Genetic Variability and Geographical Diversity of the Main Chagas' Disease Vector Panstrongylus megistus (Hemiptera: Triatominae) in Brazil Based on Ribosomal DNA Intergenic Sequences

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Narrow Fungal Mycorrhizal Diversity in a Population of the Orchid Coppensia doniana

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Yamadazyma riverae sp. nov., a yeast species isolated from plant materials

Nine strains of a novel yeast species were isolated from rotting wood, tree bark, ant nests or living as endophytes in leaves of Vellozia gigantea. Analysis of the sequences of the internal transcribed spacer (ITS) region and the D1/D2 domains of the large subunit rRNA gene showed that this species is related to Candida insectorum in the Yamadazyma clade. The new species differs from its closely related species by 10 and 11 substitutions in the ITS region and the D1/D2 domains of the large subunit of the rRNA gene, respectively. The species is heterothallic and forms asci with one to two hat-shaped ascospores. The name Yamadazyma riverae sp. nov. is proposed. The type strain of Yamadazyma riverae sp. nov. is UFMG-CM-Y444T (= CBS 14121) and the allotype strain is TT12 (= CBS 14098 = UFMG-CM-Y577). The Mycobank number is MB 813221.

Diagnóstico laboratorial de Mycobacterium spp. em Botucatu e região, utilizando a técnica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em material biológico e avaliação de condições associadas

Pós-graduação em Saúde Coletiva - FMB

Is Drosera meristocaulis a pygmy sundew? evidence of a long-distance dispersal between Western Australia and northern South America

Background and aims South America and Oceania possess numerous floristic similarities, often confirmed by morphological and molecular data. The carnivorous Drosera meristocaulis (Droseraceae), endemic to the Neblina highlands of northern South America, was known to share morphological characters with the pygmy sundews of Drosera sect. Bryastrum, which are endemic to Australia and New Zealand. The inclusion of D. meristocaulis in a molecular phylogenetic analysis may clarify its systematic position and offer an opportunity to investigate character evolution in Droseraceae and phylogeographic patterns between South America and Oceania. Methods Drosera meristocaulis was included in a molecular phylogenetic analysis of Droseraceae, using nuclear internal transcribed spacer (ITS) and plastid rbcL and rps16 sequence data. Pollen of D. meristocaulis was studied using light microscopy and scanning electron microscopy techniques, and the karyotype was inferred from root tip meristem. Key Results The phylogenetic inferences (maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian approaches) substantiate with high statistical support the inclusion of sect. Meristocaulis and its single species, D. meristocaulis, within the Australian Drosera clade, sister to a group comprising species of sect. Bryastrum. A chromosome number of 2n = approx. 32–36 supports the phylogenetic position within the Australian clade. The undivided styles, conspicuous large setuous stipules, a cryptocotylar (hypogaeous) germination pattern and pollen tetrads with aperture of intermediate type 7–8 are key morphological traits shared between D. meristocaulis and pygmy sundews of sect. Bryastrum from Australia and New Zealand. Conclusions The multidisciplinary approach adopted in this study (using morphological, palynological, cytotaxonomic and molecular phylogenetic data) enabled us to elucidate the relationships of the thus far unplaced taxon D. meristocaulis. Long-distance dispersal between southwestern Oceania and northern South America is the most likely scenario to explain the phylogeographic pattern revealed.

Examination of Homalometron elongatum Manter, 1947 and Description of a New Congener from Eucinostomus currani Zahuranec, 1980 in the Pacific Ocean off Costa Rica

Homalometron elongatum is reexamined using heat-killed material that was not subjected to pressure during fixation from Gerres cinereus collected from San Juan Harbor, Puerto Rico, U.S.A. The new material is compared with some paratype specimens and differs by having a much less variable forebody length, and a median rather than submedian genital pore. Tegumental spines reportedly cover the anterior end of the body but we observed tegumental spines covering the entire body surface in both the paratype and new material. Homalometron lesliorum n. sp. is described from Eucinostomus currani from the Pacific coasts of Costa Rica and Nicaragua. The new species has three pairs of oral papillae surrounding the mouth and thus resembles three other congeners: H. elongatum, Homalometron carapevae, and Homalometron papilliferum. Homalometron lesliorum n. sp. is distinguished from the three species by having the anterior extent of the vitelline follicles at or above the base of the ventral sucker, compared with posterior to the ventral sucker at the level of the seminal vesicle (H. elongatum) or further posterior at the posterior margin of the ovary (H. carapevae and H. papilliferum). The four species are further differentiated from one another by sucker width ratio, tegumental spine size and distribution, egg size, host preference, and biogeography. Comparison of nuclear ribosomal DNA (3' end of 18S, internal transcribed spacer [ITS]1, ITS2, and 5' end of 28S) between H. elongatum and H. lesliorum n. sp. revealed one variable base (n = 162) at the 3' end of 18S, 12 variable bases (n = 476) at ITS1, 10 variable bases (n = 310) at ITS2, and 11 variable bases (n = 1,325) at the 5' end fragment of 28S. Nuclear ribosomal DNA from Homalometron pallidum and Homalometron armatum are included for further comparison with H. elongatum and H. lesliorum n. sp.

The Selection Exerted by Oil Contamination on Mangrove Fungal Communities

Mangrove ecosystems are tropical environments that are characterized by the interaction between the land and the sea. As such, this ecosystem is vulnerable to oil spills. Here, we show a culture-independent survey of fungal communities that are found in the sediments of the following two mangroves that are located on the coast of Sao Paulo State (Brazil): (1) an oil-spill-affected mangrove and (2) a nearby unaffected mangrove. Samples were collected from each mangrove forest at three distinct locations (transect from sea to land), and the samples were analyzed by quantitative PCR and internal transcribed spacer (ITS)-based PCR-DGGE analysis. The abundance of fungi was found to be higher in the oil-affected mangrove. Visual observation and correspondence analysis (CA) of the ITS-based PCR-DGGE profiles revealed differences in the fungal communities between the sampled areas. Remarkably, the oil-spilled area was quite distinct from the unaffected sampling areas. On the basis of the ITS sequences, fungi that are associated with the Basidiomycota and Ascomycota taxa were most common and belonged primarily to the genera Epicoccum, Nigrospora, and Cladosporium. Moreover, the Nigrospora fungal species were shown to be sensitive to oil, whereas a group that was described as "uncultured Basidiomycota" was found more frequently in oil-contaminated areas. Our results showed an increase in fungal abundance in the oil-polluted mangrove regions, and these data indicated potential fungal candidates for remediation of the oil-affected mangroves.

Is Drosera meristocaulis a pygmy sundew? Evidence of a long-distance dispersal between Western Australia and northern South America

South America and Oceania possess numerous floristic similarities, often confirmed by morphological and molecular data. The carnivorous Drosera meristocaulis (Droseraceae), endemic to the Neblina highlands of northern South America, was known to share morphological characters with the pygmy sundews of Drosera sect. Bryastrum, which are endemic to Australia and New Zealand. The inclusion of D. meristocaulis in a molecular phylogenetic analysis may clarify its systematic position and offer an opportunity to investigate character evolution in Droseraceae and phylogeographic patterns between South America and Oceania. was included in a molecular phylogenetic analysis of Droseraceae, using nuclear internal transcribed spacer (ITS) and plastid rbcL and rps16 sequence data. Pollen of D. meristocaulis was studied using light microscopy and scanning electron microscopy techniques, and the karyotype was inferred from root tip meristem. The phylogenetic inferences (maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian approaches) substantiate with high statistical support the inclusion of sect. Meristocaulis and its single species, D. meristocaulis, within the Australian Drosera clade, sister to a group comprising species of sect. Bryastrum. A chromosome number of 2n approx. 3236 supports the phylogenetic position within the Australian clade. The undivided styles, conspicuous large setuous stipules, a cryptocotylar (hypogaeous) germination pattern and pollen tetrads with aperture of intermediate type 78 are key morphological traits shared between D. meristocaulis and pygmy sundews of sect. Bryastrum from Australia and New Zealand. The multidisciplinary approach adopted in this study (using morphological, palynological, cytotaxonomic and molecular phylogenetic data) enabled us to elucidate the relationships of the thus far unplaced taxon D. meristocaulis. Long-distance dispersal between southwestern Oceania and northern South America is the most likely scenario to explain the phylogeographic pattern revealed.

Evaluation of the genetic diversity of Histoplasma capsulatum var. capsulatum isolates from north-eastern Brazil

Since the beginning of the HIV epidemic, there has been a significant increase in the number of histoplasmosis cases in Ceara, a state in north-east Brazil. The lack of epidemiological data on the genotypes circulating in the north-east region shows the importance of more detailed studies on the molecular epidemiology of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in this region. Different molecular techniques have been used to better characterize the genetic profile of H. capsulatum var. capsulatum strains. The aim of this study was to analyse the genetic diversity of H. capsulatum var. capsulatum isolates in Fortaleza, the capital of Ceara, through the sequencing of the internal transcribed spacer (ITS)1-5.8S-ITS2 region, and establish the molecular profile of these isolates, along with strains from south-east Brazil, by RAPD analysis, featuring the different clusters in those regions. The isolates were grouped into two clusters. Cluster 1 included strains from the south-east and north-east regions with separation of isolates into three distinct subgroups (subgroups 1a, 1 b and 1 c). Cluster 2 included only samples from north-east Brazil. Sequencing of the ITS1 -5.8S-ITS2 region allowed the detection of two major clades, which showed geographical correlation between them and their subgroups. Therefore, it can be concluded that the H. capsulatum var. capsulatum isolates from Ceara have a high degree of genetic polymorphism. The molecular data also confirm that populations of this fungus are composed of different genotypes in Brazil and worldwide.

Genetic diversity and population structure of Musa accessions in ex situ conservation

Abstract Background Banana cultivars are mostly derived from hybridization between wild diploid subspecies of Musa acuminata (A genome) and M. balbisiana (B genome), and they exhibit various levels of ploidy and genomic constitution. The Embrapa ex situ Musa collection contains over 220 accessions, of which only a few have been genetically characterized. Knowledge regarding the genetic relationships and diversity between modern cultivars and wild relatives would assist in conservation and breeding strategies. Our objectives were to determine the genomic constitution based on Internal Transcribed Spacer (ITS) regions polymorphism and the ploidy of all accessions by flow cytometry and to investigate the population structure of the collection using Simple Sequence Repeat (SSR) loci as co-dominant markers based on Structure software, not previously performed in Musa. Results From the 221 accessions analyzed by flow cytometry, the correct ploidy was confirmed or established for 212 (95.9%), whereas digestion of the ITS region confirmed the genomic constitution of 209 (94.6%). Neighbor-joining clustering analysis derived from SSR binary data allowed the detection of two major groups, essentially distinguished by the presence or absence of the B genome, while subgroups were formed according to the genomic composition and commercial classification. The co-dominant nature of SSR was explored to analyze the structure of the population based on a Bayesian approach, detecting 21 subpopulations. Most of the subpopulations were in agreement with the clustering analysis. Conclusions The data generated by flow cytometry, ITS and SSR supported the hypothesis about the occurrence of homeologue recombination between A and B genomes, leading to discrepancies in the number of sets or portions from each parental genome. These phenomenons have been largely disregarded in the evolution of banana, as the “single-step domestication” hypothesis had long predominated. These findings will have an impact in future breeding approaches. Structure analysis enabled the efficient detection of ancestry of recently developed tetraploid hybrids by breeding programs, and for some triploids. However, for the main commercial subgroups, Structure appeared to be less efficient to detect the ancestry in diploid groups, possibly due to sampling restrictions. The possibility of inferring the membership among accessions to correct the effects of genetic structure opens possibilities for its use in marker-assisted selection by association mapping.

The capability of endophytic fungi for production of hemicellulases and related enzymes

Abstract Background There is an imperative necessity for alternative sources of energy able to reduce the world dependence of fossil oil. One of the most successful options is ethanol obtained mainly from sugarcane and corn fermentation. The foremost residue from sugarcane industry is the bagasse, a rich lignocellulosic raw material uses for the production of ethanol second generation (2G). New cellulolytic and hemicellulytic enzymes are needed, in order to optimize the degradation of bagasse and production of ethanol 2G. Results The ability to produce hemicellulases and related enzymes, suitable for lignocellulosic biomass deconstruction, was explored using 110 endophytic fungi and 9 fungi isolated from spoiled books in Brazil. Two initial selections were performed, one employing the esculin gel diffusion assay, and the other by culturing on agar plate media with beechwood xylan and liquor from the hydrothermal pretreatment of sugar cane bagasse. A total of 56 isolates were then grown at 29°C on steam-exploded delignified sugar cane bagasse (DEB) plus soybean bran (SB) (3:1), with measurement of the xylanase, pectinase, β-glucosidase, CMCase, and FPase activities. Twelve strains were selected, and their enzyme extracts were assessed using different substrates. Finally, the best six strains were grown under xylan and pectin, and several glycohydrolases activities were also assessed. These strains were identified morphologically and by sequencing the internal transcribed spacer (ITS) regions and the partial β-tubulin gene (BT2). The best six strains were identified as Aspergillus niger DR02, Trichoderma atroviride DR17 and DR19, Alternaria sp. DR45, Annulohypoxylon stigyum DR47 and Talaromyces wortmannii DR49. These strains produced glycohydrolases with different profiles, and production was highly influenced by the carbon sources in the media. Conclusions The selected endophytic fungi Aspergillus niger DR02, Trichoderma atroviride DR17 and DR19, Alternaria sp. DR45, Annulohypoxylon stigyum DR47 and Talaromyces wortmannii DR49 are excellent producers of hydrolytic enzymes to be used as part of blends to decompose sugarcane biomass at industrial level.

The capability of endophytic fungi for production of hemicellulases and related enzymes

Abstract BACKGROUND: There is an imperative necessity for alternative sources of energy able to reduce the world dependence of fossil oil. One of the most successful options is ethanol obtained mainly from sugarcane and corn fermentation. The foremost residue from sugarcane industry is the bagasse, a rich lignocellulosic raw material uses for the production of ethanol second generation (2G). New cellulolytic and hemicellulytic enzymes are needed, in order to optimize the degradation of bagasse and production of ethanol 2G. RESULTS: The ability to produce hemicellulases and related enzymes, suitable for lignocellulosic biomass deconstruction, was explored using 110 endophytic fungi and 9 fungi isolated from spoiled books in Brazil. Two initial selections were performed, one employing the esculin gel diffusion assay, and the other by culturing on agar plate media with beechwood xylan and liquor from the hydrothermal pretreatment of sugar cane bagasse. A total of 56 isolates were then grown at 29°C on steam-exploded delignified sugar cane bagasse (DEB) plus soybean bran (SB) (3:1), with measurement of the xylanase, pectinase, β-glucosidase, CMCase, and FPase activities. Twelve strains were selected, and their enzyme extracts were assessed using different substrates. Finally, the best six strains were grown under xylan and pectin, and several glycohydrolases activities were also assessed. These strains were identified morphologically and by sequencing the internal transcribed spacer (ITS) regions and the partial β-tubulin gene (BT2). The best six strains were identified as Aspergillus niger DR02, Trichoderma atroviride DR17 and DR19, Alternaria sp. DR45, Annulohypoxylon stigyum DR47 and Talaromyces wortmannii DR49. These strains produced glycohydrolases with different profiles, and production was highly influenced by the carbon sources in the media. CONCLUSIONS: The selected endophytic fungi Aspergillus niger DR02, Trichoderma atroviride DR17 and DR19, Alternaria sp. DR45, Annulohypoxylon stigyum DR47 and Talaromyces wortmannii DR49 are excellent producers of hydrolytic enzymes to be used as part of blends to decompose sugarcane biomass at industrial level.

Differences in Soil Fungal Communities between European Beech (Fagus sylvatica L.) Dominated Forests Are Related to Soil and Understory Vegetation

Fungi are important members of soil microbial communities with a crucial role in biogeochemical processes. Although soil fungi are known to be highly diverse, little is known about factors influencing variations in their diversity and community structure among forests dominated by the same tree species but spread over different regions and under different managements. We analyzed the soil fungal diversity and community composition of managed and unmanaged European beech dominated forests located in three German regions, the Schwäbische Alb in Southwestern, the Hainich-Dün in Central and the Schorfheide Chorin in the Northeastern Germany, using internal transcribed spacer (ITS) rDNA pyrotag sequencing. Multiple sequence quality filtering followed by sequence data normalization revealed 1655 fungal operational taxonomic units. Further analysis based on 722 abundant fungal OTUs revealed the phylum Basidiomycota to be dominant (54%) and its community to comprise 71.4% of ectomycorrhizal taxa. Fungal community structure differed significantly (p≤0.001) among the three regions and was characterized by non-random fungal OTUs co-occurrence. Soil parameters, herbaceous understory vegetation, and litter cover affected fungal community structure. However, within each study region we found no difference in fungal community structure between management types. Our results also showed region specific significant correlation patterns between the dominant ectomycorrhizal fungal genera. This suggests that soil fungal communities are region-specific but nevertheless composed of functionally diverse and complementary taxa.

Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group

Five isolates of non-pigmented, rapidly growing mycobacteria were isolated from three patients and,in an earlier study, from zebrafish. Phenotypic and molecular tests confirmed that these isolates belong to the Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group, but they could not be confidently assigned to any known species of this group. Phenotypic analysis and biochemical tests were not helpful for distinguishing these isolates from other members of the M. chelonae–M.abscessus group. The isolates presented higher drug resistance in comparison with other members of the group, showing susceptibility only to clarithromycin. The five isolates showed a unique PCR restriction analysis pattern of the hsp65 gene, 100 % similarity in 16S rRNA gene and hsp65 sequences and 1-2 nt differences in rpoB and internal transcribed spacer (ITS) sequences.Phylogenetic analysis of a concatenated dataset including 16S rRNA gene, hsp65, and rpoB sequences from type strains of more closely related species placed the five isolates together, as a distinct lineage from previously described species, suggesting a sister relationship to a group consisting of M. chelonae, Mycobacterium salmoniphilum, Mycobacterium franklinii and Mycobacterium immunogenum. DNA–DNA hybridization values .70 % confirmed that the five isolates belong to the same species, while values ,70 % between one of the isolates and the type strains of M. chelonae and M. abscessus confirmed that the isolates belong to a distinct species. The polyphasic characterization of these isolates, supported by DNA–DNA hybridization results,demonstrated that they share characteristics with M. chelonae–M. abscessus members, butconstitute a different species, for which the name Mycobacterium saopaulense sp. nov. is proposed. The type strain is EPM10906T (5CCUG 66554T5LMG 28586T5INCQS 0733T).

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.