Efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre as atividades enzimáticas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

A deficiência de desidrogenase das acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo devido a um defeito no último ciclo de β-oxidação, sendo específica para ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6 carbonos), resultando no acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta, principalmente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico, formados pela metabolização por rotas secundárias do butiril-CoA acumulado. A deficiência de SCAD manifesta-se principalmente no período neonatal ou durante a infância e até mesmo na idade adulta. Os achados clínico-laboratoriais são heterogêneos, incluindo acidose metabólica, acidose lática, vômitos, atraso no desenvolvimento, convulsões, fraqueza muscular e miopatia crônica. No entanto, o sintoma mais comum apresentado pelos pacientes portadores dessa deficiência é a disfunção neurológica, a qual pode estar relacionada ao acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta e sua toxicidade ao sistema nervoso central. No presente trabalho nosso objetivo foi investigar o efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre algumas atividades enzimáticas fundamentais para o metabolismo energético. Visando contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia dessa doença testamos o efeito desses metabólitos sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens. Verificamos que os ácidos etilmalônico e metilsucínico, na concentração de 1 mM, inibiram significativamente a atividade do complexo I+III da cadeia respiratória em córtex cerebral de ratos, porém não alteraram a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória (II, SDH, II+III, III e IV) nesses tecido bem como não alteraram a atividade de todos os complexos da cadeia repiratória em músculo esquelético e músculo cardíaco dos ratos nas concentrações de 1 e 5 mM. Observamos também que o ácido etilmalônico (1 e 2,5 mM) reduziu de forma significativa a atividade total de creatina quinase em córtex cerebral de ratos, mas não alterou essa atividade nos músculos esquelético e cardíaco. Por outro lado o ácido metilsucínico não modificou a atividade total da creatina quinase em nenhum dos três tecidos estudados, córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos. Testamos então o efeito do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase nas frações mitocondrial e citosólica de córtex cerebral, músculo cardíaco e músculo esquelético de ratos. O ácido (1 e 2,5 mM) inibiu significativamente a atividade da creatina quinase apenas na fração mitocondrial de córtex cerebral. Demostramos também que o antioxidante glutationa (1 mM) preveniu o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade total da creatina quinase em córtex cerebral. A glutationa (0,5 mM) e o ácido ascórbico (0,5 mM) também preveniram o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase na fração mitocondrial de córtex cerebral. Por outro lado a adição de L-NAME ou trolox não alterou o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase. Esses resultados indicam que o ácido etilmalônico possui um efeito inibitório específico sobre a isoforma mitocondrial da creatina quinase do cérebro, ou seja, sobre a CKmi a, não afetando a isoenzima citosólica cerebral ou as isoenzimas citosólicas e mitocondrial presentes no músculo esquelético e no músculo cardíaco. Além disso, o efeito da glutationa, que atua como um agente redutor de grupos tióis, indica que a ação inibitória do ácido etilmalônico sobre a creatina quinase pode estar relaciona à oxidação de grupos sulfidrila essenciais à atividade da enzima. Já a prevenção do efeito inibitório do ácido etilmalônico causada pelo ácido ascórbico sugere que o ácido pode estar envolvido com a formação dos radicais superóxido e hidroxila, uma vez que este agente antioxidante atua sobre esses radicais livres. Essas observações em seu conjunto indicam que os ácidos etilmalônico e metilsucínico comprometem o metabolismo energético cerebral através da inibição de atividades enzimáticas essenciais para a produção e transporte de energia pela célula. É, portanto, possível que esse possa ser um dos mecanismos envolvidos com o dano cerebral que ocorre nos pacientes afetados por deficiência de SCAD.

Efeito da fenilalanina sobre a atividade da creatina quinase em córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causada pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase hepática (PAH) que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. Caracteriza-se clinicamente por retardo mental severo e, em alguns pacientes, por convulsões e eczema cutâneo. Bioquimicamente os pacientes afetados por esta doença apresentam acúmulo de Phe e seus metabólitos no sangue e nos tecidos. Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. O metabolismo energético cerebral é caracterizado por níveis altos e variáveis de síntese e de utilização de ATP. O cérebro contém altos níveis de creatinaquinase (CK), uma enzima que transferere reversivelmente um grupo fosforil entre ATP e creatina e entre ADP e fosfocreatina (PCr). Considerando que a CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com deficiência de energia cerebral e sabendo que a PKU está associada à redução de produção e de utilização de energia pelo cérebro, no presente trabalho verificamos a atividade da CK em homogeneizado total de córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos Wistar submetidos aos modelos experimentais agudo e crônico de hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e da α-metil-DL-fenilalanina (MePhe), um inibidor da PAH, nas mesmas estruturas de ratos Wistar de 22 dias de idade não tratados. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na atividade da CK nas estruturas cerebrais estudadas de ratos sujeitos a HPA. Também verificamos que Phe e MePhe inibiram in vitro a atividade da CK nas mesmas estruturas. O estudo da interação cinética entre Phe e MePhe, sugere a existência de um único sítio de ligação na CK para os dois compostos. Considerando a importância da CK para a manutenção do metabolismo energético cerebral, nossos resultados sugerem que a alteração da homeostasia energética pode contribuir para a neurotoxicidade da Phe na PKU.

Efeito da fenilalanina e da alanina sobre as atividades dos complexos da cadeia respiratória de córtex cerebral de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

Efeito dos ácidos D-2-hidroxiglutárico e L-2-hidroxiglutárico sobre vários parâmetros do metabolismo energético em cérebro, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos

As acidúrias L-2-hidroxiglutárica (LHGA) e D-2-hidroxiglutárica (DHGA) são distúrbios neurometabólicos hereditários caracterizados por extenso e severo dano cerebral, ocasionando predominantemente convulsões, coma e atrofia cerebral. Na LHGA, as lesões cerebrais ocorrem principalmente no cerebelo enquanto a maior parte do cérebro é afetada na DHGA. Além disso, hipotonia, fraqueza e hipotrofia muscular, bem como cardiomiopatia têm sido observadas nos pacientes afetados por essas acidemias orgânicas, com maior freqüência na DHGA. Bioquimicamente, ocorre acúmulo tecidual dos ácidos L- 2-hidroxiglutárico (LGA) e D-2-hidróxiglutárico (DGA), respectivamente, na LHGA e na DHGA. Além disso, elevadas concentrações urinárias de lactato, 2-cetoglutarato e outros metabólitos do ciclo de Krebs têm sido descritas em pacientes acometidos por essas patologias, sugerindo uma disfunção mitocondrial. mitocondrial. Tendo em vista que a etiopatogenia da disfunção tecidual nesses pacientes é desconhecida, o presente trabalho investigou o efeito in vitro dos ácidos LGA e DGA sobre diversos parâmetros do metabolismo energético celular. Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos DGA e LGA sobre a utilização de glicose e produção de CO2 em homogeneizados e fatias de córtex cerebral. Verificamos que o DGA reduziu significativamente tanto o consumo de glicose quanto a produção de CO2 pelo córtex cerebral, enquanto o LGA não demonstrou efeito sobre esses parâmetros. Além disso, o DGA inibiu significativamente a atividade da citocromo c oxidase em homogeneizado de córtex cerebral de ratos (35-95%), de forma dose-dependente, sem alterar a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória. A inibição verificada foi do tipo acompetitiva. Por outro lado, o LGA não alterou a atividade de nenhum dos complexos enzimático estudados. Posteriormente, avaliamos o efeito in vitro dos ácidos DGA e LGA sobre a atividade da creatina quinase (CK) em homogeneizado total e nas frações citosólica e mitocondrial de tecido cerebral, muscular esquelético e cardíaco de ratos. Os resultados mostraram que o DGA inibiu significativamente a atividade das isoformas mitocondrial e citosólica da CK em preparações de córtex cerebral, músculo esquelético de cardíaco. Por outro lado, tanto DGA quanto LGA inibiram seletivamente a isoforma mitocondrial em preparações de cerebelo. Estudos cinéticos mostraram um perfil não competitivo de inibição com relação à fosfocreatina para ambos os ácidos nos tecidos estudados. Além IV disso, observamos também que o efeito inibitório de ambos os ácidos foi totalmente revertido por glutationa reduzida, sugerindo uma modificação causada pelos metabólitos sobre os grupos sulfidrila, essenciais para a atividade da enzima. Nossos resultados sugerem que a inibição significativa causada pelo DGA sobre as atividades da citocromo c oxidase e da creatina quinase no córtex cerebral, assim como nos músculos cardíaco e esquelético poderiam explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da disfunção neurológica e anormalidades estruturais no sistema nervoso central, bem como a mitocondriopatia esquelética e a cardiomiopatia presente nos pacientes afetados por DHGA. Por outro lado, é possível que a inibição seletiva da creatina quinase mitocondrial provocada pelo LGA em cerebelo possa estar associada à degeneração cerebelar característica dos pacientes com LHGA.

Efeito da anoxia sobre o metabolismo de carboidratos no sistema nervoso central do caracol Megalobulimus oblongos (Gastropoda: Pulmonata)

No seu hábitat, muitos organismos, entre eles os caracóis, estão expostos a um grande número de variáveis ambientais como temperatura, umidade, fotoperiodicidade e disponibilidade de alimento. O caracol Megalobulimus oblongus é um gastrópode terrestre que, durante épocas de estiagem, costuma permanecer enterrado no solo. Com esse comportamento o animal evita a perda de água durante o período de seca, embora nessa condição (enterrado no solo) o animal tenha que enfrentar uma situação de disponibilidade de oxigênio reduzida (hipóxia). O metabolismo dos gastrópodes terrestres está baseado na utilização de carboidratos e as reservas desse polissacarídeo são depletadas durante situações de hipóxia/anoxia. Estudos sobre o metabolismo de moluscos frente a essas condições ambientais adversas, como a própria anoxia, têm sido realizados apenas em tecidos de reserva. Trabalhos relacionando o metabolismo do sistema nervoso durante essa situação são escassos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estudar o metabolismo de carboidratos do sistema nervoso central do caracol Megalobulimus oblongus submetido a diferentes períodos de anoxia e recuperação aeróbia pós-anoxia. Para isso, após o período experimental foram dosadas a concentração de glicogênio e a concentração de glicose livre nos gânglios do sistema nervoso central do animal, além da concentração de glicose hemolinfática. Juntamente com essa abordagem bioquímica, foi realizado um estudo histoquímico semiquantitativo com o objetivo de verificar a atividade da forma ativa da enzima glicogênio fosforilase (GFa) nos gânglios cerebrais dos caracóis submetidos aos períodos de anoxia e recuperação. Foi verificado um aumento da concentração de glicose hemolinfática após o período inicial de 1,5h de anoxia, que se manteve elevado ao longo de todo o período anóxico. A concentração de glicogênio estava significativamente reduzida às 12h de anoxia e a concentração de glicose livre permaneceu constante ao longo de todo o período anóxico, enquanto foi observada uma redução progressiva da GFa. Não foram verificadas mudanças significativas nesses metabólitos nos animais do grupo simulação (“sham”) quando comparados ao grupo controle basal. Durante o período de recuperação aeróbia após 3h de anoxia, os valores de glicose hemolinfática foram reduzidos, retornando aos valores basais após 3h de recuperação aeróbia. A atividade GFa, reduzida durante a anoxia, também retornou aos valores do grupo controle durante a fase de recuperação. A concentração de glicose livre teve uma queda significativa no tempo de 1,5h de recuperação e existiu uma tendência à redução do glicogênio do tecido nervoso às 3h de recuperação aeróbia. A enzima GFa retornou a sua atividade basal durante o período de recuperação. Os resultados sugerem que, em função da elevada concentração de glicose hemolinfática, outros tecidos possam estar fornecendo a glicose necessária para a manutenção do tecido nervoso de Megalobulimus oblongus durante a anoxia, enquanto a redução do glicogênio do tecido nervoso verificada às 12h de anoxia deva estar relacionada ao aumento de atividade do animal durante a escotofase (o grupo 12h de anoxia foi dissecado à noite) somado ao próprio efeito da anoxia. A redução da GFa ao longo do período anóxico pode indicar uma depressão metabólica no tecido nervoso. Durante o início da fase de recuperação aeróbia pós-anoxia, a queda da concentração de glicose livre e a tendência à redução na concentração de glicogênio podem estar relacionadas ao fornecimento da energia necessária para o restabelecimento dos estoques energéticos utilizados durante às 3h iniciais de anoxia, já que a glicose hemolinfática retornou à concentração basal. Como não foi verificada qualquer redução significativa durante às 3h iniciais de anoxia nas concentrações de glicose livre e de x glicogênio nos gânglios nervosos centrais de Megalobulimus oblongus, discute-se a possibilidade de que o tecido nervoso do caracol tenha utilizado reservas de fosfogênios e ATP para satisfazer suas demandas energéticas durante as 3h iniciais de ausência de oxigênio.

Avaliação da função pulmonar e estresse oxidativo em pacientes com insuficiência renal crônica em hemodiálise

A insuficiência renal crônica (IRC) é uma síndrome caracterizada pela perda geralmente progressiva e irreversível da função renal. O tratamento da IRC terminal envolve alguma forma de diálise ou transplante renal. O objetivo deste estudo foi avaliar a repercussão de uma sessão de hemodiálise (HD) na função pulmonar e estresse oxidativo de doentes renais crônicos. Foram estudados 33 pacientes, 17 mulheres e 16 homens com média de idade 42,76 ± 14,25 anos, que realizavam HD na Unidade de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Para participar do estudo, os pacientes não podiam apresentar doença pulmonar de base e nenhum episódio respiratório nos seis meses que o antecederam. A avaliação respiratória deu-se através de exames de espirometria, manovacuometria, oximetria e gasometria, realizados antes e após uma sessão de HD. As variáveis espirométricas foram analisadas em percentagens de valores de referência em substituição a valores absolutos com o objetivo de eliminar efeitos de idade, altura e sexo. A capacidade vital forçada (CVF), o volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) e o pico de fluxo expiratório (PFE) apresentaram um aumento significativo após sessão de HD. O fluxo expiratório forçado, 25 a 75% da manobra de capacidade vital forçada (FEF25-75%), também apresentou melhora após HD, porém, esta não foi estatisticamente significativa O aumento observado nas variáveis espirométricas se refletiu numa variação nos laudos espirométricos em 27% dos pacientes, ocorrendo principalmente naqueles que apresentavam quadro de distúrbio ventilatório restritivo. Houve um aumento significativo no número de espirometrias normais, passando de 12 (37%) para 17 (52%). A manovacuometria foi utilizada para medir a força muscular respiratória e os dados foram analisados em percentagens de valores previstos. A força muscular inspiratória e expiratória, medida pela pressão inspiratória máxima (PImáx) e pressão expiratória máxima (PEmáx) respectivamente, apresentaram aumento significativo. A oximetria não acompanhou as variáveis espirométricas e força muscular respiratória, permanecendo inalterada após HD. Isso pode ser explicado pelos resultados encontrados na gasometria, após HD houve um aumento substancial no pH e nos níveis de bicarbonato, caracterizando um quadro de alcalose metabólica. Observou-se também queda na pressão parcial de oxigênio e aumento na pressão parcial de dióxido de carbono, provavelmente na tentativa de restabelecer o valor do pH Assim, constatou-se que, mesmo sem apresentar sintomas respiratórios, pacientes renais crônicos, na maioria das vezes, apresentam alteração na função pulmonar que melhora após tratamento com HD. Dos 33 pacientes avaliados do ponto de vista respiratório, 17 foram selecionados para análise de estresse oxidativo. Utilizaram-se como critérios de exclusão, pacientes com doenças hepáticas, processos inflamatórios crônicos, doença cardíaca conhecida, tabagistas e alcoolistas. Como não existem valores de referência para estresse oxidativo, 18 indivíduos saudáveis e não fumantes formaram o grupo controle. A lipoperoxidação (LPO) em eritrócitos foi medida por quimiluminescência (QL). Os doentes renais crônicos apresentaram níveis expressivamente maiores que os controles, que permaneceram os mesmos após uma sessão de HD. O dano às proteínas no plasma observado através da técnica das carbonilas, não mostrou variação relevante após sessão de HD, e os níveis apresentados pelos pacientes foram significativamente superiores aos observados nos controles. Nos eritrócitos, o sistema antioxidante enzimático, foi verificado através da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Ambas apresentaram o mesmo perfil: atividade consideravelmente diminuída quando comparada com controles, não modificando após uma sessão de HD. No plasma, a capacidade antioxidante total (TRAP), foi muito superior nos pacientes quando comparados aos controles, com importante redução após sessão de HD Analisou-se também o metabolismo do óxido nítrico (NO) através de seus metabólitos: nitritos e nitratos. Os nitritos mostraram-se expressivamente aumentados nos doentes renais, e ainda mais após sessão de HD. Os nitratos quando comparados aos controles, apresentaram valor semelhante. Seus níveis aumentaram após tratamento, porém, de forma estatisticamente irrelevante. Portanto, após HD, houve incremento no estresse oxidativo caracterizado por elevação nos níveis de nitritos e redução do TRAP, apesar do dano a lipídios e proteínas não ter aumentado neste tempo de avaliação.

Alterações bioquímicas e comportamentais em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia

A homocistinúria é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase e é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Retardo mental, deficiência cognitiva, isquemia, convulsões e aterosclerose são achados clínicos comuns em pacientes homocistinúricos. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença são pouco conhecidos. Modelos animais experimentais de erros inatos do metabolismo são úteis para compreender a fisiopatologia dessas doenças em humanos. No nosso laboratório, já foram criados alguns modelos animais de algumas doenças metabólicas hereditárias, como, por exemplo, fenilcetonúria e hiperprolinemia tipo II. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Essa enzima é inibida por radicais livres e sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. A diminuição de energia cerebral e o estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o sistema nervoso central, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Por outro lado, a homocisteína tem sido considerada um fator de risco para o aparecimento dessas doenças. No sentido de ampliar o conhecimento das alterações bioquímicas envolvidas na gênese da disfunção neurológica característica da homocistinúria, esse trabalho teve como principal objetivo desenvolver um modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia em ratos. Utilizando esse modelo, verificamos a atividade da Na+,K+-ATPase e alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) em hipocampo de ratos. A aprendizagem e a memória na tarefa do labirinto aquático de Morris foram avaliadas em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia. Nesse trabalho, também estudamos o efeito in vitro dos metabólitos acumulados na homocistinúria, homocisteína e metionina, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividade da enzima citocromo c oxidase). Além disso, o efeito in vitro da homocisteína sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (potencial antioxidante total (TRAP), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) em hipocampo de ratos foi investigado. O tratamento crônico foi realizado do 6o ao 28o dia de vida, através de administrações subcutâneas de homocisteína, duas vezes ao dia, com intervalos de 8 horas. As doses de homocisteína administradas foram escolhidas com o objetivo de induzir concentrações plasmáticas de 0,4 a 0,5 mM, semelhantes àquelas encontradas em pacientes homocistinúricos. Através desse tratamento, também foram induzidas concentrações elevadas de homocisteína no cérebro de ratos. Os controles receberam solução salina em volumes semelhantes. Os resultados mostram que a administração crônica de homocisteína inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica, a produção de CO2 e a captação de glicose, assim como as atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase em hipocampo de ratos. Os animas tratados com homocisteína também apresentaram diminuição de memória na tarefa do labirinto aquático de Morris. Além disso, a homocisteína e a metionina inibiram a atividade da Na+,K+-ATPase de hipocampo de ratos in vitro. Estudos cinéticos sobre a inibição da Na+,K+-ATPase, causada pela homocisteína, também foram realizados. Os resultados mostraram que a homocisteína inibe a enzima de forma não-competitiva com o ATP como substrato. Também foi verificado que a incubação de homogeneizados de hipocampo com homocisteína diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação simultânea com alguns antioxidantes, tais como glutationa, ditiotreitol, cisteína e a enzima antioxidante superóxido dismutase preveniram esse efeito. Os metabólitos acumulados na homocistinúria também alteraram alguns parâmetros de metabolismo energético cerebral (produção de CO2 e lactato, captação de glicose e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) in vitro. Além disso, verificou-se que a homocisteína in vitro diminuiu o TRAP e aumentou a quantidade de TBARS, um marcador de lipoperoxidação, mas não alterou as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase. Os achados sugerem que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, a diminuição do metabolismo energético e o aumento do estresse oxidativo podem estar relacionados com as disfunções neurológicas características dos pacientes homocistinúricos.

Estudo químico e biológico em lupinus lanatus bentham (leguminosae-faboideae)

Flavonóides são compostos fenólicos de ampla ocorrência na natureza exercendo diversas funções fisiológicas nos vegetais. Na família Leguminosae estes metabólitos secundários exercem o papel de antimicrobianos (fitoalexina e/ou fitoanticipinas) e como moléculas sinalizadoras, na simbiose com bactérias do solo no processo de fixação biológica do Nitrogênio. O gênero Lupinus, pertencente a esta família, é encontrado em todas as regiões fisiográficas do estado do Rio Grande do Sul. Entretanto, não existem relatos de estudos químicos ou microbiológicos. Neste trabalho, foi analisado o perfil químico de folhas, flores, raízes, nódulos e legumes da espécie Lupinus lanatus. Foram isolados oito compostos fenólicos, dois deles não foram identificados devido ao baixo rendimento, um derivado do ácido cafeico isolado a partir das raízes teve sua estrutura parcialmente identificada. Quatro flavonóides tiveram suas estruturas elucidadas por métodos espectroscópicos e espectrométricos; três flavonas-C-glicosiladas: citisosídeo a partir das flores e folhas, ramnosil-O-vitexina e ramnosil-O-citisosídeo, a partir das folhas; e a isoflavona angustona A, a partir dos nódulos. Foi analisada a atividade antimicrobiana das flavonas pelo método da bioautografia frente a Bradyrhizobium sp. e Agrobacterium sp., microrganismos simbionte e patógeno, respectivamente, sendo que nenhum metabólito obteve resultado positivo, entretanto quando analisados pelo mesmo método frente a Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli o resultado foi positivo para ramnosil-O-vitexina. Foi avaliada a atividade antioxidante pelo método da DPPH para as flavonas, onde citisosídeo obteve resultado positivo.

Efeito in vitro de quinureninas sobre parâmetros bioquímicos do metabolismo enrgético em cérebro de ratos jovens

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista o pouco conhecimento a respeito do efeito das quinureninas sobre o metabolismo energético cerebral, e considerando que as concentrações de algumas quinureninas estão alteradas em várias doenças neurodegenerativas e que disfunção mitocondrial é uma importante característica dessas doenças, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns metabólitos da via das quinureninas, particularmente L-quinurenina, ácido quinurênico, 3-hidroxiquinurenina, ácido 3-hidroxi-antranílico, ácido antranílico e ácido quinolínico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que todas as quinureninas testadas, à exceção da L-quinurenina, aumentaram a captação de glicose e inibiram a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Além disso, o ácido quinurênico inibiu a atividade da enzima sucinato desidrogenase, a 3-hidroxiquinurenina inibiu a atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória, enquanto que o ácido 3-hidroxi-antranílico inibiu as atividades dos complexos I e II da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Já o ácido antranílico inibiu as atividades do complexo I-III da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Por outro lado, o ácido quinolínico inibiu apenas a atividade do complexo II, sem alterar as atividades dos outros complexos da cadeia transportadora de elétrons. Finalmente, observamos que nenhuma das substâncias testadas interferiu na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Esses resultados sugerem um bloqueio no ciclo do ácido cítrico, o qual poderia ser provocado pela inibição da cadeia respiratória ocasionada pelos metabólitos testados. Portanto nossos resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro por algumas quinureninas. Caso esses achados se confirmem in vivo, é possível que um prejuízo no metabolismo energético possa colaborar, ao menos em parte, para o comprometimento cerebral dos pacientes afetados por doenças em que há alteração nas concentrações desses compostos.

O efeito da N-acetilcisteína sobre a síndrome hepatopulmonar induzida por cirrose biliar e secundária em ratos

Este trabalho avaliou o potencial antioxidante da N-acetilcisteína (NAC) frente a síndrome hepatopulmonar, uma complicação da cirrose, no modelo de cirrose biliar secundária através da ligadura de ducto biliar em ratos. Foi utilizado ratos machos Wistar e investigou-se a integridade hepática através de enzimas séricas e a gasometria arterial, juntamente com o dano oxidativo, enzimas antioxidantes, nitratos totais, assim como a histologia através de hematoxilina e eosina do fígado e pulmão e picrosírius do fígado desses animais. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: CO – no qual foi simulado a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal; LDB – no qual foi realizada a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal; CO + NAC – no qual foi simulado a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal e recebeu tratamento com NAC após o 14º dia da cirurgia; LDB + NAC – no qual foi realizada a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal e recebeu tratamento com NAC após o 14º dia da cirurgia. A NAC foi administrada por via intraperitoneal, numa concentração de 10mg/Kg, durante 14 dias Foi observado melhora nos parâmetros enzimáticos e gasométricos após o tratamento com a NAC. Constatou-se redução do dano oxidativo, verificado pelas substâncias que reagem ao acido tiobarbitúrico (TBARS), assim como as enzimas antioxidantes, superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, que mostram-se com valores próximos ao do grupo controle após a administração da NAC. Na avaliação de nitratos totais, observou-se aumento na produção destes metabólitos no pulmão dos ratos cirróticos após o tratamento com NAC esses valores se equipararam ao grupo controle. Através da análise histológica, verificou-se nódulos de fibrose no tecido hepático e vasodilatação do tecido pulmonar, esses fenômenos foram revertidos após o uso da NAC. A partir desse dados, constatamos que a NAC mostra-se promissora no estudo das complicações hepáticas.

Modelagem da composição química do leite através de indicadores metabólicos em vacas leiteiras de alta produção

A lactação é um processo fisiológico complexo que ainda não foi compreendido na sua totalidade. Inúmeros fatores intervêm na síntese e secreção do leite, sendo os mais importantes a nutrição e o metabolismo endógeno dos nutrientes. A qualidade do leite é valorizada tanto pela sua composição química, como pelo conteúdo de células somáticas. No entanto, visando a comercialização do leite, as maiores mudanças e melhoras na qualidade podem ser atingidas através da manipulação da dieta dos animais, em especial em vacas leiteiras de alta produção. Avaliar os processos de absorção de alimentos, bem como o metabolismo catabólico e anabólico direcionado para a síntese do leite, têm sido uma grande preocupação na pesquisa de nutrição e bioquímica da produção animal. O principal objetivo da presente pesquisa foi gerar modelos matemáticos que pudessem explicar a participação de diferentes metabólitos sobre a composição química do leite. Neste intuito foram coletadas amostras de fluído ruminal, sangue, urina e leite de 140 vacas da raça Holandesa nas primeiras semanas de lactação e mantidas sob sistema semi-intensivo de produção e dieta controlada. Os animais foram selecionados de sistemas de produção no ecossistema do Planalto Médio de Rio Grande do Sul e foram amostrados em dois períodos climáticos críticos. No fluido ruminal foram avaliados o pH e o tempo de redução do azul de metileno. No sangue foram determinados os metabólitos: glicose, colesterol, β-hidroxibutirato (BHB), triglicerídeos, fructosamina, ácidos graxos não esterificados (NEFA), proteínas totais, albumina, globulina, uréia, creatinina, cálcio, fósforo e magnésio. As enzimas: aspartato amino transferase (AST), gama glutamil transferase (GGT) e creatina kinase (CK). Os hormônios: cortisol, insulina, triiodotironina (T3), tiroxina (T4), e leptina. Foi efetuado hemograma, para conhecer: hematócrito, hemoglobina, e contagem total e diferencial de células brancas. Na urina foram dosados: corpos cetônicos, pH e densidade. No leite foi determinada: proteína, gordura, lactose, sólidos totais, sólidos não gordurosos, contagem de células somáticas e uréia. Para a determinação de cada um dos metabólitos ou compostos foram usadas técnicas específicas validadas internacionalmente. Os diferentes valores obtidos constituíram os parâmetros básicos de entrada para a construção dos diversos modelos matemáticos executados para predizer a composição do leite. Mediante procedimentos de regressão linear múltipla algoritmo Stepwise, procedimentos de correlação linear simples de Pearson e procedimentos de análise computacional através de redes neurais, foram gerados diferentes modelos para identificar os parâmetros endógenos de maior relevância na predição dos diferentes componentes do leite. A parametrização das principais rotas bioquímicas, do controle endócrino, do estado de funcionamento hepático, da dinâmica ruminal e da excreção de corpos cetônicos aportou informação suficiente para predizer com diferente grau de precisão o conteúdo dos diferentes sólidos no leite. O presente trabalho é apresentado na forma de quatro artigos correspondentes aos parâmetros energéticos, de controle endócrino, modelagem matemática linear múltipla e predição através de Artificial Neural Networks (ANN).

Estabelecimento de escores histopatológicos de lesão hepática e determinação dos valores normais das enzimas aspartato aminotrasferase e creatina quinase em frangos de corte.

A aflatoxicose é uma doença causada pela ingestão de aflatoxinas, as quais constituem um grupo de metabólitos altamente tóxicos e carcinogênicos, produzidos principalmente pelos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. O mecanismo de ação das micotoxinas na célula animal ocorre na maioria das vezes, através de alterações dos processos metabólicos básicos e de alterações da função mitocondrial, da síntese protéica e de ácidos nucléicos, sendo este último um dos principais sítios de ação das aflatoxinas. A aflatoxicose pode se apresentar de duas formas. A forma aguda se caracteriza por desordem hepática, hemorragias e alta mortalidade; e a crônica, pela queda na produção, penas arrepiadas, paralisia imunossupressão e diarréia. Foram estudados 18 lotes de frangos de corte com 28 dias de idade, provenientes de seis produtores de nível bom produtivo, seis de nível médio e seis produtores de baixo nível de produção; totalizando 180 aves. As aves foram pesadas e sacrificadas, sendo coletadas amostras de fígados e de soros. Os fígados foram fixados em formalina a 10%, para análise histopatológica e congelados a -20°C para teste de ELISA. Das amostras de soro foram realizados testes de dosagem enzimática de aspartato aminotransferase (AST) e creatina quinase (CK) na tentativa de confirmar a lesão hepática. Os cortes histológicos de fígado foram analisados e escores de lesão estabelecidos para necrose e vacuolização dos hepatócitos, hiperplasia dos ductos biliares e infiltração periportal de células inflamatórias. Os escores de cada lesão foram comparados com os níveis de aflatoxina obtidos pelo teste de ELISA, com o peso das aves e com os valores de AST e CK. Além disso, foram comparados os níveis de aflatoxina com o peso dos frangos e com os valores enzimáticos. Por fim, estes valores de AST e CK foram relacionados com o peso dos frangos. Foi possível concluir que, nas condições estudadas, os escores de lesões hepáticas são inversamente proporcionais aos níveis de aflatoxina detectados nos fígados de frangos com 28 dias de idade. Observou-se também, que não há relação entre os valores de AST, em função dos níveis de lesão hepática e dos valores de aflatoxina detectados; e a dosagem de AST não se presta como teste preliminar para detecção de lesão hepática causada pela ingestão de aflatoxina em frangos de corte aos 28 dias de idade.

Efeito in vitro dos ácidos 2-metilacetoacético e 2-metil-3-hidroxibutírico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens

As deficiências da β-cetotiolase mitocondrial e da 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (MHBD) são erros inatos do catabolismo da isoleucina. Os pacientes afetados pela deficiência da β-cetotiolase apresentam crises agudas de cetose e acidose metabólica, podendo apresentar convulsões que podem evoluir ao coma e morte. Bioquimicamente, são caracterizados por excreção urinária aumentada de ácido 2-metilacetoacético (MAA), 2-metil-3-hidroxibutírico (MHB) e tiglilglicina (TG). Alguns indivíduos apresentam acidemia láctica durante as crises de descompensação metabólica. Por outro lado, os indivíduos afetados pela deficiência da MHBD são caracterizados por retardo mental, convulsões e acidose láctica severa, apresentando excreção urinária aumentada de MHB e TG. O aumento do ácido láctico em ambas as enfermidades sugere um comprometimento do metabolismo energético. Tendo em vista que os mecanismos fisiopatogênicos de ambas desordens são totalmente desconhecidos e que os achados bioquímicos sugerem um déficit na produção de energia dos pacientes, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do MAA e do MHB sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MAA inibiu a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato, indicando um bloqueio do ciclo do ácido cítrico. Em adição, o complexo II da cadeia respiratória bem como a enzima succinato desidrogenase foram inibidos na presença do MAA. Portanto, é possível que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição secundária do ciclo de Krebs. As enzimas Na+,K+-ATPase e creatina quinase (CK) não foram afetadas pelo MAA. O MHB inibiu a produção de CO2 a partir dos três substratos testados bem como o complexo IV da cadeia respiratória, sugerindo que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição da produção CO2 pelo ciclo de Krebs. A enzima Na+,K+- ATPase não foi afetada pelo ácido. No entanto, o MHB inibiu a atividade total da CK às custas da CK mitocondrial (mi-CK). A presença do inibidor da enzima óxido nítrico sintase L-NAME e do antioxidante glutationa reduzida (GSH) preveniram a inibição da atividade total da CK, enquanto que a GSH preveniu a inibição da mi-CK, sugerindo que os efeitos do MHB sobre a CK estejam relacionados à oxidação de grupamentos tióis essenciais à atividade enzimática. Tais resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro pelo MAA e pelo MHB. Caso estes achados se confirmem nas deficiências da β-cetotiolase e da MHBD, é possível que um prejuízo no metabolismo energético causado pelo acúmulo destes metabólitos possa explicar, ao menos em parte, o dano neurológico encontrado nos pacientes portadores destas doenças.

Angiotensina II bloqueia a consolidação e a evocação de memórias aversivas

O sistema renina - angiotensina tem um papel importante e bem descrito na modulação do sistema cardiovascular. Sua participação em processos cognitivos tem sido assunto de diversos trabalhos. É de particular interesse a modulação da memória pela ação de seus metabólitos funcionais, angiotensina II (AII) e IV (AIV), no sistema nervoso central. Apesar dos diversos trabalhos abordando o assunto, o papel da AII no processamento da memória continua controverso. Para tentar aprofundar essa questão utilizamos o paradigma da esquiva inibitória de uma única sessão em conjunto com a infusão intra-hipocampal de AII, AIV, e antagonistas AT1 ou AT2. Ratos foram implantados com cânulas na região CA1 do hipocampo dorsal, alguns dias depois da cirurgia foram treinados em uma tarefa de esquiva inibitória e, em tempos diferentes após o treino, foram infundidos com veículo ou uma das drogas descritas acima. Os animais foram testados 3 ou 24 h após o treino; no primeiro caso para avaliar memória de curta duração (STM) e para avaliar memória de longa duração (LTM) no segundo. Verificou-se um efeito amnésico para a AII na consolidação da LTM e STM quando infundida imediatamente ou 30 min pós-treino, e na evocação da LTM quando infundida 15 min antes do teste. O efeito amnésico da AII parece ser modulado exclusivamente por sua ação em receptores AT2, não tendo participação nem receptores AT1, nem sua conversão endógena em AIV. A AII endógena não parece ter qualquer participação na formação da memória de esquiva inibitória.

Inosina extracelular como intermediária na silnalização do TNF-alfa em células de sertóli em cultura

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.