994 resultados para signalisation cellulaire
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Les urodles amphibiens, dont fait partie laxolotl (Ambystoma mexicanum), ont la capacit de rgnrer leurs organes et membres suite une amputation, tout au long de leur vie. La patte est lorgane dont le processus de rgnration est le mieux caractris et ce dernier est divis en deux phases principales. La premire est la phase de prparation et commence immdiatement suite lamputation. Elle renferme des tapes essentielles au processus de rgnration comme la gurison de la plaie et la formation dune coiffe apicale ectodermique. Par la suite, les fibroblastes du derme et certaines cellules musculaires vont revenir un tat pluripotent via un processus appel ddiffrenciation cellulaire. Une fois ddiffrencies, ces cellules migrent et saccumulent sous la coiffe apicale pour former le blastme. Lors de la phase de redveloppement, les cellules du blastme se divisent puis se rediffrencient pour rgnrer la partie ampute. Fait intressant, la rgnration dun membre ou la gurison dune plaie chez laxolotl ne mne jamais la formation dune cicatrice. Afin den apprendre plus sur le contrle molculaire de la rgnration, les gnes Heat-shock protein-70 (Hsp-70) et Transforming growth factor-1 (Tgf-1) ont t slectionns. Ces gnes jouent un rle important dans la rponse au stress et lors de la gurison des plaies chez les mammifres. HSP-70 est une chaperonne molculaire qui est produite pour maintenir lintgrit des protines cellulaires lorsquun stress se prsente. TGF-1 est une cytokine produite suite une blessure qui active la rponse inflammatoire et qui stimule la fermeture de la plaie chez les amniotes. Les rsultats prsents dans cette thse dmontrent que Hsp-70 est exprim et rgul lors du dveloppement et de la rgnration du membre chez laxolotl. Dautre part, nos expriences ont men lisolation de la squence codante pour Tgf-1 chez laxolotl. Nos rsultats montrent que Tgf-1 est exprim spcifiquement lors de la phase de prparation dans le membre en rgnration. De plus, le blocage de la voie des Tgf- avec linhibiteur pharmacologique SB-431542, lors de la rgnration, mne linhibition du processus. Ceci dmontre que la signalisation via la voie des Tgf- est essentielle la rgnration du membre chez laxolotl.
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Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de rcepteurs membranaires impliqus dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique lactivation dune protine G htro-trimrique qui pourra son tour moduler lactivit de divers effecteurs intracellulaires. Ce schma classique de signalisation sest complexifi au fils des annes et lon sait maintenant quen plus dinteragir avec les protines G, les RCPGs sassocient avec une panoplie dautres protines afin de transmettre adquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la dcouverte dune famille de protines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptises protines modifiant lactivit des rcepteurs ( receptor activity-modifying proteins ; RAMPs), a chang la faon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du rcepteur similaire au rcepteur de la calcitonine ( calcitonin-like receptor ; CLR), lassociation avec les RAMPs permet lacheminement la surface cellulaire du rcepteur tout en modulant ses proprits pharmacologiques. Lorsquil est associ avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un rcepteur du peptide reli au gne de la calcitonine ( calcitonin gene-related peptide ; CGRP), alors quil devient un rcepteur de ladrnomedulline lorsquil interagit avec RAMP2 ou RAMP3. Dautre part, en plus dinteragir avec des protines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi sassocier entre eux pour former des oligomres de rcepteurs. Dans cette thse, nous nous sommes penchs sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulirement sur linterrelation entre ce type dassociation RCPG/RAMP et lassemblage en oligomres de rcepteurs, en utilisant le rcepteur du CGRP comme modle dtude. Une premire tude nous a tout dabord permis de confirmer linteraction entre le rcepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons dmontr que ce complexe CLR/RAMP1 active la protine G et recrute la protine de signalisation -arrestine suite une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons dtermin que mme sil doit obligatoirement former un htro-oligomre avec les RAMPs pour tre actif, le CLR conserve malgr tout sa capacit interagir avec dautres RCPGs. En plus dobserver la prsence dhomo-oligomre de CLR, nous avons constat que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi sassocier entre eux pour former des complexes oligomriques pouvant comprendre diffrents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la prsence dhomo-oligomres de CLR et de RAMP1, nous a amen nous questionner sur la stchiomtrie dinteraction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxime tude ayant pour but dtablir la composition molculaire du rcepteur CGRP1 in vivo, nous avons dvelopp une nouvelle approche permettant ltude de linteraction entre trois protines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptise BRET/BiFC, est base sur le transfert dnergie de rsonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla lucifrase, et un accepteur fluorescent, la protine fluorescente jaune (YFP), reconstitue suite au r-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu dterminer que le rcepteur CGRP1 est constitu dun homo-oligomre de CLR interagissant avec un monomre de RAMP1. En dmontrant un assemblage oligomrique asymtrique pour le rcepteur CGRP1 partir dune nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux prsents dans cette thse ont contribu largir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile la poursuite des recherches sur les complexes protiques impliqus dans la signalisation.
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Les opiodes sont les analgsiques les plus efficaces mais leur utilisation est limite par la tolrance, un processus li en partie la dsensibilisation des rcepteurs. Le rle de la prsente tude tait de mieux caractriser le processus de dsensibilisation des rcepteurs et plus particulirement, dtudier le rle de la tyrosine kinase Src sur la rgulation de la signalisation des rcepteurs delta opiodes. Nos rsultats dmontrent que linhibition pharmacologique avec PP2 ( faible concentration : 20- 40M) ou encore linhibition molculaire de la kinase avec de faibles concentrations dADN dun mutant dominant inactif de Src (0,2g/ml) potentialise lamplitude et la dure de lactivation de la cascade ERK lorsquun agoniste, DPDPE (1M; 5 min), se lie aux rcepteurs. Nous avons galement dmontr que de fortes concentrations dinhibiteurs de Src (80 et 100M de PP2 ou 1g/ml dADN du mutant dominant ngatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par lagoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur lactivit de ERK : linhibition complte de Src inhibe lactivit de la cascade MAPK alors quune inhibition modre potentialise cette mme cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfrent avec lactivation de ERK alors que de faibles concentrations interfrent avec la dsensibilisation des rcepteurs. Cette possibilit a t teste laide dessais daccumulation dAMPc qui visaient valuer leffet des bloqueurs de Src (PP2, 20 M; 1h) sur la dsensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production dAMPc, pralablement stimule par du forskolin, de faon dose-dpendante. Le maximum d'inhibition observ est de 61%, mais lors dun prtraitement au DPDPE (1 M, 30 min) linhibition maximale est rduite 72% de linhibition initiale observe. Cependant, un prtraitement des cellules au PP2 (20M pendant 1 heure) avant deffectuer la dsensibilisation protge contre cette dsensibilisation. Leffet protecteur des bloqueurs de Src nentrane pas de changement au niveau de linternalisation des DOR mais laltration de leur internalisation via un mutant tronqu du DOR ou via un milieu sucr hypertonique (0.4M de saccharose) rduit cette protection. Ces donnes suggrent alors que linternalisation optimale du rcepteur est ncessaire pour que leffet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue la dsensibilisation de DOR aprs que linternalisation du DOR soit survenue.
Brain tumor and brain endothelial cells' response to ionizing radiation and phytochemical treatments
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Le glioblastome multiforme (GBM) reprsente la tumeur crbrale primaire la plus agressive et la plus vascularise chez ladulte. La survie mdiane aprs le diagnostic est de moins dun an en labsence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traits avec de la radiothrapie aprs la rsection chirurgicale dun GBM dveloppent une rcidive tumorale. Rcemment, le traitement des GBM avec radiothrapie et tmozolomide, un agent reconnu pour ses proprits antiangiogniques, a permis de prolonger la survie mdiane 14,6 mois. Des efforts sont dploys pour identifier des substances naturelles capables dinhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogense. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphnol retrouv dans le th vert, est reconnu pour ses proprits anticancreuses et antiangiogniques. LEGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales crbrales et les cellules endothliales drives des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II dcrit la premire partie de ce projet de doctorat. Nous avons tent de dterminer si lEGCG pourrait sensibiliser la rponse des GBM lirradiation (IR) et si des marqueurs molculaires spcifiques sont impliqus. Nous avons document que les cellules U-87 taient relativement radiorsistantes et que Survivin, une protine inhibitrice de lapoptose, pourrait tre implique dans la radiorsistance des GBM. Aussi, nous avons dmontr que le pr-traitement des cellules U-87 avec de lEGCG pourrait annuler leffet cytoprotecteur dune surexpression de Survivin et potentialiser leffet cytorducteur de lIR. Au chapitre III, nous avons caractris limpact de lIR sur la survie de cellules endothliales microvasculaires crbrales humaines (HBMEC) et nous avons dtermin si lEGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec lEGCG et lIR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combin diminuait de faon synergique la survie cellulaire. Nous avons document que le traitement combin augmentait la mort cellulaire, plus spcifiquement la ncrose. Au chapitre IV, nous avons investigu limpact de lIR sur les fonctions angiogniques des HBMEC rsistantes lIR, notamment la prolifration cellulaire, la migration cellulaire en prsence de facteurs de croissance drivs des tumeurs crbrales, et la capacit de tubulogense. La voie de signalisation des Rho a aussi t tudie en relation avec les proprits angiogniques des HBMEC radiorsistantes. Nos donnes suggrent que lIR altre significativement les proprits angiogniques des HBMEC. La rponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et langiogense ainsi que la tubulogense sont attnues dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les proprits cytorductrices de lIR sur les gliomes malins et propose un nouveau mcanisme pour expliquer la radiorsistance des GBM. Ce projet documente pour la premire fois leffet cytotoxique de lIR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnat lexistence de HBMEC radiorsistantes et caractrise leurs fonctions angiogniques altres. La combinaison de molcules naturelles anticancreuses et antiangiogniques telles que lEGCG avec de la radiothrapie pourrait amliorer leffet de lIR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothliales associes, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thse supporte lintgration de nutriments avec proprits anticancreuses et antiangiogniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothliales aux traitements conventionnels.
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La mort cellulaire programme (PCD pour Programmed Cell Death) est un processus essentiel aux cellules. Le PCD a dabord t caractris dans le dveloppement cellulaire et peut tre divis en plusieurs groupes selon les caractristiques observes. Lapoptose, un sous-groupe du PCD, est caractris par plusieurs distinctions morphologiques et signaltiques attribu tout dabord aux organismes complexes pour son rle dans le dveloppement et dans le maintien de lintgrit tissulaire. Depuis la dernire dcennie, de nombreuses tudes font tat de lexistence dun programme apoptotique dans des organismes unicellulaires comme les levures. Ce programme apoptotique a surtout t tudi chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe et partage certaines caractristiques avec lapoptose des mammifres. Par contre, lapoptose associ aux levures est distinct certains gards entre autre par labsence de certains homologues prsents chez les mammifres. Lintrt au niveau de ltude du phnomne apoptotique chez les levures est sans cesse grandissant par la facilit avec laquelle les levures peuvent tre utilises comme systme modle. Lapoptose peut tre induit dans les cellules de diffrentes faons en rponse des stimuli internes ou externes. Laccumulation de protines mal replies au niveau du rticulum endoplasmique (RE) causant un stress est un inducteur bien caractris de la voie apoptotique. La signalisation de lapoptose dans un cas de stress au RE fait appel aux transducteurs des signaux de la voie du UPR ( Unfolded Protein Response). Rcemment, il a t montr que la calnexine, une chaperone transmembranaire du RE connue et caractrise surtout pour ses fonctions daide au repliement des protines et au contrle de qualit, joue un rle dans la transduction du signal apoptotique en rponse au stress du RE chez mammifres. Le rle de la calnexine dans ce cas consiste principalement en lchafaudage pour le clivage par la caspase 8 de la protine apoptotique Bap31. Nous avons tout dabord dmontr que le stress du RE et que la dficience en inositol, un prcurseur essentiel de nombreuses molcules signaltiques, sont deux inducteurs de lapoptose chez la levure S. pombe. Ces deux voies semblent induire lapoptose par deux voies distinctes puisque seule la voie de la dficience en inositol induit lapoptose de faon dpendante la mtacaspase Pca1p. La calnexine, essentielle la viabilit chez la levure S. pombe, est implique dans ces deux phnomnes apoptotiques. Lapoptose induit par le stress du RE ncessite une version de la calnexine ancre la membrane du RE pour tre optimal. De faon oppose, lapoptose induit par une dficience en inositol ncessite la prsence de la queue cytosolique ancre la membrane de la calnexine pour tre retard. Ces deux actions diffrentes imputables une mme protine laisse croire une double fonction pro et anti-apoptotique de celle-ci. Suite la dcouverte de lexistence dun clivage endogne de la calnexine en situation normale de croissance, un modle a t labor expliquant les rles distincts de la calnexine dans ces deux voies apoptotiques. Ce modle fait tat dun rle associ au clivage de la calnexine dans lapoptose.
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Il est reconnu, depuis une centaine dannes, que des dsordres de la coagulation, regroups sous le terme de coagulopathies, sont souvent associs au dveloppement noplasique. Pendant de nombreuses annes, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple consquence du dveloppement du cancer. Dailleurs, pour les cliniciens, lapparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique dun cancer occulte. Toutefois, ltude approfondie du lien existant entre le systme hmostatique et le cancer indique que diffrents facteurs hmostatiques vont interagir avec soit lenvironnement tumoral ou soit la tumeur elle-mme et influencer le dveloppement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons port une attention particulire deux protines jouant un rle primordial dans lhmostase. Le facteur tissulaire (TF) et linhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rles pro- ou anti-noplasique, et ce indpendamment de leurs fonctions hmostatiques normales. Dans le premier volet de cette thse, nous avons tudi les proprits antiangiogniques de TFPI. Langiogense, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins partir du rseau pr-existant, est reconnue comme tant une tape cle du dveloppement tumoral. Daprs nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de linhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothliales lorsque ces dernires sont stimules par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molcule relche lors de lactivation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire sexplique par leffet du TFPI sur ladhsion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protines cles participant la formation des complexes dadhsion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). Linhibition de ces deux protines suggre quil y ait une rorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte dadhrence. Finalement, des tudes de microscopie confocale dmontrent que les cellules traites au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette dactine provoquant une dsorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de ladhsion et de la morphologie cellulaire sont strictement spcifiques aux cellules endothliales humaines, puisque aucun neffet nest observ en traitant des cellules cancreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularises. En rsum, cette premire tude dmontre que le TFPI est un inhibiteur de langiogense. Dans le second volet de cette thse, nous nous sommes intresss aux diffrents rles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protine est galement implique dans le dveloppement noplasique et notamment celui des mdulloblastomes (MB) chez lenfant via des fonctions hmostatiques et non-hmostatiques. Nos travaux dmontrent que lexpression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son rcepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spcifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler lexpression de TF au niveau des cellules cancreuses de glioblastomes. TF, exprim la surface des cellules mdulloblastiques (DAOY), est responsable de lactivit pro-thrombognique de ces cellules, ainsi quun acteur important de la migration de ces cellules en rponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en tudiant 18 spcimens cliniques de MB, nous avons tabli un lien entre lintensit dexpression de TF et de Met. Limportance de cette corrlation est galement suggre par lobservation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont galement les plus agressives en termes dindex de prolifration et de dissmination mtastatiques. En rsum, ces travaux reprsentent le point de dpart pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pdiatriques. De plus, llucidation de la voie de signalisation molculaire responsable de lexpression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil dexpression de TF aux phnotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut galement jouer un rle protecteur contre lapoptose. Dans le troisime volet de cette thse, nous avons remarqu que cette protection est corrle lexpression de TF. En rduisant nant lexpression de TF laide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous dmontrons que HGF ne protge plus les cellules contre lapoptose. Donc, TF mdie lactivit anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la srine 15, empchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, lexpression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules mdulloblastiques favorise la survie de ces dernires et ce mme si elles sont soumises de fortes concentrations de mdicaments couramment utilises en cliniques. Ce troisime et dernier volet dmontre limplication de TF en tant que facteur impliqu dans la survie des cellules cancreuses, favorisant ainsi le dveloppement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thse vise dmontrer que les facteurs impliqus normalement dans des fonctions hmostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer rguler le dveloppement tumoral. Tout systme physiologique et pathologique est dpendant dun quilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI la rgulation du dveloppement noplasique illustre bien cette balance dlicate. Par sa contribution anti- ou pro-noplasique le systme hmostatique constitue beaucoup plus quune simple consquence du cancer; il fait partie par laction de TF des stratgies labores par les cellules cancreuses pour assurer leur croissance, leur dplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.
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Le repliement des protines est un processus cellulaire crucial impliquant plusieurs protines dont la calnexine, une chaperone du rticulum endoplasmique. Notre laboratoire et un autre groupe avons dmontr que la calnexine est essentielle la viabilit de la levure Schizosaccharomyces pombe. Dans le cadre dtudes structure-fonction portant sur cette protine, nous avons dcouvert un phnomne permettant la viabilit des cellules en absence de la calnexine. Cet tat, nomm Cin pour calnexine independence, est induit par un mutant de la calnexine dpourvu du domaine central hautement conserv (hcd_Cnx1p). La caractrisation de ltat Cin a rvl plusieurs caractristiques particulires telle la dominance, sa transmission de faon non-Mendlienne la progniture motique et sa transmission par des extraits protiques dpourvus dacides nucliques. Toutes ces proprits suggrent donc que ltat Cin est mdi via un lment de type prion. Le gne cif1+, pour calnexin independence factor, a t isol lors de criblages visant identifier des gnes impliqus dans ltat Cin. Il encode pour une protine orpheline dont la surexpression induit de faon stable un tat de viabilit en labsence de la calnexine. Cet tat diffre gntiquement et phnotypiquement de ltat Cin induit par le mutant hcd_Cnx1p pralablement caractris, ce qui suggre deux voies parallles de signalisation du phnomne Cin. Une caractrisation exhaustive de Cif1p a permis de dmontrer quil ne sagissait pas du prion responsable de ltat Cin, malgr que cette protine possde certaines proprits typiques des prions in vitro. Finalement, Cif1p est une protine nuclolaire dont la bonne localisation est essentielle sa capacit induire ltat Cin. Ceci suggre une interaction entre la fonction essentielle de la calnexine et une fonction excute dans le nuclole. Lors dtudes visant lucider la fonction cellulaire de Cif1p, il a t tabli quelle interagissait avec certaines protines de la grosse sous-unit du ribosome telle la protine L3. Cependant, Cif1p ne co-sdimente pas avec des sous-units ribosomales assembles, des ribosomes ou des polysomes. De plus, des cellules contenant une dltion gnomique de cif1 voient leur contenu en ribosomes perturb lors de la phase stationnaire. Il semble donc que Cif1p joue un rle dans la biosynthse des ribosomes lors de la phase stationnaire. Ce rle spcifique cette phase de croissance coincide avec un clivage de la portion N-terminale de Cif1p, clivage qui a lieu lors de lentre des cellules en phase stationnaire. De plus, des tudes effectues rcemment dans notre laboratoire proposent que la calnexine joue un rle important dans la signalisation de lapoptose, et ce particulirement en phase stationnaire. Ainsi, une voie impliquant Cif1p, sa fonction nuclolaire dans la biosynthse des ribosomes en phase stationnaire, la calnexine et la mdiation de lapoptose semble se dessiner. Dautres travaux, notamment sur la fonction exacte de Cif1p, le rle de son clivage et les autres composantes impliques dans le phnomne Cin nous permettront de dessiner un portrait plus complet de cette voie cellulaire indite.
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Contribuant la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de lhypertension, le remodelage vasculaire est associ une altration de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifration, taille, etc.). Or la prolifration des CMLV est augmente par les peptides vasoactifs tels que langiotensine II (AngII) et lendothline-1 (ET-1). Ces peptides tant surexprims lors de lhypertension, cette tude fut entreprise pour dterminer leur contribution endogne ainsi que celles du facteur de croissance pidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance driv des plaquettes (PDGF) la prolifration accrue des CMLV et aux mcanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR gs de 12 semaines ont t utilises pour cette tude. La prolifration cellulaire fut dtermine par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du rcepteur de EGF fut dtermine par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, compares celles de WKY, ont montr une prolifration accrue qui fut attnue par le losartan, un antagoniste du rcepteur AT1 de lAngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des rcepteurs ETA et ETB de lET-1. La prolifration accrue des CMLV de SHR fut ramene celle des WKY par les inhibiteurs des rcepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du rcepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR compare celle des WKY, fut attnue par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et lAG-1478, mais ne fut pas attnue par lAG-1295 et lAG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut attnue par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des rcepteurs aux facteurs de croissance. Paralllement, le rle de la transactivation de EGF-R dans la prolifration accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examin dans les CMLV A-10. Laugmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifration et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramene au niveau contrle par AG-1478. Ces donnes suggrent que les peptides vasoactifs endognes induisent la prolifration accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases rsultant de la transactivation de EGF-R.
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La sclrose systmique (ScS) est une maladie auto-immune dont lun des principaux auto-anticorps, dirig contre la protine centromrique B (CENP-B), est fortement associ lhypertension artrielle pulmonaire, lune des causes majeures de dcs d la ScS. Lhypertension rsulte de locclusion progressive des vaisseaux suite une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs tudes rcentes ont dmontr que certains auto-antignes possdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois librs par ncrose ou apoptose, ces auto-antignes adoptent une activit biologique qui s'apparente celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de rparation de blessure et/ou acqurir une activit pathogne qui contribue au dveloppement de certaines maladies auto-immunes. Nos rsultats suggrent que la CENP-B peut tre ajoute cette liste de molcules bifonctionnelles. l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytomtrie en flux, nous avons dmontr que la CENP-B se liait spcifiquement la surface des CML vasculaire de lartre pulmonaire avec une plus grande affinit pour le phnotype contractile que synthtique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la scrtion de cytokines pro-inflammatoires telles que linterleukine 6 et 8. Les mcanismes par lesquels la protine exerait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des tudes de signalisation intracellulaire effectues laide de plusieurs inhibiteurs spcifiques ainsi que des tudes de dsensibilisation nous ont permis didentifier le rcepteur de la CENP-B en plus didentifier les mcanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons dmontr que la CENP-B se liait de manire spcifique aux CML vasculaire via le rcepteur de chmokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le rcepteur EGF, selon un mcanisme mtalloprotase-dpendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans lactivation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la scrtion dIL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons dmontr que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empchant ainsi la CENP-B dexercer son rle de cytokine. Lidentification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant ltude du rle pathogne des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.
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L'angiotensine-II (Ang-II), synthtise partir de sources extracardiaques et intracardiaques, rgule l'homostasie cardiaque en favorisant des effets mitogniques et en promouvant la croissance cellulaire rsultant dune altration de l'expression gnique. Dans cette tude, nous avons valu la possibilit que les rcepteurs de l'angiotensine-1 (AT1) ou les rcepteurs de l'angiotensine-2 (AT2) situs sur l'enveloppe nuclaire rgulent lexpression gnique des cardiomyocytes. En analysant les noyaux cellulaires retenus des fractions de cur de rat par immunobuvardage Western, nous avons dtect une co-purification prfrentielle des protines AT1 et AT2 avec un marqueur de la membrane nuclaire (Nup 62), par rapport aux marqueurs de la membrane plasmique (Calpactin I), de lappareil de Golgi (GRP 78) ou du rticulum endoplasmique (GM130). La microscopie confocale a permis de dmontrer la prsence des AT1 et AT2 dans les membranes nuclaires. La microinjection de lAng-II-FITC sur des cardiomyocytes a provoqu une liaison de prfrence aux sites nuclaires. Les enregistrements de transients calciques ont illustr que les AT1 nuclaires rgulent le relchement du Ca2+. Lincubation des ligands spcifiques dAT1 et dAT2 avec lUTP [32P] a rsult en une synthse de novo dARN (par exemple, 16,9 0,5 cpm/ng ADN contrle vs 162,4 29,7 cpm/ng ADN-Ang II, 219,4 8,2 cpm/ng ADN L -162313 (AT1) et 126,5 8,7 cpm/ng ADN CGP42112A (AT2), P <0,001). Lincubation des noyaux avec Ang-II augmente de faon significative lexpression de NFB, une rponse qui est rprime partiellement par la co-administration de valsartan ou de PD123177. Les expriences dose-rponse avec Ang-II administre l'ensemble des noyaux purifis vs. aux cardiomyocytes seuls a montr une augmentation plus importante dans les niveaux d'ARNm de NFB avec une affinit de ~ 3 fois plus grande (valeurs dEC50 = 9 contre 28 pmol/L, respectivement), suggrant un rle prfrentiel nuclaire dans la signalisation. Par consquent, nous avons conclu que les membranes cardiaques nuclaires possdent des rcepteurs dAng-II coupls des voies de signalisation et la transcription gnique. La signalisation nuclaire pourrait jouer un rle cl dans les changements de l'expression de gnes cardiaques, entranant ainsi des implications mcanistiques et thrapeutiques diverses.
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Lostoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes ges. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie cause des cots conomiques quelle engendre mais surtout cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractrise par une dgradation du cartilage articulaire, une sclrose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la prsence dostophytes. Ltiologie de cette pathologie est reste nbuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rle cl de los sous-chondral dans lOA est maintenant reconnu. Lobsit tant un facteur de risque de lOA, nous avons mis lhypothse que la leptine, une adipocytokine cl dans lobsit, joue un rle important dans lOA. En effet, la leptine modifie le phnotype des ostoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phnotype altr, notre objectif tait de dterminer le rle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons prpar des cultures primaires dOb issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et dindividus normaux (N). Lexpression de la leptine et de son rcepteur actif (OB-Rb) ont t mesures par RT-PCR en temps rel, et leur production a t mesure par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifration des Ob OA a t dtermine par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a t dtermine par IB. Le phnotype des Ob fut dtermin par la mesure de lactivit de la phosphatase alcaline (ALP) et la scrtion dostocalcine (OC), en prsence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs dinterfrences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phnotype des Ob OA furent dtermins via leur impact sur lactivit de lALP et sur la scrtion dOC. Leffet dose-rponse de la leptine sur les expressions dOB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent dtermines par RT-PCR en temps rel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a t tudie en valuant leffet dose rponse de celle-ci sur la production des protines JAK2 et STAT3 phosphoryles par IB. Les rsultats obtenus ont montrs que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phnotypique, ces Ob OA possdent une activit de lALP ainsi quune scrtion dOC plus importante que celles observes chez les Ob N. Lajout danticorps inactivant linteraction leptine et OB-Rb ou dinhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminurent lactivit de lALP ainsi que la scrtion dOC dans les Ob OA. Par contre, lajout de leptine exogne aux Ob OA augmenta lactivit de lALP sans pour autant faire varier la scrtion dOC. La leptine des doses de 1ng/ml 10mg/ml stimula la prolifration des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogne diminua lexpression de TFG-1 tandis quelle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manire dose-dpendante. Cependant, lexpression dOB-Rb diminua de manire dose-dpendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua lactivit dALP, la scrtion dOC, lexpression de la leptine, lexpression dOB-RB ainsi que lexpression du facteur TGF-1. Lensemble de ces donnes dmontre que la leptine endogne des Ob OA est sous contrle des facteurs de croissance et quelle contribue maintenir le phnotype anormal de los sous-chondral OA. De plus, ceci suggre que la leptine serait un acteur important dans la rgulation du remodelage osseux.
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La scoliose idiopathique de ladolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui gnre des dformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prvalence est de 4% dans la population adolescente au Qubec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur pousse de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothses mises, lhypothse neuroendocrinienne, impliquant une dficience en mlatonine comme agent tiologique de la SIA a suscit beaucoup dintrt. Cette hypothse dcoule du fait que lablation de la glande pinale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mlatonine dans la scoliose est controverse, tant donn que la majorit des tudes chez lhomme nont pu mettre en vidence une diminution significative des niveaux de mlatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons dmontr un dysfonctionnement dans la signalisation de la mlatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une srie de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirm ce dfaut chez un plus grand nombre de patients ainsi quen utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire dilectrique) nayant pas recours un prtraitement des cellules donnant ainsi des rsultats plus prcis. Cette technique a montr la prsence des mmes groupes fonctionnels identifis auparavant par la technique dAMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mlatonine est d une phosphorylation accrue des protines G inhibitrices. Ce dfaut pourrait tre caus par un dsquilibre de lactivit des kinases et phosphatases capables de rguler la phosphorylation des protines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscit initialement notre intrt vu quelle peut phosphoryler les protines Gi. Nous avons dmontr que cette kinase interagit avec le rcepteur de la mlatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigs vers la dcouverte deffecteurs cellulaires rguls par la mlatonine et plus spcifiquement lostopontine (OPN), compte tenu de son rle prsum comme mcanorcepteur et dans certaines structures jouant un rle dans la proprioception, le contrle postural et la fonction vestibulaire. LOPN a t identifie initialement par sa surexpression au niveau protique et de lARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons galement utilis un autre modle animal, la souris C57Bl/6 naturellement dficiente en mlatonine. Nous avons gnr des souris bipdes en amputant les membres antrieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrles C57Bl/6. Nos rsultats ont montr quaucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne dveloppe la maladie, contrairement aux souris contrles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces rsultats nous ont pousss investiguer le rle de cette protine dans ltiopathogense de la maladie chez lhumain. Nos rsultats ont montr une augmentation des niveaux circulants dOPN chez les patients atteints de la SIA et que llevation en OPN corrlait avec la svrit de la maladie. Nos tudes chez les enfants asymptomatiques ns de parents scoliotiques et qui sont plus risque de dvelopper la maladie ont aussi dmontr des diffrences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants risque prsentaient des niveaux dOPN suprieurs 800ng/ml suggrant un plus grand risque de dvelopper une scoliose indiquant aussi que laugmentation des niveaux en OPN prcde le dbut de la maladie.
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Linterfron- pegyl en combinaison avec la ribavirin est le seul traitement approuv pour le traitement de linfection au virus de lhpatite C (VHC). Lefficacit est de 50-75%, la thrapie est coteuse et induit beaucoup deffets secondaires. Il est impratif davoir une meilleure comprhension de la pathogense du VHC afin de dvelopper des traitements plus efficaces ou un vaccin. cette fin, notre approche est de caractriser la rponse immunitaire cellulaire induite par ARFP, un antigne nouveau et conserv chez le VHC, et de cartographier les pitopes de la rponse immunitaire cellulaire dun patient infect au gnotype 3a ayant rsolu spontanment. Le gnotype 3a, tant prvalant chez les utilisateurs de drogues intraveineuses (IDUs) constitue 60% des nouvelles infections. Peu dpitopes furent identifis auparavant pour ce gnotype, ce qui rend ltude de la rponse immunitaire difficile chez cette population. Dans cette tude, pour la rponse immunitaire cellulaire dirige contre ARFP, nous navons pas observ de diffrence significative entre les patients ayant rsolu spontanment comparativement avec ceux ayant dvelopp une infection persistante. Ceci suggre fortement que ARFP ne joue pas un rle majeur lors de la rsolution de linfection aigue au VHC. Pour la caractrisation de la rponse immunitaire cellulaire chez un des patients infects au gnotype 3a, nous avons identifi et caractris 5 pitopes spcifiquement reconnus par des lymphocytes T, CD3+, CD4+ et CD8- : E2504-521, NS31064-1081, NS4b1759-1776, NS5a2074-2091, NS5b2421-2436. Nous avons compar avec ceux connus pour le gnotype 1a. Nous avons identifi 4 nouveaux pitopes. Enfin, lpitope NS4b1759-1776, identifi auparavant, pourrait savrer tre un candidat intressant dans la mise au point dun vaccin base de peptides immunogniques contre le VHC.
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Au cours de lovogense chez la mouche du vinaigre: Drosophila melanogaster, un groupe de cellules folliculaires appeles cellules de bord, migrent travers les cellules nourricires pour atteindre lovocyte. Cet vnement, ncessitant la transition pithlio- msenchymateuse (TEM), la rorientation, puis larrt, ressemble la formation de mtastases. Lendocytose est un rgulateur cl de plusieurs vnements polariss, y compris la migration cellulaire. En effet, diffrentes protines impliques dans la migration, comme les intgrines et les E-cadhrines (cadhrines pithliales), sont rgules par transport travers les endosomes. De mme, lendocytose restreint au front de migration lactivit des rcepteurs tyrosine kinases (RTKs) qui guident les cellules de bord dans leur mouvement. Cependant les mcanismes molculaires de cette restriction spatiale de lactivit des RTKs demeurent largement inconnus. Nous avons test limplication du trafic vsiculaire travers la machinerie dendocytose, dans la migration dirige des cellules de bord, car ce systme est facilement accessible pour lexpression de protines et lanalyse de mutants. Nous avons commenc par confirmer une observation prcdente du rle de lendosome prcoce dans la migration des cellules de bord. Ensuite, nous avons identifi lendosome de recyclage (ER) comme un rgulateur cl de cette migration. En effet, nous avons dmontr que lexpression dans les cellules de bord dune forme dominante ngative de Rab11, la petite GTPase rgulant le transport vsiculaire travers lER, bloque la migration ou entrane de svres dfauts de migration dans environ 80% des chambres dufs examines. De plus, nous observons par immunofluorescence une relocalisation de lactivit des RTKs alors que dautres protines de migration ne sont pas affectes par Rab11 dominant ngatif. Ce rsultat a t par la suite confirm par une interaction gntique entre Rab11 et les RTKs. Dautre part, nous avons montr que le complexe exocyste, un effecteur de Rab11, est impliqu dans la migration des cellules de bord. Nous avons trouv par microscopie confocale en tissu fix et par microscopie en temps rel que Sec15, un composant de ce complexe, est polaris, de faon Rab11- dpendante, dans des vsicules qui saccumulent au front de migration tout au long du mouvement des cellules de bord. De plus, la perte de lactivit de Sec15 perturbe son tour la migration. Ainsi, toutes ces donnes dmontrent le rle fondamental dun cycle dendo- exocytose dans le maintien des RTKs actifs au niveau du front de migration des cellules de bord le long de leur mouvement.
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Les Wnts reprsentent une famille de glycoprotines de signalisation qui sont connues pour les nombreux rles qu'ils jouent durant le dveloppement embryonnaire et dans la cancerognse. Plusieurs Wnts, leurs rcepteurs (Fzd) et d'autres composants des voies de signalisation des Wnt sont exprims dans lovaire postnatal, et il a t dmontr que lexpression de certains de ces gnes est rgule pendant le dveloppement et l'ovulation/luteinization folliculaires. Toutefois, leurs rles physiologiques dans lovaire demeurent mal dfinis. Pour tudier le rle de WNT4 dans le dveloppement folliculaire, nous avons entrepris didentifier ses cibles transcriptionnels dans les cellules de la granulosa. Pour ce faire, nous avons employ la souris Catnbflox(ex3)/flox(ex3), chez laquelle une activation constitutive de la voie de Wnt/-catenin a lieu suite laction de la recombinare Cre. Des cellules de la granulosa de ces souris ont t mises en culture et infectes avec un adenovirus pour causer la surexpression de WNT4 ou lexpression de Cre. LARN a alors t extrait de ces cellules et analys par micro-puce. Les rsultats ont dmontr quune forte proportion des gnes induits par WNT4 taient des gnes impliqus dans la rponse cellulaire au stress. Presque tous gnes induits par WNT4 ont galement t induits par Cre, indiquant que WNT4 signale via la voie Wnt/-catenin dans ces cellules. Nos rsultats suggrent donc que WNT4 favorise la survie des follicules par linduction de gnes de rponse au stress dans les cellules de la granulosa, augmentant ainsi la rsistance cellulaire l'apoptose.
