Induktion von Pro-Autophagie-Signalen durch einen extra- oder intrazellulären Alpha-Toxin-Angriff

Autophagie ist ein konservierter, kataboler Mechanismus in allen eukaryoten Zellen. Unter anderem wird ihm eine wichtige Rolle als zellautonomer Abwehrmechanismus gegen Mikroorganismen zugeschrieben; von manchen Infektionserregern wird er jedoch unterlaufen oder sogar genutzt. Der stärkste Auslöser der Autophagie ist ein Mangel an Nährstoffen, insbesondere Aminosäuren. Über die Deaktivierung der Kinase mTORC1 und die Phosphorylierung des eukaryoten Translationsinitiationsfaktors eIF2α hemmt die Nährstoffknappheit die Proteinbiosynthese und aktiviert gleichzeitig Autophagie. Wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Autophagie auslösen oder manipulieren, ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Modifikationen an Mikroben oder Phagosomen und Adapterproteine, die diese Veränderungen und Komponenten des Autophagieapparates erkennen, scheinen jedenfalls bei der selektiven Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie wichtig zu sein. rnIn der vorliegenden Dissertationsarbeit wird die Rolle des membranporenbildenden α-Toxins von Staphylococcus aureus für die Induktion von Autophagie beleuchtet. Zum einen erwies sich die Akkumulation von (EGFP)-LC3(II), einem Marker der Autophagosomen, um intrazelluläre S. aureus als abhängig von α-Toxin. Zweitens, genügt extrazellulär appliziertes α-Toxin um (EGFP)-LC3(II)-positive Endosomen zu induzieren. Während der Angriff aus dem extrazellulären Raum jedoch binnen kurzer Zeit eine fokale Kumulation von phosphoryliertem eIF2α an der Plasmamembran induziert, die an der Internalisierung des Toxins beteiligt ist, findet sich am phagosomalen Kompartiment keine Toxin-abhängige Anhäufung von p-eIF2α oder proximalen Autophagieregulatoren. Dies impliziert, dass Toxin-Angriff auf die Plasmamembran, nicht aber auf das Phagosom, zu einer Reaktion führt, wie sie bei massivem Nährstoffmangel zu beobachten ist. Obwohl keine α-Toxin-abhängige Kumulation von p-eIF2α bei einem Angriff aus dem Phagosom erfolgt, findet sich um α-Toxin-produzierende Bakterien eine massive Kumulation von LC3 und Adapterprotein p62/Sequestosome1. Dies deutet daraufhin, dass der Ort des Angriffs - Plasmamembran oder Phagosom – für den Autophagie-induzierenden Mechanismus wichtig sein könnte. Der unterschiedliche Effekt auf die zellulären Ionenkonzentrationen, den ein Angriff auf die Plasmamembran oder auf ein Phagosom auslösen würde, bietet hierfür eine mögliche Erklärung. Die Aktivierung der Autophagie über Adapterproteine könnte dann als back-up Mechanismus fungieren, der auch dann greift, wenn eine Invasion ohne Schädigung der Plasmamembran erfolgt. Ein cross-talk der beiden Induktionswege ist angesichts der Bedeutung von p62 für die selektive und die Hunger-assoziierte Autophagie gut möglich; sezerniertes Toxin könnte durch die Aktivierung der basalen Autophagie Adapter-basierte Mechanismen verstärken.

How can we measure the impact of pollutants on respiratory function in very young children? Methodological aspects

There is increasing evidence that air pollution particularly affects infants and small preschool children. However, detecting air pollution effects on lung function in small children is technically difficult and requires non-invasive methods that can assess lung function and inflammatory markers in larger cohorts. This review discusses the principles, usefulness and shortcomings of various lung function techniques used to detect pollution effects in small children. The majority of these techniques have been used to detect effects of the dominant indoor pollutant, tobacco exposure. However there is increasing evidence that non-invasive lung function techniques can also detect the effects of outdoor air pollution.

Enhancement of titanium implants via bioengineered periodontal tissues

Osseointegration of titanium dental implants into the jaw bone, which is required for maintenance of the implant in the jaw, results in ankylosis. Dental implants are therefore very unlike natural teeth, which exhibit significant movement in response to mechanical forces. The ability to generate periodontal ligament (PDL) tissues onto dental implants would better mimic the functional characteristics of natural teeth, and would likely improve implant duration and function. OBJECTIVES: The objective of this study was to investigate the feasibility of bioengineering PDL tissues onto titanium implant surfaces. METHODS: Bilateral maxillary first and second molars of 8-week old rats were extracted and used to generate single cell suspensions of PDL tissues, which were expanded in culture. Immunohistochemistry and RT-PCR were used to identify putative PDL progenitor/stem cell populations and characterize stem cell properties, including self-renewal, multipotency and stem cell maker expression. Cultured rPDL cells were harvested at third passage, seeded onto Matrigel-coated titanium implants (1.75 mm x 1 mm), and placed into healed M1/M2 extraction sites. Non-cell seeded Matrigel-coated titanium implants served as negative controls. Implants were harvested after 8, 12, or 18 weeks. RESULTS: Cultured rPDL cells expressed the mesenchymal stem-cell marker STRO-1. Under defined culture conditions, PDL cells differentiated into adipogenic, neurogenic and osteogenic lineages. While control implants were largely surrounded by alveolar bone, experimental samples exhibited fibrous PDL-like tissues, and perhaps cementum, on the surface of experimental implants. CONCLUSIONS: PDL contains stem cells that can generate cementum/PDL-like tissue in vivo. Transplantation of these cells might hold promise as a therapeutic approach for the bioengineering of PDL tissues onto titanium implant. Further refinement of this method will likely result in improved dental implant strategies for use of autologous PDL tissue regeneration in humans. This research was supported by CIMIT, and NIH/NIDCR grant DE016132 (PCY), and TEACRS (YL).

Overexpression of lymphotoxin in T cells induces fulminant thymic involution

Activated lymphocytes and lymphoid-tissue inducer cells express lymphotoxins (LTs), which are essential for the organogenesis and maintenance of lymphoreticular microenvironments. Here we describe that T-cell-restricted overexpression of LT induces fulminant thymic involution. This phenotype was prevented by ablation of the LT receptors tumor necrosis factor receptor (TNFR) 1 or LT beta receptor (LTbetaR), representing two non-redundant pathways. Multiple lines of transgenic Ltalphabeta and Ltalpha mice show such a phenotype, which was not observed on overexpression of LTbeta alone. Reciprocal bone marrow transfers between LT-overexpressing and receptor-ablated mice show that involution was not due to a T cell-autonomous defect but was triggered by TNFR1 and LTbetaR signaling to radioresistant stromal cells. Thymic involution was partially prevented by the removal of one allele of LTbetaR but not of TNFR1, establishing a hierarchy in these signaling events. Infection with the lymphocytic choriomeningitis virus triggered a similar thymic pathology in wt, but not in Tnfr1(-/-) mice. These mice displayed elevated TNFalpha in both thymus and plasma, as well as increased LTs on both CD8(+) and CD4(-)CD8(-) thymocytes. These findings suggest that enhanced T cell-derived LT expression helps to control the physiological size of the thymic stroma and accelerates its involution via TNFR1/LTbetaR signaling in pathological conditions and possibly also in normal aging.

Mechanism of surgical stress impairment of murine natural killer cell cytotoxicity

Natural killer cells may provide an important first line of defense against metastatic implantation of solid tumors. This antitumor function occurs during the intravascular and visceral lodgment phase of cancer dissemination, as demonstrated in small animal metastasis models. The role of the NK cell in controlling human tumor dissemination is more difficult to confirm, at least partially because of ethical restraints on experimental design. Nonetheless, a large number of solid tumor patient studies have demonstrated NK cell cytolysis of both autologous and allogeneic tumors.^ Of the major cancer therapeutic modalities, successful surgery in conjunction with other treatments offers the best possibility of cure. However, small animal experiments have demonstrated that surgical stress can lead to increased rates of primary tumor take, and increased incidence, size, and rapidity of metastasis development. Because the physiologic impact of surgical stress can also markedly impair perioperative antitumor immune function in humans, we examined the effect of surgical stress on perioperative NK cell cytolytic function in a murine preclinical model. Our studies demonstrated that hindlimb amputation led to a marked impairment of postoperative NK cell cytotoxicity. The mechanism underlying this process is complex and involves the postsurgical generation of splenic erythroblasts that successfully compete with NK cells for tumor target binding sites; NK cell-directed suppressor cell populations; and a direct impairment of NK cell recycling capacity. The observed postoperative NK cell suppression could be prevented by in vivo administration of pyrimidinone biologic response modifiers or by short term in vitro exposure of effector cells to recombinant Interleukin-2. It is hoped that insights gained from this research may help in the future development of NK cell specific perioperative immunotherapy relevant to the solid tumor patients undergoing cancer resection. ^

Memo has a novel role in S1P signaling and crucial for vascular development

Memo is a conserved protein that was identified as an essential mediator of tumor cell motility induced by receptor tyrosine kinase activation. Here we show that Memo null mouse embryonic fibroblasts (MEFs) are impaired in PDGF-induced migration and this is due to a defect in sphingosine-1-phosphate (S1P) signaling. S1P is a bioactive phospholipid produced in response to multiple stimuli, which regulates many cellular processes. S1P is secreted to the extracellular milieu where it exerts its function by binding a family of G-protein coupled receptors (S1PRs), causing their activation in an autocrine or paracrine manner. The process, termed cell-autonomous S1PR signaling, plays a role in survival and migration. Indeed, PDGF uses cell-autonomous S1PR signaling to promote cell migration; we show here that this S1P pathway requires Memo. Using vascular endothelial cells (HUVECs) with Memo knock-down we show that their survival in conditions of serum-starvation is impaired. Furthermore, Memo loss in HUVECs causes a reduction of junctional VE-cadherin and an increase in sprout formation. Each of these phenotypes is rescued by S1P or S1P agonist addition, showing that Memo also plays an important role in cell-autonomous S1PR signaling in endothelial cells. We also produced conventional and endothelial cell-specific conditional Memo knock-out mouse strains and show that Memo is essential for embryonic development. Starting at E13.5 embryos of both strains display bleeding and other vascular problems, some of the phenotypes that have been described in mouse strains lacking S1PRs. The essential role of Memo in embryonic vascular development may be due in part to alterations in S1P signaling. Taken together our results show that Memo has a novel role in the S1P pathway and that Memo is needed to promote cell-autonomous S1PR activation.

14-3-3 ZETA OVEREXPRESSION SERVES AS A NOVEL MOLECULAR SWITCH TURNING TGF-BETA FROM TUMOR SUPPRESSOR TO TUMOR PROMOTER

TGF-β plays an important role in differentiation and tissue morphogenesis as well as cancer progression. However, the role of TGF-β in cancer is complicate. TGF-β has primarily been recognized as tumor suppressor, because it can directly inhibit cell proliferation of normal and premalignant epithelial cell. However, in the last stage of tumor progression, TGF-β functions as tumor promoter to enhance tumor cells metastatic dissemination and expands metastatic colonies. Currently, the mechanism of how TGF-β switches its role from tumor suppressor to promoter still remains elusive. Here we identify that overexpression of 14-3-3ζ inhibits TGF-β’s cell cytostatic program through destabilizing p53 in non-transformed human mammary epithelial cells. Mechanistically, we found that 14-3-3ζ overexpression leads to 14-3-3σ downregulation, thereby activates PI3K/Akt signaling pathway and degrades p53, and further inhibits TGF-β induced p21 expression and cell cytostatic function. In addition, we found that overexpression of 14-3-3ζ promotes TGF-β induced breast cancer cells bone metastatic colonization through stabilizing Gli2, which is an important co-transcriptional factor for p-smad2 to activate PTHrP expression and bone osteolytic effect. Taken together, we reveal a novel mechanism that 14-3-3ζ dictates the tumor suppressor or metastases promoter activities of TGF-β signaling pathway through switching p-smad2 binding partner from p53 to Gli2. The expected results will not only provide us the better understanding of the important role of 14-3-3ζ in the early stage of breast cancer development, but also deeply impact our knowledge of signaling mechanisms underlying the complex roles of TGF-β in cancer, which will give us a more accurate strategy to determine when and how anti-TGF-β targeted therapy might be effective.

Phytoplankton calcification as an effective mechanism to alleviate cellular calcium poisoning

Marine phytoplankton has developed the remarkable ability to tightly regulate the concentration of free calcium ions in the intracellular cytosol at a level of ~ 0.1 µmol /l in the presence of seawater Ca2+ concentrations of 10 mmol/1. The low cytosolic calcium ion concentration is of utmost importance for proper cell signalling function. While the regulatory mechanisms responsible for the tight control of intracellular Ca2+ concentration are not completely understood, phytoplankton taxonomic groups appear to have evolved different strategies, which may affect their ability to cope with changes in seawater Ca2+ concentrations in their environment on geological time scales. For example, the Cretaceous (145 to 66 Ma ago), an era known for the high abundance of coccolithophores and the production of enormous calcium carbonate deposits, exhibited seawater calcium concentrations up to four times present-day levels. We show that calcifying coccolithophore species (Emiliania huxleyi, Gephyrocapsa oceanica and Coccolithus braarudii) are able to maintain their relative fitness (in terms of growth rate and photosynthesis) at simulated Cretaceous seawater calcium concentrations, whereas these rates are severely reduced under these conditions in some non-calcareous phytoplankton species (Chaetoceros sp., Ceratoneis closterium and Heterosigma akashiwo). Most notably, this also applies to a non-calcifying strain of E. huxleyi which displays a calcium-sensitivity similar to the non-calcareous species. We hypothesize that the process of calcification in coccolithophores provides an efficient mechanism to alleviate cellular calcium poisoning and thereby offered a potential key evolutionary advantage, responsible for the proliferation of coccolithophores during times of high seawater calcium concentrations. The exact function of calcification and the reason behind the highly-ornate physical structures of coccoliths remain elusive.

Caracterización Dinámica de Partículas Magnéticas y su Uso en Aplicaciones Biomédicas

El uso de las partículas magnéticas ha venido a más durante los últimos 10 años. Lo anterior ha estado condicionado por factores como la amplia investigación en materiales a nivel atómico, los retos propuestos por las diferentes áreas de investigación donde los niveles nanométricos cobran importancia, la inherente innovación tecnológica que pueden aportar a la industria dichas escalas y finalmente, el impacto socioeconómico que pueden tener estos avances tecnológicos. Sin embargo, la traslación a la industria de los avances tecnológicos se ha visto limitada por la falta de estrategias, ya que el 88% del conocimiento se queda en Universidades y Centros de Investigación y el resto, 12%, pasa a la industria o es obtenido en ella. En este trabajo de investigación se ha tratado de completar el círculo de idea, conceptualización, generación de conocimiento, prototipo, prueba in vitro y prueba in vivo; todo ello para dejar el menor espacio posible entre Investigación e Industria. Se ha fabricado un recinto que permite la observación del comportamiento de las partículas magnéticas cuando están inmersas en un medio con viscosidad controlada y con una fuente magnética estática. De la observación experimental se han encontrado fenómenos magnéticos como la aglomeración y la autoorganización, que han sido aprovechados, no solo para ofrecer una solución alternativa a la corrección del desprendimiento de retina, sino también para promover las mejoras de métodos de separación y/o filtrado celular, ayuda en correcciones ortopédicas o en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades degenerativas. Particularizando en la corrección del desprendimiento de retina, se ha desarrollado y patentado un Dispositivo Ocular cuya función es la de tapón del agujero retiniano, ayudando en la cicatrización de la retina. Dicho dispositivo ha sido evaluado en conejos albinos neozelandeses obteniéndose un éxito en la reaplicación de la retina del 80% y resultando su toxicidad en condición difusa tras evaluación anatomopatológica. Así mismo, el ferrofluido diseñado y fabricado se ha localizado en la zona de interacción magnética siempre y su disposición ha sido en el mayor de los casos en forma de placa pero también se han formado anillos; lo anterior no ha afectado en ningún sentido el éxito en la reaplicación de la retina. Por otro lado, no se han encontrado indicios de siderosis en la zona de interacción magnética, sus alrededores o el resto del globo ocular; ni las células han presentado apoptosis inducida por los materiales introducidos en el ojo. Sin embargo, se ha encontrado una fuerte necrosis inducida por la presión ejercida sobre la retina por el dispositivo ocular, evidenciando la necesidad de un mejor control de dicha presión. Tras la caracterización de los copos y la presión que éstos ejercen, se ha podido identificar que el dispositivo ocular se puede sintonizar para inducir una presión entre 0.5 y 2.5 mmHg; por tanto se puede vislumbrar que es posible minimizar la muerte celular causada en las células retinianas. Finalmente, tras la experimentación con conejos se ha observado que el dispositivo ocular resuelve los problemas inducidos por las siliconas o los gases e inclusive aporta ventajas competitivas de alto valor añadido como: no requerir de posiciones incómodas en el post-operatorio, no modifica las propiedades ópticas del ojo ya que no es necesario dejar silicona o gases en el interior del ojo, se pueden sellar múltiples agujeros retinianos, corrección de desprendimiento de retina inferior sin complicaciones asociadas, etc.; en definitiva mejora la calidad de vida domiciliaria del paciente además de solventar los problemas inducidos por las soluciones actuales. The using of magnetic particles has become more important during last 10 years. This event has been conditioned by several factors like a wide researching on materials at atomic level, the challenges proposed by different research areas where nanometric levels became important, the inherent technological innovation to the industry and finally, the socioeconomic impact of these kinds of technologies. However, the nanotechnological advances have not been well addressed to the industry since 88% of the acknowledge keeps on Universities and Research Centers, and the remaining 12% goes through the industry or is obtained in it. In this research work, we have tried to complete the entire process about idea, concept, acknowledge generation, prototyping and in vitro and in vivo testing; all to leave as little space as possible between Research and Industry. We have built an experimental hall which allows us the observation of magnetic particles' behavior when are immersing in a controlled viscous medium and under a static magnetic field. The experimental observation has been useful to identify and use two magnetic phenomena: agglomeration and self-organization; no only for retinal detachment, but also to improve cellular separation and/or filtered methods, orthopedic solutions or the diagnostic and treatment of degenerative diseases. Particularizing on retinal detachment, we have developed and patented an Ocular Device which its function is acting like a tampon of the retinal hole for helping with the scarring retina. The device has been evaluated in animals and the results show that we can achieve a success of 80% before rabbit’s death and non cell apoptosis, only necrosis, over the retina attached by the ocular device after anatomopathological evaluation. Also we have identified a diffuse toxicity after anatomopathological evaluation, so more experimenting must be proposed. Otherwise, the ferrofluid has been localized where the magnetic interaction area is located and its deposition has been in most cases plaque shape like but rings have also been observed; this has not affected in any way the successful reattachment of the retina. On the other hand, we have not found any evidence of siderosis in the magnetic interaction zone, near of or some other place of the ocular globe; and we did not find any apoptosis induced by the materials inserted within the eye. However full necrosis, exactly on the magnetic interaction zone, has been found and induced by the pressure exerted over the retina by the ocular device, evidencing the needing of its better control. After flakes’ characterization and its pressure exerted, we identified that the ocular device can be tuned in order to induce a pressure between 0.5 and 2.5 mmHg; therefore we can perceive that death caused to the retinal cells can be minimized. Finally, the experimentation has shown that the ocular device solves all problems induced by silicone or gases an even contributes with some other competitive advantages of high added value like: no uncomfortable postoperative positions, it does not modify any optical property of the eye because there is no needing of leaving silicone or gases inside the eye, many holes can be sealed, the inferior retinal detachment can be solve without any complications, etc.; definitively the ocular device improves patients’ quality of life.

Abrogation of the G2 cell cycle checkpoint associated with overexpression of HSIX1: A possible mechanism of breast carcinogenesis

While conducting a search for cell cycle-regulated genes in human mammary carcinoma cells, we identified HSIX1, a recently discovered member of a new homeobox gene subfamily. HSIX1 expression was absent at the onset of and increased toward the end of S phase. Since its expression pattern is suggestive of a role after S phase, we investigated the effect of HSIX1 in the G2 cell cycle checkpoint. Overexpression of HSIX1 in MCF7 cells abrogated the G2 cell cycle checkpoint in response to x-ray irradiation. HSIX1 expression was absent or very low in normal mammary tissue, but was high in 44% of primary breast cancers and 90% of metastatic lesions. In addition, HSIX1 was expressed in a variety of cancer cell lines, suggesting an important function in multiple tumor types. These data support the role for homeobox genes in tumorigenesis/tumor progression, possibly through a cell cycle function.

Cross talk between cell death and cell cycle progression: BCL-2 regulates NFAT-mediated activation.

BCL-2-deficient T cells demonstrate accelerated cell cycle progression and increased apoptosis following activation. Increasing the levels of BCL-2 retarded the G0-->S transition, sustained the levels of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1, and repressed postactivation death. Proximal signal transduction events and immediate early gene transcription were unaffected. However, the transcription and synthesis of interleukin 2 and other delayed early cytokines were markedly attenuated by BCL-2. In contrast, a cysteine protease inhibitor that also blocks apoptosis had no substantial affect upon cytokine production. InterleUkin 2 expression requires several transcription factors of which nuclear translocation of NFAT (nuclear factor of activated T cells) and NFAT-mediated transactivation were impaired by BCL-2. Thus, select genetic aberrations in the apoptotic pathway reveal a cell autonomous coregulation of activation.

Lens complementation system for the genetic analysis of growth, differentiation, and apoptosis in vivo.

A genetic approach has been established that combines the advantages of blastocyst complementation with the experimental attributes of the developing lens for the functional analysis of genes governing cellular proliferation, terminal differentiation, and apoptosis. This lens complementation system (LCS) makes use of a mutant mouse strain, aphakia (ak), homozygotes of which fail to develop an ocular lens. We demonstrate that microinjection of wild-type embryonic stem (ES) cells into ak/ak blastocysts produces chimeras with normal ES-cell-derived lenses and that microinjection of Rb-/- ES cells generates an aberrant lens phenotype identical to that obtained through conventional gene targeting methodology. Our determination that a cell autonomous defect underlies the aphakia condition assures that lenses generated through LCS are necessarily ES-cell-derived. LCS provides for the rapid phenotypic analysis of loss-of-function mutations, circumvents the need for germ-line transmission of null alleles, and, most significantly, facilitates the study of essential genes whose inactivation is associated with early lethal phenotypes.

A prokaryotic origin for light-dependent chlorophyll biosynthesis of plants.

Flowering plants require light for chlorophyll synthesis. Early studies indicated that the dependence on light for greening stemmed in part from the light-dependent reduction of the chlorophyll intermediate protochlorophyllide to the product chlorophyllide. Light-dependent reduction of protochlorophyllide by flowering plants is contrasted by the ability of nonflowering plants, algae, and photosynthetic bacteria to reduce protochlorophyllide and, hence, synthesize (bacterio) chlorophyll in the dark. In this report, we functionally complemented a light-independent protochlorophyllide reductase mutant of the eubacterium Rhodobacter capsulatus with an expression library composed of genomic DNA from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The complemented R. capsulatus strain is capable of synthesizing bacteriochlorophyll in the light, thereby indicating that a chlorophyll biosynthesis enzyme can function in the bacteriochlorophyll biosynthetic pathway. However, under dark growth conditions the complemented R. capsulatus strain fails to synthesize bacteriochlorophyll and instead accumulates protochlorophyllide. Sequence analysis demonstrates that the complementing Synechocystis genomic DNA fragment exhibits a high degree of sequence identity (53-56%) with light-dependent protochlorophyllide reductase enzymes found in plants. The observation that a plant-type, light-dependent protochlorophyllide reductase enzyme exists in a cyanobacterium indicates that light-dependent protochlorophyllide reductase evolved before the advent of eukaryotic photosynthesis. As such, this enzyme did not arise to fulfill a function necessitated either by the endosymbiotic evolution of the chloroplast or by multicellularity; rather, it evolved to fulfill a fundamentally cell-autonomous role.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.