Unveiling the components of the signaling pathway between endosomes and the phagocytic uptake machinery in Dictyostelium discoideum

The soil amoebae Dictyostelium discoideum take up particles from their environment in order to obtain nutrition. The particle transits through the cell within a phagosome that fuses with organelles of different molecular compositions, undergoing a gradual degradation by different sets of hydrolytic enzymes. Griffiths’ concept of “phagosome individuality” predicts signaling from phagosomes into the cytoplasm, which might regulate many aspects of cell physiology. The finding that Dictyostelium cells depleted of the lysozyme AlyA or over-expressing the esterase Gp70 exhibit increased uptake of food particles, led to the postulation of a signaling cascade between endocytic compartments and the cytoskeletal uptake machinery at the plasma membrane. Assuming that Gp70 acts downstream of AlyA, gene-expression profiling of both mutants revealed different and overlapping sets of misregulated genes that might participate in this signaling cascade. Based on these results, we analyzed the effects of the artificial misregulation of six candidate genes by over-expression or negative genetic interference, in order to reconstruct at least part of the signaling pathway. SSB420 and SSL793 were chosen as candidates for the first signaling step, as they were up-regulated in AlyA-null cells and remained unaltered in the Gp70 over-expressing cells. The over-expression of SSB420 enhanced phagocytosis and raised the expression levels of Gp70, supporting its involvement in the signaling pathway between AlyA and Gp70 as a positive regulator of phagocytosis. However, this was not the case of cells over-expressing SSL793, as this mutation had no effects on phagocytosis. For the signaling downstream of Gp70, we studied four commonly misregulated genes in AlyA-depleted and Gp70 over-expressing cells. The expression levels of SLB350, SSB389 and TipD were lower in both mutants and therefore these were assumed as possible candidates for the negative regulation of phagocytosis. Cells depleted of SLB350 exhibited an increased phagocytic activity and no effect on Gp70 expression, proving its participation in the signaling pathway downstream of Gp70. Unlike SLB350, the disruption of the genes coding for SSB389 and TipD had no effects on particle uptake, excluding them from the pathway. The fourth candidate was Yipf1, the only gene that was commonly up-regulated in both mutants. Yet, the artificial over-expression of this protein had no effects on phagocytosis, so this candidate is also not included in the signaling pathway. Furthermore, localizing the products of the candidate genes within the cell helped unveiling several cellular organelles that receive signals from the phagosome and transduce them towards the uptake machinery.

Impact of sward type, cutting date and conditioning temperature on mass and energy flows in the integrated generation of solid fuel and biogas from semi-natural grassland

Energy production from biomass and the conservation of ecologically valuable grassland habitats are two important issues of agriculture today. The combination of a bioenergy production, which minimises environmental impacts and competition with food production for land with a conversion of semi-natural grasslands through new utilization alternatives for the biomass, led to the development of the IFBB process. Its basic principle is the separation of biomass into a liquid fraction (press fluid, PF) for the production of electric and thermal energy after anaerobic digestion to biogas and a solid fraction (press cake, PC) for the production of thermal energy through combustion. This study was undertaken to explore mass and energy flows as well as quality aspects of energy carriers within the IFBB process and determine their dependency on biomass-related and technical parameters. Two experiments were conducted, in which biomass from semi-natural grassland was conserved as silage and subjected to a hydrothermal conditioning and a subsequent mechanical dehydration with a screw press. Methane yield of the PF and the untreated silage was determined in anaerobic digestion experiments in batch fermenters at 37°C with a fermentation time of 13-15 and 27-35 days for the PF and the silage, respectively. Concentrations of dry matter (DM), ash, crude protein (CP), crude fibre (CF), ether extract (EE), neutral detergent fibre (NDF), acid detergent fibre (ADF), acid detergent ligning (ADL) and elements (K, Mg, Ca, Cl, N, S, P, C, H, N) were determined in the untreated biomass and the PC. Higher heating value (HHV) and ash softening temperature (AST) were calculated based on elemental concentration. Chemical composition of the PF and mass flows of all plant compounds into the PF were calculated. In the first experiment, biomass from five different semi-natural grassland swards (Arrhenaterion I and II, Caricion fuscae, Filipendulion ulmariae, Polygono-Trisetion) was harvested at one late sampling (19 July or 31 August) and ensiled. Each silage was subjected to three different temperature treatments (5°C, 60°C, 80°C) during hydrothermal conditioning. Based on observed methane yields and HHV as energy output parameters as well as literature-based and observed energy input parameters, energy and green house gas (GHG) balances were calculated for IFBB and two reference conversion processes, whole-crop digestion of untreated silage (WCD) and combustion of hay (CH). In the second experiment, biomass from one single semi-natural grassland sward (Arrhenaterion) was harvested at eight consecutive dates (27/04, 02/05, 09/05, 16/05, 24/05, 31/05, 11/06, 21/06) and ensiled. Each silage was subjected to six different treatments (no hydrothermal conditioning and hydrothermal conditioning at 10°C, 30°C, 50°C, 70°C, 90°C). Energy balance was calculated for IFBB and WCD. Multiple regression models were developed to predict mass flows, concentrations of elements in the PC, concentration of organic compounds in the PF and energy conversion efficiency of the IFBB process from temperature of hydrothermal conditioning as well as NDF and DM concentration in the silage. Results showed a relative reduction of ash and all elements detrimental for combustion in the PC compared to the untreated biomass of 20-90%. Reduction was highest for K and Cl and lowest for N. HHV of PC and untreated biomass were in a comparable range (17.8-19.5 MJ kg-1 DM), but AST of PC was higher (1156-1254°C). Methane yields of PF were higher compared to those of WCD when the biomass was harvested late (end of May and later) and in a comparable range when the biomass was harvested early and ranged from 332 to 458 LN kg-1 VS. Regarding energy and GHG balances, IFBB, with a net energy yield of 11.9-14.1 MWh ha-1, a conversion efficiency of 0.43-0.51, and GHG mitigation of 3.6-4.4 t CO2eq ha-1, performed better than WCD, but worse than CH. WCD produces thermal and electric energy with low efficiency, CH produces only thermal energy with a low quality solid fuel with high efficiency, IFBB produces thermal and electric energy with a solid fuel of high quality with medium efficiency. Regression models were able to predict target parameters with high accuracy (R2=0.70-0.99). The influence of increasing temperature of hydrothermal conditioning was an increase of mass flows, a decrease of element concentrations in the PC and a differing effect on energy conversion efficiency. The influence of increasing NDF concentration of the silage was a differing effect on mass flows, a decrease of element concentrations in the PC and an increase of energy conversion efficiency. The influence of increasing DM concentration of the silage was a decrease of mass flows, an increase of element concentrations in the PC and an increase of energy conversion efficiency. Based on the models an optimised IFBB process would be obtained with a medium temperature of hydrothermal conditioning (50°C), high NDF concentrations in the silage and medium DM concentrations of the silage.

Regulation und Koordination der Proteinkinase A im cAMP-vermittelten Signalweg

Die cAMP-abhängige Proteinkinase ist an der Regulation grundlegender zellulärer Prozesse, wie Entwicklung und Differenzierung, sowie Stoffwechselprozessen, beteiligt. Das Holoenzym bestehend aus einem Dimer regulatorischer (R) und zwei katalytischer C (C) Untereinheiten wird durch den sekundären Botenstoff cAMP reguliert. Die molekulare Grundlage der Holoenzymdynamik, sowie die räumliche und zeitliche Koordination der Holoenzyme in der cAMP-vermittelten Signaltransduktion sind zentrale Themen der aktuellen Forschung. Die Dynamik wird in erster Linie durch die cAMP-Konzentration, die Isoenzymzusammensetzung und die Verfügbarkeit von Kinasesubstraten bestimmt. Klassischerweise wurde die Holoenzymdynamik auf Grundlage der Phosphotransferaseaktivität der C Untereinheit untersucht. Der Effekt von Substrat auf die apparenten Aktivierungskonstanten (cAMP) konnte aber so nicht bestimmt werden, sodass in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt werden musste, die unabhängig von der Messung der Substratphosphorylierung ist. Eine Validierung dieser SPR-basierten Methode erfolgte mit Typ-I Holoenzym, wobei eine leichtere Aktivierung in Gegenwart von Substrat bestätigt werden konnte. Überraschenderweise wurde mit dieser Methode der umgekehrte Effekt von Substratpeptid auf die Aktivierung des Typ-II Holoenzyms gemessen, wobei mit steigender Substratkonzentration größere apparente Aktivierungskonstanten bestimmt wurden. Durch gerichtete Mutationen der P0-Stelle in der Autoinhibitionsdomäne konnte diese Position als eine Hauptdeterminante für die Dynamik der Holoenzyme identifiziert werden. Im Allgemeinen führen Pseudosubstratinhibitoren (RI, RIIS99A) in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu einer Verkleinerung, und Substratinhibitoren (RII, RIA99S) zu einer Vergrößerung der apparenten Aktivierungskonstanten der entsprechenden Holoenzyme. Bei Untersuchungen zum Phosphostatus der hRII im Holoenzymkomplex sowie während der Dissoziation in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat, konnte mit Serin 58 eine zweite Autophosphorylierungsstelle in der Linkerregion identifiziert werden, die ein deutlich langsameres Laufverhalten in der SDS PAGE hervorruft. Allerdings konnte dieser Stelle keine Funktion im Bezug auf die Interaktion mit der katalytischen Untereinheit sowie ausgewählten AKAPs zugesprochen werden. In dieser Arbeit konnte ein gegensätzlicher Mechanismus zur Feinregulation der Dynamik des Typ-I und –II Holoenzyms durch Substrat gezeigt und die molekulare Grundlage aufgeklärt werden. Diese bisher nicht beschriebene Autophosphorylierungsstelle könnte eine wichtige Rolle in der Konformationskontrolle des N-Terminus spielen, oder als Plattform zur Wechselwirkung mit bisher unbekannten Interaktionspartnern der hRII dienen.

Untersuchungen zur Bedeutung der PKA für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster

Für die cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) in Drosophila melanogaster sind zwei regulatorische Untereinheiten (R1 und R2) und drei katalytische Untereinheiten (C1, C2 und C3) beschrieben. Außerdem gibt es eine weitere mögliche katalytische Untereinheit mit einer auffälligen Ähnlichkeit zu C2, dementsprechend C2-like genannt. Für R2, C2 und C2-like konnte bereits gezeigt werden, dass sie im Hodengewebe synthetisiert werden. Die Expression der verbleibenden PKA-Untereinheiten im Hodengewebe wurde in dieser Arbeit mit Hilfe von RT-PCR, Northern-Hybridisierungen, GFP-Reporter- bzw. GFP-Fusionskonstrukten untersucht. So konnte gezeigt werden, dass alle PKA-Untereinheiten im Hoden exprimiert werden. Dabei wird von jeder Untereinheit mindestens eine Isoform in den Keimzellen synthetisiert. R2 und C1 treten außerdem in den die Keimzellen umschließenden Zystenzellen auf, wobei R2 während der gesamten Spermatogenese exprimiert wird, C1 jedoch nur am Ende des Prozesses während des Stadiums der elongierten Spermatiden. In BRET-Analysen sind die beiden Untereinheiten in der Lage, miteinander zu interagieren. Somit könnten sie zusammen eine Funktion in den Zystenzellen vermitteln, die während der Differenzierungsphase stattfindet. Die katalytischen Untereinheiten C2, C2-like und zwei Isoformen von C3 (B und B') werden keimzellspezifisch exprimiert. Die BRET-Analysen lassen darauf schließen, dass C2 und C3 B’ möglicherweise keine funktionellen PKA-Untereinheiten sind. Auch der Versuch, durch Antisense- und RNAi-Konstrukte einen mutanten Phänotyp zu erzeugen, schlug fehl. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die beiden Untereinheiten C2 und C3 B’ gar keine oder zumindest keine essentielle Funktion während der Spermatogenese haben. Das C2-like as-Konstrukt führte hingegen zu einem starken Phänotyp. Schon eine geringe Reduktion der endogenen c2-like-mRNA führte zu einer starken Beeinträchtigung der männlichen Fertilität. Die elongierten Spermatiden zeigten einen Defekt in der Kernmorphologie und waren nicht in der Lage, Individualisierungskomplexe auszubilden. Dementsprechend fand keine Individualisierung statt und es konnten keine reifen Spermien in die Samenblase entlassen werden. Der mutante Phänotyp weist darauf hin, dass C2-like an mehreren Prozessen während der Keimzelldifferenzierung beteiligt ist. Gao et al. veröffentlichten 2008 Listen mit potentiellen PKA-Substraten für alle bekannten katalytischen Untereinheiten verschiedener Organismen. Zwei Substrat-Kandidaten für C2-like sind die testisspezifischen Serin/Threonin-Kinasen (TSSK) CG9222 und CG14305. Beide Proteine werden exklusiv im Hoden exprimiert. CG9222-GFP lokalisierte in die Individualisierungskomplexe (ICs) elongierter Spermatiden. Das entsprechende RNAi-Konstrukt zeigte allerdings keinen Effekt auf den Zusammenbau der ICs. Dagegen zeigte CG14305-GFP keine subzelluläre Lokalisierung, sondern war cytoplasmatisch über die gesamten Spermatiden verteilt. Das entsprechende RNAi-Konstrukt führte aber dazu, dass keine ICs ausgebildet werden. Beide Proteine spielen dementsprechend eine Rolle während der Individualisierung. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Phänotyp der C2-like as-mutanten Männchen. So ist es vorstellbar, dass CG9222 und CG14305 von C2-like phosphoryliert werden müssen, um ihre Funktion während der Individualisierung der Spermatiden erfüllen zu können. Ein direkter Nachweis, dass C2-like die beiden Proteine tatsächlich phosphorylieren kann, steht allerdings noch aus.

Untersuchungen zu kumulativen psychischen und physiologischen Effekten des fliegenden Personals auf der Kurzstrecke

Die fliegerische Tätigkeit auf der Kurzstrecke in der zivilen Luftfahrt unterliegt arbeitsspezifischen Belastungsfaktoren, die sich in wesentlichen Punkten von denen auf der Langstrecke unterscheiden. Eine hohe Arbeitsbelastung auf der Kurzstrecke ist mit vielen Starts und Landungen am Tag verbunden. Neben der Anzahl der Flugabschnitte können auch lange Flugdienstzeiten und/oder unregelmäßige Arbeitszeiten sowie der Zeitdruck während der Einsätze auf der Kurzstrecke zur Belastung für Cockpitbesatzungsmitglieder werden und zu Ermüdungserscheinungen führen. Bisher wurden flugmedizinische und -psychologische Daten hauptsächlich auf der Langstrecke in Bezug auf die Auswirkungen der Jet-Leg Symptomatik und kaum auf der Kurzstrecke erhoben. Deshalb wurde im Rahmen des DLR- Projekts „Untersuchungen zu kumulativen psychischen und physiologischen Effekten des fliegenden Personals auf der Kurzstrecke“ eine Langzeituntersuchung zur Belastung/Beanspruchung, Ermüdung sowie Erholung des Cockpitpersonals auf der Kurzstrecke über jeweils 56 Tage durchgeführt. In Zusammenarbeit mit der Deutschen Lufthansa AG dauerte die Untersuchung zu den Auswirkungen arbeitsspezifischer Belastungsfaktoren auf die Cockpitbesatzungsmitglieder der Boeing 737-Flotte von 2003 bis 2006. ZIEL: Unter Berücksichtigung theoretisch fundierter arbeitspsychologischer Konzepte war das Ziel der Studie, kumulative und akute Effekte auf das Schlaf-Wach-Verhalten, auf die Belastung/Beanspruchung sowie auf die Müdigkeit zu identifizieren, die durch aufeinander folgende Einsätze auf der Kurzstrecke innerhalb eines Zeitraums von acht Wochen auftreten können. Hierfür wurden Daten von 29 Piloten (N=13 Kapitäne; N=16 Erste Offiziere) aufgezeichnet. Das Durchschnittsalter lag bei 33,8 ± 7,9 Jahren (Kapitäne: 42,0 ± 3,8 Jahre; Erste Offiziere: 27,4 ± 2,2 Jahre). METHODEN: Über ein Handheld PC konnten effizient Fragebögen bearbeitet und das Sleep Log sowie das Flight Log geführt werden. Die subjektive Ermüdung und Arbeitsbeanspruchung wurden durch standardisierte Fragebögen (z.B. Ermüdungsskala von Samn & Perelli (1982), NASA-TLX) operationalisiert. Im Sleep Log und im Flight Log wurden das Schlaf-Wach-Verhalten sowie flugspezifische Daten dokumentiert (z.B. Dienstbeginn, Dienstende, Flugabschnitte, Zielorte, etc.). Der Schlaf-Wach-Zyklus wurde mittels der Aktimetrie während des gesamten Messverlaufs aufgezeichnet. Die objektive Leistungsfähigkeit wurde täglich morgens und abends mit Hilfe einer computergestützten Psychomotor Vigilance Task (PVT) nach Dinges & Powell (1985) erfasst. Die Leistung in der PVT diente als Indikator für die Ermüdung eines Piloten. Zusätzliche Befragungen mit Paper-Pencil-Fragebögen sollten Aufschluss über relevante, psychosoziale Randbedingungen geben, die bei den täglichen Erhebungen nicht berücksichtigt wurden (z.B. Arbeitszufriedenheit; Essgewohnheiten; Kollegenbeziehungen). ERGEBNISSE: Unter Beachtung kumulativer Effekte wurde über die Studiendauer keine Veränderung in der Schlafqualität und im Schlafbedürfnis festgestellt. Die Müdigkeit nahm dagegen während der achtwöchigen Untersuchung zu. Die Reaktionszeit in der PVT zeigte an Flugdiensttagen eine Verschlechterung über die Zeit. Insgesamt wurden keine kritischen längerfristigen Effekte analysiert. Akute signifikante Effekte wurden bei der Ermüdung, der Gesamtbelastung und der Leistungsfähigkeit an Flugdiensttagen gefunden. Die Ermüdung als auch die Gesamtbelastung stiegen bei zunehmender Flugdienstdauer und Leganzahl und die Leistung nahm in der PVT ab. Der „time on task“ Effekt zeigte sich besonders in der Ermüdung durch die fliegerische Tätigkeit ab einer Flugdienstzeit von > 10 Stunden und > 4 Legs pro Tag. SCHLUSSFOLGERUNG: Mit diesen Ergebnissen konnte eine wissenschaftliche Datenbasis geschaffen werden aus der Empfehlungen resultieren, wie die Einsatzplanung für das Cockpitpersonal auf der Kurzstrecke unter flugmedizinischen und flugpsychologischen Gesichtspunkten optimiert werden kann. Zudem kann ein sachgerechter Beitrag im Rahmen der Diskussion zur Flugdienst- und Ruhezeitenregelung auf europäischer Ebene geleistet werden.

Ermittlung geeigneter Methoden zur Differenzierung und Qualitätsbeurteilung unterschiedlicher Milchqualitäten aus verschiedenen on-farm-Experimenten

Zusammenfassung: Ziel der Arbeit war ein Methodenvergleich zur Beurteilung der Milchqualität unterschiedlicher Herkünfte. Am Beispiel von Milchproben aus unterschiedlicher Fütterung sowie an Milchproben von enthornten bzw. horntragenden Kühen wurde geprüft, welche der angewendeten Methoden geeignet ist, die Vergleichsproben zu unterscheiden (Differenzierungsfähigkeit der Methoden) und inwieweit eine Qualitätsbeurteilung möglich ist (hinsichtlich Milchleistung, Fett-, Eiweiß-, Lactose- (=F,E,L), Harnstoff-gehalt und Zellzahl (=SCC), Säuerungseigenschaften (=SE), Fettsäuremuster (=FS-Muster), Protein- und Metabolit-Zusammensetzung (=Pr&M), Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie-Eigenschaften (=FAS) und Steigbild-Merkmalen). Zusätzlich wurde vorab die Steigbildmethode (=SB-M) für das Produkt Rohmilch standardisiert und charakterisiert, um die Reproduzierbarkei der Ergebnisse sicherzustellen. Die Untersuchungen zur SB-M zeigten, dass es Faktoren gibt, die einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung aufweisen. Dazu gehören laborseitig die Klimabedingungen in der Kammer, die Verdünnungsstufe der Probe, die Standzeiten der Vorverdünnung (Reaktionen mit der Luft, Alterung usw.), und tagesspezifisch auftretende Effekte, deren Ursache unbekannt ist. Probenseitig sind sehr starke tierindividuelle Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung festzustellen, die unabhängig von Fütterung, Alter, Laktationsstadium und Genetik auftreten, aber auch Fütterungsbedingungen der Kühe lassen sich in der Bildmerkmals-Ausprägung wiederfinden. Die Art der Bildauswertung und die dabei berücksichtigten Bildmerkmale ist von großer Bedeutung für das Ergebnis. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten 46 Probenpaare (aus den Fütterungsvergleichen (=FV) und zur Thematik der Hörner) konnten in 91% der Fälle korrekt gruppiert werden. Die Unterschiede konnten benannt werden. Drei FV wurden auf drei biologisch-dynamischen Höfen unter Praxis-Bedingungen durchgeführt (on-farm-Experimente). Es wurden jeweils zwei vergleichbare Gruppen à mindestens 11 Kühen gebildet, die im Cross-Over-Design gefüttert wurden, mit Probennahme am 14. und 21. Tag je Periode. Es wurden folgende FV untersucht: A: Wiesenheu vs. Kleegrasheu (=KG-Heu), B: Futterrüben (=FuR) vs. Weizen (Ergänzung zu Luzernegrasheu ad lib.), C: Grassilage vs. Grasheu. Bei Versuch A sind die Futtereffekte am deutlichsten, Gruppeneffekte sind gering. Die Milch der Wiesenheu-Variante hat weniger CLA’s und n3- FS und mehr mittellangkettige FS (MCT-FS), das Pr&M-Muster weist auf „Gewebereifung und Ausdifferenzierung“ vs. bei KG-Heu „Nährstoff-fülle, Wachstum und Substanz-Einlagerung und die SB zeigen fein ausdifferenzierte Bildmerkmale. Bei Versuch B sind die Futtereffekte ähnlich groß wie die Gruppeneffekte. Bei vergleichbarer Milchleistung weist die Milch der FuR-Variante höhere F- und E-Gehalte auf, sie säuert schneller und mehr, das FS-Muster weist auf eine „intensive“ Fütterung mit vermehrt MCT- FS, und die Pr&M-Untersuchungen charakterisieren sie mit „Eisentransport und Fetttröpfchenbildung“ vs. bei Weizen „mehr Abwehr-, Regulations- und Transportfunktion“ /. „mehr Lipidsynthese“. Die SB charakterisieren mit „große, kräftige Formen, verwaschen“ vs. „kleine, ausdifferenzierte Bildmerkmal“ für FuR vs. Weizen. Die FAS charakterisiert sie mit „Saftfutter-typisch“ vs. „Samentypisch“. Versuch C weist die geringsten Futtereffekt auf, und deutliche Gruppen- und Zeiteffekte. Milchleistung und F,E,L-Gehalte zeigen keinen Futtereffekt. Die Milch der Heu-Variante säuert schneller, und sie weist mehr SCT und MCT- FS auf. Pr&M-Untersuchungen wurden nicht durchgeführt. Die SB charakterisieren bei Heumilch mit „fein, zart, durchgestaltet, hell“, bei Silagemilch mit „kräftig, wäßrig-verwaschen, dunkler“. Die FAS kann keine konsistenten Unterschiede ermitteln. Der Horn-Einfluß auf die Milchprobe wurde an 34 Probenpaaren untersucht. Von 11 Höfen wurden je zwei möglichst vergleichbare Gruppen zusammengestellt, die sich nur im Faktor „Horn“ unterscheiden, und im wöchentlichen Abstand drei mal beprobt. F,E,L, SCC und SE der Proben sowie die FAS-Messungen weisen keine konsistenten signifikanten Unterschiede zwischen den Horn-Varianten auf. Pr&M weisen bei den untersuchten Proben (von zwei Höfen) auf Horneffekte hin: bei Eh eine Erhöhung von Immun-Abwehr-Funktionen, sowie einer Abnahme phosphorylierter C3- und C6-Metabolite und Beta-Lactoglobulin. Mit den SB ließen sich für die gewählten Merkmale (S-Größe und g.B.-Intensität) keine Horneffekte feststellen. FS, Pr&M-Muster sowie Harnstoffgehalt und SB (und z.T. Milchleistung) zeigten je FV ähnliche Effekt-Intensitäten für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekte, und konnten die Cross-Over-Effekte gut wiedergeben. F- und E-Gehalte konnten neben tierindividuellen Effekten nur in FV B auch Futtereffekte aufzeigen. In FV C zeigten die SE der Proben den deutlichsten Futtereffekt, die anderen Methoden zeigten hier vorrangig Gruppen-Effekte, gefolgt von Futter- und Zeiteffekten. Die FAS zeigte den SB vergleichbare Ergebnisse, jedoch weniger sensibel reagierend. Die Interpretation von Qualitätsaspekten war bei konsistent differenzierbaren Proben (FV A, B, C) am fundiertesten mit Hilfe der FS möglich, da über die Synthese von FS und beeinflussende Faktoren schon vielfältige Erkenntnisse vorliegen. Das Pr&M-Muster war nach einer weiteren Methodenentwicklung bei der Deutung von Stoffwechselprozessen sehr hilfreich. Die FAS konnte z.T. eine zu der Fütterungsvariante passende Charakterisierung liefern. Für die SB-M fehlt es noch an Referenzmaterial, um Angaben zu Qualitätsaspekten zu machen, wenngleich Probenunterschiede aufgezeigt und Proben-Eigenschaften charakterisiert werden konnten.

Selbstassemblierte Monolagen und magnetisch strukturierte Submonolagen mit dia- und paramagnetischen Molekülen sowie Einzelmolekülmagneten auf Phthalocyanin- und Subphthalocyanin-Basis

Mit dieser Arbeit wurde die Selbstassemblierung von dia- und paramagnetischen Molekülen sowie Einzelmolekülmagneten auf Goldsubstraten und magnetisch strukturierten Substraten untersucht. Dazu wurden drei verschiedene Klassen an Phthalocyaninderivaten verwendet: Diamagnetische Subphthalocyanine, paramagnetische Phthalocyaninatometalle und Diphthalocyaninatolanthanidkomplexe. Alle synthetisierten Verbindungen sind peripher thioethersubstituiert. Die Alkylketten (a: n-C8H17, b: n-C12H25) vermitteln die Löslichkeit in vielen organischen Solventien und sorgen für eine geordnete Assemblierung auf einer Oberfläche, wobei die Bindung auf Gold hauptsächlich über die Schwefelatome stattfindet. Die aus Lösung abgeschiedenen selbstassemblierten Monolagen wurden mit XPS, NEXAFS-Spektroskopie und ToF-SIMS untersucht. Bei der Selbstassemblierung auf magnetisch strukturierten Substraten stehen die Moleküle unter dem Einfluss magnetischer Streufelder und binden bevorzugt nur in bestimmten Bereichen. Die gebildeten Submonolagen wurden zusätzlich mit X-PEEM untersucht. Die erstmals dargestellten Manganphthalocyanine [MnClPc(SR)8] 1 wurden ausgehend von MnCl2 erhalten. Hier fand bei der Aufarbeitung an Luft eine Oxidation zu Mangan(III) statt; +III ist die stabilste Oxidationsstufe von Mangan in Phthalocyaninen. Der Nachweis des axialen Chloridoliganden erfolgte mit Massenspektrometrie und FIR- sowie Raman-Spektroskopie. SQUID-Messungen haben gezeigt, dass die Komplexe 1 vier ungepaarte Elektronen haben. Bei den Subphthalocyaninen [BClSubpc(SR)6] 2 wurde der axiale Chloridoligand mit dem stäbchenförmigen Phenolderivat 29-H substituiert und die erfolgreiche Ligandensubstitution durch NMR- und IR-Spektroskopie sowie Massenspektrometrie an den Produkten [BSubpc(SR)6(29)] 30 belegt. Der Radikalcharakter der synthetisierten Terbiumkomplexe [Tb{Pc(SR)8}2] 3 wurde spektroskopisch nachgewiesen; SQUID-Messungen ergaben, dass es sich um Einzelmolekülmagnete mit einer Energiebarriere U des Doppelpotentialtopfs von 880 K oder 610 cm-1 bei 3a handelt. Zunächst wurden die SAMs der Komplexverbindungen 1, 2, 30 und 3 auf nicht magnetisch strukturierten Goldsubstraten untersucht. Die Manganphthalocyanine 1 bilden geordnete SAMs mit größtenteils flach liegenden Molekülen, wie die XPS-, NEXAFS- und ToF-SIMS-Analyse zeigte. Die Mehrzahl der Thioether-Einheiten ist auf Gold koordiniert und die Alkylketten zeigen ungeordnet von der Oberfläche weg. Bei der Adsorption findet eine Reduktion zu Mangan(II) statt und der axiale Chloridoligand wird abgespalten. Das beruht auf dem sog. Oberflächen-trans-Effekt. Im vorliegenden Fall übt die Metalloberfläche einen stärkeren trans-Effekt als der axiale Ligand aus, was bisher experimentell noch nicht beobachtet wurde. Die thioethersubstituierten Subphthalocyanine 2 und 30 sowie die Diphthalocyaninatoterbium-Komplexe 3 sind ebenfalls für SAMs geeignet. Ihre Monolagen wurden mit XPS und NEXAFS-Spektroskopie untersucht, und trotz einer gewissen Unordnung in den Filmen liegen die Moleküle jeweils im Wesentlichen flach auf der Goldoberfläche. Vermutlich sind bei diesen Systemen auch die Alkylketten größtenteils parallel zur Oberfläche orientiert. Im Gegensatz zu den Manganphthalocyaninen 1 tritt bei 2b, 30a, 30b und 3b neben der koordinativen Bindung der Schwefelatome auf Gold auch eine für Thioether nicht erwartete kovalente Au–S-Bindung auf, die durch C–S-Bindungsbruch unter Abspaltung der Alkylketten ermöglicht wird. Der Anteil, zu dem dieser Prozess stattfindet, scheint nicht mit der Molekülstruktur zu korrelieren. Selbstassemblierte Submonolagen auf magnetisch strukturierten Substraten wurden mit dem diamagnetischen Subphthalocyanin 2b hergestellt. Der Nachweis der Submonolagen war schwierig und gelang schließlich durch eine Kombination von ToF-SIMS, NEXAFS Imaging und X-PEEM. Die Analyse der ToF-SIMS-Daten zeigte, dass tatsächlich eine Modulation der Verteilung der Moleküle auf einem unterwärts magnetisch strukturierten Substrat eintritt. Mit X-PEEM konnte die magnetische Struktur der ferromagnetischen Schicht des Substrats direkt der Verteilung der adsorbierten Moleküle zugeordnet werden. Die Subphthalocyanine 2b adsorbieren nicht an den Domänengrenzen, sondern vermehrt dazwischen. Auf Substraten mit abwechselnd 6.5 und 3.5 µm breiten magnetischen Domänen binden die Moleküle bevorzugt in den Bereichen geringster magnetischer Streufeldgradienten, also den größeren Domänen. Solche Substrate wurden für die ToF-SIMS- und X-PEEM-Messungen verwendet. Bei größeren magnetischen Strukturen mit ca. 400 µm breiten Domänen, wie sie aufgrund der geringeren Ortsauflösung dieser Methode für NEXAFS Imaging eingesetzt wurden, binden die Moleküle dann in allen Domänen. Die diamagnetischen Moleküle werden nach dieser Interpretation aus dem inhomogenen Magnetfeld über der Probenoberfläche heraus gedrängt und verhalten sich analog makroskopischer Diamagnete. Die eindeutige Detektion der Moleküle auf den magnetisch strukturierten Substraten konnte bisher nur für die diamagnetischen Subphthalocyanine 2b erfolgen. Um die Interpretation ihres Verhaltens bei der Selbstassemblierung in einem inhomogenen Magnetfeld weiter voranzutreiben, wurde das Subphthalocyanin 37b dargestellt, welches ein stabiles organisches TEMPO-Radikal in seinem axialen Liganden enthält. Das paramagnetische Subphthalocyanin 37b sollte auf den magnetisch strukturierten Substraten in Regionen starker magnetischer Streufelder binden und damit das entgegengesetzte Verhalten zu den diamagnetischen Subphthalocyaninen 2b zeigen. Aus Zeitgründen konnte dieser Nachweis im Rahmen dieser Arbeit noch nicht erbracht werden.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

MEMS-based Tunable Optical Filter Arrays for Nano-Spectrometer in the Visible Spectral Range

Optische Spektrometer sind bekannte Instrumente für viele Anwendungen in Life Sciences, Produktion und Technik aufgrund ihrer guten Selektivität und Sensitivität zusammen mit ihren berührungslosen Messverfahren. MEMS (engl. Micro-electro-mechanical system)-basierten Spektrometer werden als disruptive Technologie betrachtet, in der miniaturisierte Fabry-Pérot Filter als sehr attraktiv für die optische Kommunikation und 'Smart Personal Environments', einschließlich des medizinischen Anwendungen, zu nennen sind. Das Ziel dieser Arbeit ist, durchstimmbare Filter-Arrays mit kostengünstigen Technologien herzustellen. Materialien und technologische Prozesse, die für die Herstellung der Filter-Arrays benötigt werden, wurden untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit, wurden durchstimmbare Fabry Pérot Filter-Arrays für den sichtbaren Spektralbereich untersucht, die als Nano-Spektrometer eingesetzt werden. Darüber hinaus wurde ein Modell der numerischen Simulation vorgestellt, die zur Ermittlung eines optimales geometrisches Designs verwendet wurde, wobei sich das Hauptaugenmerk der Untersuchung auf die Durchbiegung der Filtermembranen aufgrund der mechanischen Verspannung der Schichten richtet. Die geometrische Form und Größe der Filtermembranen zusammen mit der Verbindungsbrücken sind von entscheidender Bedeutung, da sie die Durchbiegung beeinflussen. Lange und schmale Verbindungsbrücken führen zur stärkeren Durchbiegung der Filtermembranen. Dieser Effekt wurde auch bei der Vergrößerung der Durchmesser der Membran beobachtet. Die Filter mit spiralige (engl. curl-bent) Verbindungsbrücken führten zu geringerer Deformation als die mit geraden oder gebogenen Verbindungsbrücken. Durchstimmbare Si3N4/SiO2 DBR-basierende Filter-Arrays wurden erfolgreich hergestellt. Eine Untersuchung über die UV-NIL Polymere, die als Opferschicht und Haltepfosten-Material der Filter verwendet wurden, wurde durchgeführt. Die Polymere sind kompatibel zu dem PECVD-Verfahren, das für die Spiegel-Herstellung verwendet wird. Die laterale Strukturierung der DBR-Spiegel mittels des RIE (engl. Reactive Ion Etching)-Prozesses sowie der Unterätz-Prozess im Sauerstoffplasma zur Entfernung der Opferschicht und zum Erreichen der Luftspalt-Kavität, wurden durchgeführt. Durchstimmbare Filter-Arrays zeigten einen Abstimmbereich von 70 nm bei angelegten Spannungen von weniger als 20 V. Optimierungen bei der Strukturierung von TiO2/SiO2 DBR-basierenden Filtern konnte erzielt werden. Mit der CCP (engl. Capacitively Coupling Plasma)-RIE, wurde eine Ätzrate von 20 nm/min erreicht, wobei Fotolack als Ätzmaske diente. Mit der ICP (engl. Inductively Coupling Plasma)-RIE, wurden die Ätzrate von mehr als 60 nm/min mit einem Verhältniss der Ar/SF6 Gasflüssen von 10/10 sccm und Fotolack als Ätzmasken erzielt. Eine Ätzrate von 80 bis 90 nm/min wurde erreicht, hier diente ITO als Ätzmaske. Ausgezeichnete geätzte Profile wurden durch den Ätzprozess unter Verwendung von 500 W ICP/300 W RF-Leistung und Ar/SF6 Gasflüsse von 20/10 sccm erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermöglichen die Realisierung eines breiten Spektralbereichs der Filter-Arrays im Nano-Spektrometer.

Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Translationskontrolle in der Spermatogenese von Drosophila: Charakterisierung eines regulatorischen mRNP-Komplexes

Während der Spermatogenese von Drosophila werden viele mRNAs zwar vor der Meiose transkribiert, dann aber durch Komplexbildung mit Proteinen stillgelegt und erst am Ende der Spermienentwicklung durch Veränderung desselben für die Translation freigegeben. Ein Beispiel hierfür ist die Mst87F mRNA. Während das cis-agierende Sequenzelement in der RNA seit langem bekannt ist, gestaltete sich die Suche nach den trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen schwierig. In meiner Diplomarbeit (Stinski, 2007) waren mithilfe von präparativen Shift-Experimenten (Auftrennung von RNP-Komplexen im elektrischen Feld) zwei vielversprechende Kandidaten identifiziert worden, die Proteine Exuperantia (Exu) und Purity of Essence (Poe). Ziel der vorliegenden Dissertation war zum einen die Aufklärung der Funktion dieser Kandidatenproteine und zum anderen die Identifizierung weiterer Kandidaten, die an der Komplexbildung und damit an der Regulation beteiligt sind. Dabei war die Hoffnung, sowohl Proteine zu finden, die die Repression vermitteln, als auch solche, die am Ende die Aktivierung ermöglichen. Durch eine Affinitätsreinigung, in der Mst87F-RNA mit einem ms2-Tag versehen über das MS2-Maltose binding protein an eine Amylose-Matrix gebunden und schließlich die Komplexe mit Maltose wieder eluiert wurden, ließen sich erneut das Exu-Protein und drei neue Kandidaten identifizieren: CG3213, CG12470 und CG1898. Das Protein Exu hat eindeutig eine Funktion bei der Translationskontrolle: seine Abwesenheit führt zum Abbau der kontrollierten mRNAs. Die Inkubation mit exu-defizientem Protein-Extrakt (aus Hoden) unterstützt keine RNP-Komplexbildung und aufgereinigtes Exu-His Fusionsprotein kann auch nicht direkt an die Mst87F mRNA binden. Ein exu-defizienter Proteinextrakt lässt sich aber durch die Zugabe von rekombinantem Exu-His komplettieren und es entsteht wieder ein starker mRNP-Komplex. Dies beweist, dass das Experiment im Prinzip korrekt verläuft und dass Exu für die Komplexbildung entscheidend ist. Darüber hinaus konnten durch eine Co-Immunpräzipitation mit dem Exu-GFP Fusionsprotein sowohl interagierende Proteine als auch in die RNP-Komplexe einbezogene mRNAs nachgewiesen werden. Vielversprechende Kandidatenproteine stammen von den Genen CG3213, dfmr1 und CG12470. Die durch cDNA-Synthese in den Komplexen nachgewiesenen mRNAs sind in aller Regel solche, die der Translationskontrolle unterworfen sind. Damit ist gezeigt, dass Exu Teil eines großen Proteinkomplexes ist oder zumindest mit ihm assoziiert ist, der auf viele translationskontrollierte Transkripte Einfluss nimmt. Die Mst87F mRNA wird zum Zeitpunkt der Translationsaktivierung sekundär polyadenyliert, das heißt ihre Länge wird größer und heterogen. In einer Mutante für das Kandidatengen poe wurde diese sekundäre Polyadenylierung plötzlich nicht mehr beobachtet und die RNA blieb auch bei Translationsaktivierung so groß wie in den frühen Stadien. So ergab sich die Möglichkeit, endlich zu prüfen, ob die sekundäre Polyadenylierung für die Translationsaktivierung von essentieller Bedeutung ist. Eine Serie von Fusionskonstrukten mit funktionstüchtigem TCE verhielten sich alle gleich. Die sekundäre Polyadenylierung fand nicht statt, aber das Transkript des Fusionsgens wurde zum richtigen Zeitpunkt translatiert. Somit ist dieser Prozess zumindest nicht generell für eine Translation zu diesem späten Zeitpunkt in der Spermiogenese notwendig. Ein quantitativer Effekt kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnten mit antisense Konstrukten mutante Phänotypen erzeugt werden. Solche Männchen waren ausnahmslos steril, was die Wichtigkeit des Proteins Poe für den Prozess der Spermienreifung belegt. Die Defekte zeigen sich spät während der Individualisierung, was mit der vermuteten Funktion übereinstimmen würde. Das Kandidatenprotein dFMR1 bindet allein an die Mst87F RNA und trägt zur Stärke des beobachtbaren Komplexes bei. Die Komplexbildung zeigt Salzabhängigkeit, wie sie für dFMR1 in anderen Zusammenhängen dokumentiert wurde. Dies unterstützt die obige Aussage und suggeriert, dass dFMR1 die Basis für den Komplexaufbau bildet. Das CPEB-homologe Kandidatenprotein Orb2 bindet ebenfalls allein an die Mst87F mRNA, hat aber keinen Einfluss auf die Repression oder die sekundäre Polyadenylierung. Eine Beteiligung an der Regulation wäre demnach eindeutig unterschiedlich zu der in anderen Fällen dokumentierten Rolle. Die Expression der Kandidatengene CG1898, CG3213 und CG12470 ist konform mit einer unterschiedlichen Beteiligung an der Translationskontrolle. Das erste Protein ist nur in prämeiotischen Stadien, das zweite durchgängig und das dritte nur in postmeiotischen Stadien nachzuweisen, was einer Funktion bei der Stillegung, während der gesamten inaktiven Phase bzw. bei der Aktivierung entsprechen könnte. Die verschiedenen Experimente identifizieren in mehreren Fällen die gleichen Kandidatenproteine und untermauern damit deren Bedeutung. Sie lassen vielfach konkrete Schlüsse auf die Art der Interaktionen zu, welche in einem Schema zusammengefasst werden.

Begleitpersonen in der stationären Kinderrehabilitation: Bedarf für psychologische Interventionen und Evaluation eines Betreuungsmodells (am Beispiel "Triple-P-Programm")

Begleitpersonen in der stationären Kinderrehabilitation: Bedarf für psychologische Interventionen und Evaluation eines Betreuungsmodells (am Beispiel „Triple-P-Programm”) Chronisch erkrankte Kinder im Vorschulalter, die eine stationäre Reha-Maßnahme absolvieren, werden üblicherweise von einer Bezugsperson (Elternteil oder nahe Verwandte) begleitet. Da diese sog. Begleitpersonen normalerweise nicht krank sind, sind psychologische Interventionen nicht vorgesehen. Dennoch hebt der VDR in seinem Rahmenkonzept hervor, dass Eltern sowohl über die Behandlung der Erkrankung ihres Kindes als auch über konsequente Erziehung informiert werden sollten. Diese Studie untersucht, ob psychologische Interventionen für Begleitpersonen sinnvoll und effektiv sind. Sie wurde in der Fachklinik Satteldüne der DRV Nord durchgeführt. Die Kinder, die in dieser Einrichtung behandelt werden, leiden an chronischen Erkrankungen wie Asthma, atopischer Dermatitis, Allergien und Infektanfälligkeit. 134 Begleitpersonen (127 Mütter und 7 Väter) nahmen an einer quasiexperimentellen Feldstudie teil. Zu Beginn der Reha-Maßnahme (t1) füllten sie Fragebögen zu ihrer psychischen Belastung und ihrem Erziehungsverhalten sowie zu Problemverhalten ihrer Kinder aus. Vier Wochen später zum Ende der Reha-Maßnahme (t2) beurteilten die Begleitpersonen und das Reha-Team den Reha-Erfolg der Kinder. Zu t1 zeigte diese Stichprobe ein überdurchschnittliches Ausmaß an psychischer Belastung, welches bei einem Drittel der Befragten ein klinisch relevantes Ausmaß erreichte. Die psychische Belastung zu t1 korrelierte negativ mit dem Reha-Erfolg der Kinder zum Ende der Behandlung (in der Einschätzung durch Begleitpersonen und Stationsärzte). Dysfunktionales Erziehungsverhalten zeigten 20 % der Begleitpersonen. Dieses korrelierte negativ mit dem Reha-Erfolg der Kinder (in der Einschätzung durch das Pflegepersonal). Es wurden positive Korrelationen zwischen dysfunktionalem Erziehungsverhalten sowie psychischer Belastung der Begleitpersonen und Verhaltensauffälligkeiten der Kinder gefunden. Das Ausmaß der Verhaltensauffälligkeiten lag bei Kleinkindern (bis drei Jahre, n=29) im durchschnittlichen – und bei Vorschulkindern (4-7 Jahre, n=94) im überdurchschnittlichen Bereich. Es zeigte sich ein starkes Interesse der Befragten, während der Reha-Maßnahme an psychologischen Interventionen teilzunehmen. Für das Entspannungstraining interessierte sich jede zweite Begleitperson und ein Drittel der Befragten hatte Interesse die Erziehungsberatung wahrzunehmen. Dennoch nahm nur ein geringer Anteil der anfänglich Interessierten tatsächlich an diesen Interventionen teil (Entspannungstraining: 23 %, Erziehungsberatung: 16 %, psychologische Einzelgespräche: 11,4 %). Es fanden sich signifikante positive Korrelationen zwischen der Zufriedenheit der Begleitpersonen mit der Reha-Maßnahme und a) dem Ausmaß der Erfüllung der Erwartungen der Begleitperson an die Reha-Maßnahme und b) dem Reha-Erfolg des Kindes (eingeschätzt durch die Begleitperson). Zudem zeigten Begleitpersonen, deren psychische Belastung während der Reha-Maßnahme anstieg, eine geringere Zufriedenheit mit der Reha-Maßnahme als diejenigen, deren psychische Belastung sich verringerte. Darüber hinaus wurden die Effekte von verschiedenen psychologischen Betreuungsmodellen für Begleitpersonen untersucht. In einer quasiexperimentellen Studie wurden 64 Begleitpersonen (63 Mütter, 1 Vater) auf zwei Gruppen aufgeteilt. Beide Gruppen konnten auf freiwilliger Basis am Psychologischen Standardprogramm für Begleitpersonen teilnehmen (Erziehungsberatung, psychologische Einzelgespräche, Entspannungstraining). Die 32 Begleitpersonen der EG nahmen zusätzlich an einer Triple-P-Gruppenintervention teil. Zu Beginn (t1) und zum Ende der vierwöchigen Behandlung (t2) sowie sechs Monate nach der Reha-Maßnahme (t3) wurden die Merkmale psychische Belastung und Erziehungsverhalten der Begleitpersonen sowie Problemverhalten der Kinder erhoben. An der Intervention Triple-P nahmen 64 % der Begleitpersonen teil; am Psychologischen Standardprogramm nur 22,7 %. Die Ergebnisse zu t2 zeigen positive Effekte der Behandlung: beide Gruppen verbesserten ihr Erziehungsverhalten, die psychische Belastung der Begleitpersonen und Verhaltensauffälligkeiten der Kinder verringerten sich. Die Verbesserung des Erziehungsverhaltens fiel zu t2 bei der EG signifikant stärker aus als bei der KG. Die Effekte auf das Erziehungsverhalten der Eltern und auf Verhaltensauffälligkeiten der Kinder hielten ein halbes Jahr an, da sie zu t3 erneut vorgefunden wurden. Ein nachhaltiger Effekt auf die psychische Belastung der Begleitpersonen lag nicht vor. Zu t3 wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen EG und KG gefunden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Studie, dass der Bedarf für psychologische Interventionen für Begleitpersonen in der stationären Kinderrehabilitation gerechtfertigt ist und eine Reduktion von psychischer Belastung und dysfunktionalem Erziehungsverhalten der Begleitperson den Reha-Erfolg des Kindes erhöhen kann. In Zukunft sind weitere Anstrengungen nötig, um die psychische Belastung von Begleitpersonen zu verringern, z.B. über eine stärkere Verpflichtung zur Teilnahme an den psychologischen Interventionen, eine bessere Verzahnung von ambulanten und stationären Interventionen und die kontinuierliche Evaluation von neuen psychologischen Interventionen.

Regional Labor Market Disparities

Regionale Arbeitsmärkte unterscheiden sich erheblich hinsichtlich wesentlicher Kennzahlen wie der Arbeitslosenquote, des Lohnniveaus oder der Beschäftigungsentwicklung. Wegen ihrer Persistenz sind diese Unterschiede von hoher Relevanz für die Politik. Die wirtschaftswissenschaftliche Literatur liefert bereits theoretische Modelle für die Analyse regionaler Arbeitsmärkte. In der Regel sind diese Modelle aber nicht dazu geeignet, regionale Arbeitsmarktunterschiede endogen zu erklären. Das bedeutet, dass sich die Unterschiede regionaler Arbeitsmärkte in der Regel nicht aus den Modellzusammenhängen selbst ergeben, sondern „von außen“ eingebracht werden müssen. Die empirische Literatur liefert Hinweise, dass die Unterschiede zwischen regionalen Arbeitsmärkten auf die Höhe der regionalen Arbeitsnachfrage zurückzuführen sind. Die Arbeitsnachfrage wiederum leitet sich aus den Gütermärkten ab: Es hängt von der Entwicklung der regionalen Gütermärkte ab, wie viele Arbeitskräfte benötigt werden. Daraus folgt, dass die Ursachen für Unterschiede regionaler Arbeitsmärkte in den Unterschieden zwischen den regionalen Gütermärkten zu suchen sind. Letztere werden durch die Literatur zur Neuen Ökonomischen Geographie (NÖG) untersucht. Die Literatur zur NÖG erklärt Unterschiede regionaler Gütermärkte, indem sie zentripetale und zentrifugale Kräfte gegenüberstellt. Zentripetale Kräfte sind solche, welche hin zur Agglomeration ökonomischer Aktivität wirken. Im Zentrum dieser Diskussion steht vor allem das Marktpotenzial: Unternehmen siedeln sich bevorzugt an solchen Standorten an, welche nahe an großen Märkten liegen. Erwerbspersonen wiederum bevorzugen solche Regionen, welche ihnen entsprechende Erwerbsaussichten bieten. Beides zusammen bildet einen sich selbst verstärkenden Prozess, der zur Agglomeration ökonomischer Aktivität führt. Dem stehen jedoch zentrifugale Kräfte gegenüber, welche eine gleichmäßigere Verteilung ökonomischer Aktivität bewirken. Diese entstehen beispielsweise durch immobile Produktionsfaktoren oder Ballungskosten wie etwa Umweltverschmutzung, Staus oder hohe Mietpreise. Sind die zentripetalen Kräfte hinreichend stark, so bilden sich Zentren heraus, in denen sich die ökonomische Aktivität konzentriert, während die Peripherie ausdünnt. In welchem Ausmaß dies geschieht, hängt von dem Verhältnis beider Kräfte ab. Üblicherweise konzentriert sich die Literatur zur NÖG auf Unterschiede zwischen regionalen Gütermärkten und geht von der Annahme perfekter Arbeitsmärkte ohne Arbeitslosigkeit aus. Die Entstehung und Persistenz regionaler Arbeitsmarktunterschiede kann die NÖG daher üblicherweise nicht erklären. An dieser Stelle setzt die Dissertation an. Sie erweitert die NÖG um Friktionen auf dem Arbeitsmarkt, um die Entstehung und Persistenz regionaler Arbeitsmarktunterschiede zu erklären. Sie greift dazu auf eine empirische Regelmäßigkeit zurück: Zahlreiche Studien belegen einen negativen Zusammenhang zwischen Lohn und Arbeitslosigkeit. In Regionen, in denen die Arbeitslosigkeit hoch ist, ist das Lohnniveau gering und umgekehrt. Dieser Zusammenhang wird als Lohnkurve bezeichnet. Auf regionaler Ebene lässt sich die Lohnkurve mithilfe der Effizienzlohntheorie erklären, die als theoretische Grundlage in der Dissertation Anwendung findet. Konzentriert sich nun die ökonomische Aktivität aufgrund der zentripetalen Kräfte in einer Region, so ist in diesem Zentrum die Arbeitsnachfrage höher. Damit befindet sich das Zentrum auf einer günstigen Position der Lohnkurve mit geringer Arbeitslosigkeit und hohem Lohnniveau. Umgekehrt findet sich die Peripherie auf einer ungünstigen Position mit hoher Arbeitslosigkeit und geringem Lohnniveau wieder. Allerdings kann sich die Lohnkurve in Abhängigkeit des Agglomerationsgrades verschieben. Das komplexe Zusammenspiel der endogenen Agglomeration mit den Arbeitsmarktfriktionen kann dann unterschiedliche Muster regionaler Arbeitsmarktdisparitäten hervorrufen. Die Dissertation zeigt auf, wie im Zusammenspiel der NÖG mit Effizienzlöhnen regionale Arbeitsmarktdisparitäten hervorgerufen werden. Es werden theoretische Modelle formuliert, die diese Interaktionen erklären und welche die bestehende Literatur durch spezifische Beiträge erweitern. Darüber hinaus werden die zentralen Argumente der Theorie einem empirischen Test unterworfen. Es kann gezeigt werden, dass das zentrale Argument – der positive Effekt des Marktpotentials auf die Arbeitsnachfrage – relevant ist. Außerdem werden Politikimplikationen abgeleitet und der weitere Forschungsbedarf aufgezeigt.

Effects of plant diversity on bioenergy parameters in grassland biomass

Extensive grassland biomass for bioenergy production has long been subject of scientific research. The possibility of combining nature conservation goals with a profitable management while reducing competition with food production has created a strong interest in this topic. However, the botanical composition will play a key role for solid fuel quality of grassland biomass and will have effects on the combustion process by potentially causing corrosion, emission and slagging. On the other hand, botanical composition will affect anaerobic digestibility and thereby the biogas potential. In this thesis aboveground biomass from the Jena-Experiment plots was harvested in 2008 and 2009 and analysed for the most relevant chemical constituents effecting fuel quality and anaerobic digestibility. Regarding combustion, the following parameters were of main focus: higher heating value (HHV), gross energy yield (GE), ash content, ash softening temperature (AST), K, Ca, Mg, N, Cl and S content. For biogas production the following parameters were investigated: substrate specific methane yield (CH4 sub), area specific methane yield (CH4 area), crude fibre (CF), crude protein (CP), crude lipid (CL) and nitrogen-free extract (NfE). Furthermore, an improvement of the fuel quality was investigated through applying the Integrated generation of solid Fuel and Biogas from Biomass (IFBB) procedure. Through the specific setup of the Jena-Experiment it was possible to outline the changes of these parameters along two diversity gradients: (i) species richness (SR; 1 to 60 species) and (ii) functional group (grasses, legumes, small herbs and tall herbs) presence. This was a novel approach on investigating the bioenergy characteristic of extensive grassland biomass and gave detailed insight in the sward-composition¬ - bioenergy relations such as: (i) the most relevant SR effect was the increase of energy yield for both combustion (annual GE increased by 26% from SR8→16 and by 65% from SR8→60) and anaerobic digestion (annual CH4 area increased by 22% from SR8→16 and by 49% from SR8→60) through a strong interaction of SR with biomass yield; (ii) legumes play a key role for the utilization of grassland biomass for energy production as they increase the energy content of the substrate (HHV and CH4 sub) and the energy yield (GE and CH4 area); (iii) combustion is the conversion technique that will yield the highest energy output but requires an improvement of the solid fuel quality in order to reduce the risk of corrosion, emission and slagging related problems. This was achieved through applying the IFBB-procedure, with reductions in ash (by 23%), N (28%), K (85%), Cl (56%) and S (59%) and equal levels of concentrations along the SR gradient.

Effects of tillage intensity on soil C, N, and P pools with different stability

Es ist bekannt, dass die Umsatzdynamik der organischen Substanz von der Bodenbearbeitungsintensität abhängt. Bis jetzt sind nur wenige Daten zum Einfluss der Bearbeitungsintensität und des Zwischenfruchtanbaus auf C-, N-, und P-Dynamik im Ober- (0-5 cm Tiefe) und Unterboden (5-25 cm Tiefe) von Lössböden verfügbar. Hauptziele dieser Arbeit waren die (i) Quantifizierung des Einflusses von verschiedenen langzeitig durchgeführten Bearbeitungssystemen auf labile, intermediäre, und passive C- und N-Pools; (ii) Quantifizierung des Einflusses dieser Systeme auf P-Fraktionen mit unterschiedlicher Verfügbarkeit für die Pflanzenaufnahme; (iii) Quantifizierung des Einflusses des Zwischenfruchtanbaus in Verbindung mit einer unterschiedlichen Einarbeitungstiefe der der Zwischenfrüchte auf mineralisierbares C und N. Die Ergebnisse des 1. und 2. Teilexperiments basieren auf Untersuchungen von 4 Langzeitfeldexperimenten (LFE) in Ost- und Süddeutschland, die zwischen 1990 und 1997 durch das Institut für Zuckerrübenforschung angelegt wurden. Jedes LFE umfasst 3 Bearbeitungssysteme: konventionelle Bearbeitung (CT), reduzierte Bearbeitung (RT) und Direktsaat (NT). Die Ergebnisse des 3. Teilexperiments basieren auf einem Inkubationsexperiment. Entsprechend den Hauptfragestellungen wurden folgende Untersuchungsergebnisse beschrieben: (i) Im Oberboden von NT wurden höhere labile C-Vorräte gefunden (C: 1.76 t ha-1, N: 166 kg ha-1), verglichen mit CT (C: 0.44 t ha-1, N: 52 kg ha-1). Im Gegensatz dazu waren die labile- C-Vorräte höher im Unterboden von CT mit 2.68 t ha-1 verglichen zu NT mit 2 t ha-1 und RT mit 1.87 t ha-1. Die intermediären C-Vorräte betrugen 73-85% der gesamten organischen C-Vorräte, intermediäre N-Vorräte betrugen 70-95% des Gesamt-N im Ober- und Unterboden und waren vielfach größer als die labilen und passiven C- und N-Vorräte. Nur im Oberboden konnte ein Effekt der Bearbeitungsintensität auf die intermediären N-Pools mit höheren Vorräten unter NT als CT festgestellt werden. Die passiven C- und N-Pools waren eng mit den mineralischen Bodeneigenschaften verbunden und unabhängig vom Bearbeitungssystem. Insgesamt hat sich gezeigt, dass 14 bis 22 Jahre durchgängige Direktsaatverfahren nur im Oberboden zu höheren labilen C- und N-Vorräten führen, verglichen zu konventionellen Systemen. Dies lässt eine tiefenabhängige Stärke der Dynamik der organischen Bodensubstanz vermuten. (ii) Die Konzentration des Gesamt-P (Pt) im Oberboden war höher in NT (792 mg kg-1) und ~15% höher als die Pt-Konzentration in CT (691 mg kg 1). Die Abnahme der Pt-Konzentration mit zunehmender Bodentiefe war höher in NT als in CT. Dies gilt auch für die einzelnen P-Fraktionen, ausgenommen der stabilsten P-Fraktion (residual-P). Generell hatte das Bearbeitungssystem nur einen kleinen Einfluss auf die P-Konzentration mit höheren Pt-Konzentrationen in Böden unter NT als CT. Dies resultiert vermutlich aus der flacheren Einarbeitung der Pflanzenreste als in CT. (iii) Im Zwischenfruchtexperiment war der Biomassezuwachs von Senf am höchsten und nimmt in der Reihenfolge ab (oberirdischer Ertrag in t / ha): Senf (7.0 t ha-1) > Phacelia (5.7 t ha-1) > Ölrettich (4.4 t ha-1). Damit war potentiell mineralisierbares C und N am höchsten in Böden mit Senfbewuchs. Kumulative CO2- und N2O-Emissionen während der Inkubation unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Zwischenfruchtvarianten und waren unabhängig von der Verteilung der Pflanzenreste im Boden. Die kumulativen ausgewaschenen mineralisierten N (Nmin)-Vorräte waren in den brachliegenden Böden am höchsten. Die Nmin-Vorräte waren 51-72% niedriger in den Varianten mit Zwischenfrucht und Einarbeitung verglichen zur Brache. In den Varianten ohne Einarbeitung waren die Nmin-Vorräte 36-55% niedriger verglichen zur Brache. Dies weißt auf einen deutlichen Beitrag von Zwischenfrüchten zur Reduzierung von Nitrat-Auswaschung zwischen Winter und Frühjahr hin. Insgesamt führte reduzierte Bearbeitung zu einer Sequestrierung von C und N im Boden und der Zwischenfruchtanbau führte zu reduzierten N-Verlusten. Die P-Verfügbarkeit war höher unter Direktsaat verglichen zur konventionellen Bearbeitung. Diese Ergebnisse resultieren aus den höheren Konzentrationen der OS in den reduzierten, als in den konventionellen Systemen. Die Ergebnisse zeigen deutlich das Potential von reduzierter Bearbeitung zur Sequestrierung von intermediärem C und N zur Reduzierung von klimarelevanten Treibhausgasen. Gleichzeitig steigen die Konzentrationen an pflanzenverfügaren P-Gehalten. Zwischenfrüchte führen auch zu einem Anstieg der C- und N-Vorräte im Boden, offensichtlich unabhängig von der Zwischenfruchtart.