAMs) invade the tumor stroma in many cancers, yet their role is incompletely understood. To visualize and better understand these critical cells in tumor progression, we screened a portfolio of rationally selected, injectable agents to image endogenous TAMs ubiquitously in three different cancer models (colon carcinoma, lung adenocarcinoma, and soft tissue sarcoma). AMTA680, a functionally derivatized magneto-fluorescent nanoparticle, labeled a subset of myeloid cells with an "M2" macrophage phenotype, whereas other neighboring cells, including tumor cells and a variety of other leukocytes, remained unlabeled. We further show that AMTA680-labeled endogenous TAMs are not altered and can be tracked noninvasively at different resolutions and using various imaging modalities, e.g., fluorescence molecular tomography, magnetic resonance imaging, and multiphoton and confocal intravital microscopy. Quantitative assessment of TAM distribution and activity in vivo identified that these cells cluster in delimited foci within tumors, show relatively low motility, and extend cytoplasmic protrusions for prolonged physical interactions with neighboring tumor cells. Noninvasive imaging can also be used to monitor TAM-depleting regimen quantitatively. Thus, AMTA680 or related cell-targeting agents represent appropriate injectable vehicles for in vivo analysis of the tumor microenvironment.

3D visualization software to analyze topological outcomes of topoisomerase reactions.

The action of various DNA topoisomerases frequently results in characteristic changes in DNA topology. Important information for understanding mechanistic details of action of these topoisomerases can be provided by investigating the knot types resulting from topoisomerase action on circular DNA forming a particular knot type. Depending on the topological bias of a given topoisomerase reaction, one observes different subsets of knotted products. To establish the character of topological bias, one needs to be aware of all possible topological outcomes of intersegmental passages occurring within a given knot type. However, it is not trivial to systematically enumerate topological outcomes of strand passage from a given knot type. We present here a 3D visualization software (TopoICE-X in KnotPlot) that incorporates topological analysis methods in order to visualize, for example, knots that can be obtained from a given knot by one intersegmental passage. The software has several other options for the topological analysis of mechanisms of action of various topoisomerases.

Conclusions on the measurement of arterial wall thickness: anatomic, physiologic and methodologic considerations

AIM: To discuss the use of new ultrasonic techniques that make it possible to visualize elastic (carotid) and muscular (radial) capacitance arteries non-invasively. RESULTS OF DATA REVIEW: Measurements of carotid wall thickness and the detection of atheromas are related to arterial pressure, to other risk factors and to the risk of subsequent complications. The use of high-frequency ultrasound (7.5-10 MHz), measurements of far wall thicknesses in areas free of atheromas at end-diastole (by ECG gating or pressure waveform recording) and descriptions of the size and characteristics of atherosclerotic plaques allow a non-invasive assessment of vascular hypertrophy and atherosclerosis in hypertensive patients. CONCLUSIONS: Careful attention to methodologic and physiologic factors is needed to provide accurate information about the anatomy of the dynamically pulsating arterial tree.

Defining secretion processes in astrocytes

During the last decade, evidence that release of chemical transmitters from astrocytes might modulate neuronal activity (the so-called "gliotransmission") occurs in situ has been extensively provided. Nevertheless, gliotransmission remains a highly debated topic because of the lack of direct morphological and functional evidence. Here we provided new information supporting gliotransmission, by i) deepen knowledge about specific properties of regulated secretion of glutamatergic SLMVs, and ii) investigating the involvement of astrocytes in the transmission of dopamine, a molecule whose interaction with astrocytes is likely to occur, but it's still not proven.¦VGLUT-expressing glutamatergic SLMVs have been previously identified both in situ and in vitro, but description of kinetics of release were still lacking. To elucidate this issue, we took advantage of fluorescent tools (styryl dyes and pHluorin) and adapted experimental paradigms and analysis methods previously developed to study exo-endocytosis and recycling of glutamatergic vesicles at synapses. Parallel use of EPIfluorescence and total internal reflection (TIRF) imaging allowed us to find that exo-endocytosis processes in astrocytes are extremely fast, with kinetics in the order of milliseconds, able to sustain and follow neuronal signalling at synapses. Also, exocytosis of SLMVs is under the control of fast, localized Ca2+ elevations in close proximity of SLMVs and endoplasmatic reticulum (ER) tubules, the intracellular calcium stores. Such complex organization supports the fast stimulus-secretion coupling we described; localized calcium elevations have been recently observed in astrocytes in situ, suggesting that these functional microdomains might be present in the intact tissue. In the second part of the work, we investigated whether astrocytes possess some of the benchmarks of brain dopaminergic cells. It's been known for years that astrocytes are able to metabolize monoamines by the enzymes MAO and COMT, but to date no clear information that glial cells are able to uptake and store monoamines have been provided. Here, we identified a whole apparatus for the storage, degradation and release of monoamines, at the ultrastructural level. Electron microscopy immunohistochemistry allowed us to visualize VMAT2- and dopamine-positive intracellular compartments within astrocytic processes, i.e. dense -core granules and cisterns. These organelles might be responsible for dopamine release and storage, respectively; interestingly, this intracellular distribution is reminiscent of VMAT2 expression in dendrites if neurons, where dopamine release is tonic and plays a role in the regulation of its a basal levels, suggesting that astrocytic VMAT2 is involved in the homeostasis of dopamine in healthy brains of adult mammals.¦Durant cette dernière décennie, de nombreux résultats sur le relâchement des transmetteurs par les astrocytes pouvant modulé l'activité synaptique (gliotransmission) ont été fournis. Néanmoins, la gliotransmission reste un processus encore très débattu, notamment à cause de l'absence de preuves directes, morphologique et fonctionnelle démontrant ce phénomène. Nous présentons dans nos travaux de nombreux résultats confortant l'hypothèse de la gliotransmission, dont i) une étude approfondie sur les propriétés spatiales et temporelles de la sécrétion régulée du glutamate dans les astrocytes, et ii) une étude sur la participation des astrocytes dans la transmission de la dopamine, une neuromodulateur dont l'interaction avec les astrocytes est fortement probable, mais qui n'a encore jamais été prouvée. L'expression des petites vésicules (SLMVs - Synaptic Like Micro Vesicles) glutamatergiques exprimant les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs) dans les astrocytes a déjà été prouvé tant in situ qu'in vitro. Afin de mettre en évidence les propriétés précises de la sécrétion de ces organelles, nous avons adapté à nos études des méthodes expérimentales conçues pour observer les processus de exocytose et endocytose dans les neurones. Les résolutions spatiale et temporelle obtenues, grâce a l'utilisation en parallèle de l'épi fluorescence et de la fluorescence a onde évanescente (TIRF), nous ont permis de montrer que la sécrétion régulée dans les astrocytes est un processus extrêmement rapide (de l'ordre de la milliseconde) et qu'elle est capable de soutenir et de suivre la transmission de signaux entre neurones. Nous avons également découvert que cette sécrétion a lieu dans des compartiments subcellulaires particuliers où nous observons la présence du reticulum endoplasmique (ER) ainsi que des augmentations rapides de calcium. Cette organisation spatiale complexe pourrait être la base morphologique du couplage rapide entre le stimulus et la sécrétion. Par ailleurs, plusieurs études récentes in vivo semblent confirmer l'existence de ces compartiments. Depuis des années nous savons que les astrocytes sont capables de métaboliser les monoamines par les enzymes MAO et COMT. Nous avons donc fourni de nouvelles preuves concernant la présence d'un appareil de stockage dans les astrocytes participant à la dégradation et la libération de monoamines au niveau ultrastructurelle. Grâce à la microscopie électronique, nous avons découvert la présence de compartiments intracellulaires exprimant VMAT2 dans les processus astrocytaires, sous forme de granules et des citernes. Ces organelles pourraient donc être responsables à la fois du relâchement et du stockage de la dopamine. De manière surprenante, cette distribution intracellulaire est similaire aux dendrites des neurones exprimant VMAT2, où la dopamine est libérée de façon tonique permettant d'agir sur la régulation de ses niveaux de base. Ces résultats, suggèrent une certaine participation des VMAT2 présents dans les astrocytes dans le processus d'homéostase de la dopamine dans le cerveau.¦A de nombreuses reprises, dans des émissions scientifiques ou dans des films, il est avancé que les hommes n'utilisent que 10% du potentiel de leur cerveau. Cette légende provient probablement du fait que les premiers chercheurs ayant décrit les cellules du cerveau entre le XIXème et le XXeme siècle, ont montré que les neurones, les cellules les plus connues et étudiées de cet organe, ne représentent seulement que 10% de la totalité des cellules composant du cerveau. Parmi les 90% restantes, les astrocytes sont sans doute les plus nombreuses. Jusqu'au début des années 90, les astrocytes ont été plutôt considérés peu plus que du tissu conjonctif, ayant comme rôles principaux de maintenir certaines propriétés physiques du cerveau et de fournir un support métabolique (énergie, environnement propre) aux neurones. Grace à la découverte que les astrocytes ont la capacité de relâcher des substances neuro-actives, notamment le glutamate, le rôle des astrocytes dans le fonctionnement cérébral a été récemment reconsidérée.¦Le rôle du glutamate provenant des astrocytes et son impact sur la fonctionnalité des neurones n'a pas encore été totalement élucidé, malgré les nombreuses publications démontrant l'importance de ce phénomène en relation avec différentes fonctions cérébrales. Afin de mieux comprendre comment les astrocytes sont impliqués dans la transmission cérébrale, nous avons étudié les propriétés spatio-temporelles de cette libération grâce à l'utilisation des plusieurs marqueurs fluorescents combinée avec différentes techniques d'imagerie cellulaires. Nous avons découvert que la libération du glutamate par les astrocytes (un processus maintenant appelé "gliotransmission") était très rapide et contrôlée par des augmentations locales de calcium. Nous avons relié ces phénomènes à des domaines fonctionnels subcellulaires morphologiquement adaptés pour ce type de transmission. Plus récemment, nous avons concentré nos études sur un autre transmetteur très important dans le fonctionnement du cerveau : la dopamine. Nos résultats morphologiques semblent indiquer que les astrocytes ont la capacité d'interagir avec ce transmetteur, mais d'une manière différente comparée au glutamate, notamment en terme de rapidité de transmission. Ces résultats suggèrent que le astrocytes ont la capacité de modifier leurs caractéristiques et de s'adapter à leur environnement par rapport aux types de transmetteur avec lequel ils doivent interagir.