Purification of mitochondrial RNase P in A. nidulans

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles.

Analyse de la corrélation conditionnelle dérivée de la coévolution d’un système de trois gènes par un modèle du maximum de vraisemblance

Les gènes codant pour des protéines peuvent souvent être regroupés et intégrés en modules fonctionnels par rapport à un organelle. Ces modules peuvent avoir des composantes qui suivent une évolution corrélée pouvant être conditionnelle à un phénotype donné. Les gènes liés à la motilité possèdent cette caractéristique, car ils se suivent en cascade en réponse à des stimuli extérieurs. L’hyperthermophilie, d’autre part, est interreliée à la reverse gyrase, cependant aucun autre élément qui pourrait y être associé avec certitude n’est connu. Ceci peut être dû à un déplacement de gènes non orthologues encore non résolu. En utilisant une approche bio-informatique, une modélisation mathématique d’évolution conditionnelle corrélée pour trois gènes a été développée et appliquée sur des profils phylétiques d’archaea. Ceci a permis d’établir des théories quant à la fonction potentielle du gène du flagelle FlaD/E ainsi que l’histoire évolutive des gènes lui étant liés et ayant contribué à sa formation. De plus, une histoire évolutive théorique a été établie pour une ligase liée à l’hyperthermophilie.

Phylogénomique des Archées

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées.

The Role of Specific Amino Acids in the Formation of Ternary Complexes in Nitrogenase Regulation in the Photosynthetic Bacterium Rhodobacter capsulatus

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +.

La RNase P mitochondriale chez Neurospora crassa

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée.

Dynamique saisonnière des communautés nitrifiantes dans un petit lac oligotrophe

Depuis la découverte d’archées capables d’oxyder l’ammoniac en milieu aérobie, de nombreuses études ont mesuré en simultané les taux de nitrification et la diversité des organismes oxydant l’ammoniac dans la colonne d’eau des milieux marins. Malgré l’importance globale des lacs d’eau douce, beaucoup moins d’études ont fait la même chose dans ces milieux. Dans cette étude, nous avons évalué l’importance de la nitrification et caractérisé la communauté microbienne responsable de la première étape limitante de la nitrification dans un lac tempéré durant une année entière. L’utilisation de traceur isotopique 15NH4 nous a permis de mesurer des taux d’oxydation d’ammoniac à deux profondeurs dans la zone photique tout au long de l’année. Les taux d’oxydation d’ammoniac varient de non détectable à 333 nmol L-1 j-1 avec un pic d’activité sous la glace. De toutes les variables environnementales mesurées, la concentration d’ammonium dans la colonne d’eau semble avoir le plus grand contrôle sur les taux d’oxydation d’ammoniac. Nous avons détecté la présence d’archées (AOA) et de bactéries oxydante d’ammoniac (BOA) à l’aide de tests par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ciblant une partie du gène ammoniac monoxygénase (amoA). Les AOA et les BOA ont été détectées dans la zone photique du lac, cependant seules les AOA étaient omniprésentes durant l’année. Le séquençage du gène amoA des archées révèle que la majorité des AOA dans le lac sont membres du groupe phylogénétique Nitrosotalea (également appelé SAGMGC-1 ou groupe I.1a associé), ce qui confirme la pertinence écologique de ce groupe dans les eaux douces oligotrophes. Globalement, nos résultats indiquent l’hiver comme étant un moment propice pour l’oxydation de l’ammoniac dans les lacs tempérés. Cette étude fournit un point de référence pour la compréhension du processus d’oxydation de l’ammoniac dans les petits lacs oligotrophes.

Halocin SH10 production by an extreme haloarchaeon Natrinema sp. BTSH10 isolated from salt pans of South India

Halobacteria, members of the domain Archaea that live under extremely halophilic conditions, are often considered as dependable source for deriving novel enzymes, novel genes, bioactive compounds and other industrially important molecules. Protein antibiotics have potential for application as preserving agents in food industry, leather industry and in control of infectious bacteria. Halocins are proteinaceous antibiotics synthesized and released into the environment by extreme halophiles, a universal characteristic of halophilic bacteria. Herein, we report the production of halocin (SH10) by an extremely halophilic archeon Natrinema sp. BTSH10 isolated from salt pan of Kanyakumari, Tamilnadu, India and optimization of medium for enhanced production of halocin. It was found that the optimal conditions for maximal halocin production were 42 C, pH 8.0, and 104 h of incubation at 200 rpm with 2% (V/V) inoculum concentration in Zobell’s medium containing 3 M NaCl, Galactose, beef extract, and calcium chloride as additional supplements. Results indicated scope for fermentation production of halocin for probable applications using halophilic archeon Natrinema sp. BTSH10

Protease Production by haloarchaea Natrinema sp. BTSH10 isolated from salt pan of South India

The present study led to the recognition of Natrinema sp. BTSH 10 isolated from saltern ponds, as an ideal candidate species for production of gelatinase, which was noted as a halozyme capable of showing enzyme activity in the presence of 15% NaCl. Results obtained during the course of the present study indicated potential for application of this enzyme in industrial catalysis that are performed in the presence of high concentrations of salt. The enzyme characteristics noted with this gelatinase also indicate the scope for probable applications in leather industry, meat tenderization, production of fish sauce and soy sauce. Since halophilic proteases are tolerant to organic solvents, they could be used in antifouling coating preparations used to prevent biofouling of submarine equipments. The gelatinase from haloarchaea could be considered as a probable candidate for peptide synthesis. However, further studies are warranted on this haloarcheal gelatinase particularly on structure elucidation and enzyme engineering to suit a wide range of applications. There is immense scope for developing this halozyme as an industrial enzyme once thorough biochemistry of this gelatinase is studied and a pilot scale study is conducted towards industrial production of this enzyme under fermentation is facilitated. Based on the present study it is concluded that haloarchaea Natrinema sp. that inhabit solar saltern ponds are ideal source for deriving industrially important halozymes and molecular studies on enzymes are prerequisite for their probable industrial applications. This is the first time this species of archaea is recognized as a source of gelatinase enzyme that has potential for industrial applications.

Studies on nitrifying microorganisms in Cochin Estuary and adjacent coastal waters

This thesis entitled “Studies on Nitrifying Microorganisms in Cochin Estuary and Adjacent Coastal Waters” reports for the first time the spatial andtemporal variations in the abundance and activity of nitrifiers (Ammonia oxidizingbacteria-AOB; Nitrite oxidizing bacteria- NOB and Ammonia oxidizing archaea-AOA) from the Cochin Estuary (CE), a monsoon driven, nutrient rich tropicalestuary along the southwest coast of India. To fulfil the above objectives, field observations were carried out for aperiod of one year (2011) in the CE. Surface (1 m below surface) and near-bottomwater samples were collected from four locations (stations 1 to 3 in estuary and 4 in coastal region), covering pre-monsoon, monsoon and post-monsoon seasons. Station 1 is a low saline station (salinity range 0-10) with high freshwater influx While stations 2 and 3 are intermediately saline stations (salinity ranges 10-25). Station 4 is located ~20 km away from station 3 with least influence of fresh water and is considered as high saline (salinity range 25- 35) station. Ambient physicochemical parameters like temperature, pH, salinity, dissolved oxygen (DO), Ammonium, nitrite, nitrate, phosphate and silicate of surface and bottom waters were measured using standard techniques. Abundance of Eubacteria, total Archaea and ammonia and nitrite oxidizing bacteria (AOB and NOB) were quantified using Fluorescent in situ Hybridization (FISH) with oligonucleotide probes labeled withCy3. Community structure of AOB and AOA was studied using PCR Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) technique. PCR products were cloned and sequenced to determine approximate phylogenetic affiliations. Nitrification rate in the water samples were analyzed using chemical NaClO3 (inhibitor of nitrite oxidation), and ATU (inhibitor of ammonium oxidation). Contribution of AOA and AOB in ammonia oxidation process was measured based on the recovered ammonia oxidation rate. The contribution of AOB and AOA were analyzed after inhibiting the activities of AOB and AOA separately using specific protein inhibitors. To understand the factors influencing or controlling nitrification, various statistical tools were used viz. Karl Pearson’s correlation (to find out the relationship between environmental parameters, bacterial abundance and activity), three-way ANOVA (to find out the significant variation between observations), Canonical Discriminant Analysis (CDA) (for the discrimination of stations based on observations), Multivariate statistics, Principal components analysis (PCA) and Step up multiple regression model (SMRM) (First order interaction effects were applied to determine the significantly contributing biological and environmental parameters to the numerical abundance of nitrifiers). In the CE, nitrification is modulated by the complex interplay between different nitrifiers and environmental variables which in turn is dictated by various hydrodynamic characteristics like fresh water discharge and seawater influx brought in by river water discharge and flushing. AOB in the CE are more adapted to varying environmental conditions compared to AOA though the diversity of AOA is higher than AOB. The abundance and seasonality of AOB and NOB is influenced by the concentration of ammonia in the water column. AOB are the major players in modulating ammonia oxidation process in the water column of CE. The distribution pattern and seasonality of AOB and NOB in the CE suggest that these organisms coexist, and are responsible for modulating the entire nitrification process in the estuary. This process is fuelled by the cross feeding among different nitrifiers, which in turn is dictated by nutrient levels especially ammonia. Though nitrification modulates the increasing anthropogenic ammonia concentration the anthropogenic inputs have to be controlled to prevent eutrophication and associated environmental changes.

Bacterial ecology of ancient Saharan salt-enrichment ponds at Teguidda-n-Tessoumt

Little is known about the bacterial ecology of evaporative salt-mining sites (salterns) of which Teguidda-n-Tessoumt at the fringe of the West-African Saharan desert in Niger is a spectacular example with its many-centuries-old and very colorful evaporation ponds. During the different enrichment steps of the salt produced as a widely traded feed supplement for cattle, animal manure is added to the crude brine, which is then desiccated and repeatedly crystallized. This study describes the dominant Bacteria and Archaea communites in the brine from the evaporation ponds and the soil from the mine, which were determined by PCR-DGGE of 16S rDNA. Correspondence analysis of the DGGE-community fingerprints revealed a change in community structure of the brine samples during the sequential evaporation steps which was, however, unaffected by the brine's pH and electric conductivity (EC). The Archaea community was dominated by a phylogenetically diverse group of methanogens, while the Bacteria community was dominated by gamma proteobacteria. Microorganisms contained in the purified salt product have the potential to be broadly disseminated and are fed to livestock across the region. In this manner, the salt mines represent an intriguing example of long-term human activity that has contributed to the continual selection, cultivation, and dissemination of cosmopolitan microorganisms.

Phylogeny, function, and evolution of the cupins, a structurally conserved, functionally diverse superfamily of proteins

The cupin superfamily is a group of functionally diverse proteins that are found in all three kingdoms of life, Archaea, Eubacteria, and Eukaryota. These proteins have a characteristic signature domain comprising two histidine- containing motifs separated by an intermotif region of variable length. This domain consists of six beta strands within a conserved beta barrel structure. Most cupins, such as microbial phosphomannose isomerases (PMIs), AraC- type transcriptional regulators, and cereal oxalate oxidases (OXOs), contain only a single domain, whereas others, such as seed storage proteins and oxalate decarboxylases (OXDCs), are bi-cupins with two pairs of motifs. Although some cupins have known functions and have been characterized at the biochemical level, the majority are known only from gene cloning or sequencing projects. In this study, phylogenetic analyses were conducted on the conserved domain to investigate the evolution and structure/function relationships of cupins, with an emphasis on single- domain plant germin-like proteins (GLPs). An unrooted phylogeny of cupins from a wide spectrum of evolutionary lineages identified three main clusters, microbial PMIs, OXDCs, and plant GLPs. The sister group to the plant GLPs in the global analysis was then used to root a phylogeny of all available plant GLPs. The resulting phylogeny contained three main clades, classifying the GLPs into distinct subfamilies. It is suggested that these subfamilies correlate with functional categories, one of which contains the bifunctional barley germin that has both OXO and superoxide dismutase (SOD) activity. It is proposed that GLPs function primarily as SODs, enzymes that protect plants from the effects of oxidative stress. Closer inspection of the DNA sequence encoding the intermotif region in plant GLPs showed global conservation of thymine in the second codon position, a character associated with hydrophobic residues. Since many of these proteins are multimeric and enzymatically inactive in their monomeric state, this conservation of hydrophobicity is thought to be associated with the need to maintain the various monomer- monomer interactions. The type of structure-based predictive analysis presented in this paper is an important approach for understanding gene function and evolution in an era when genomes from a wide range of organisms are being sequenced at a rapid rate.

Comparison of the euryarchaeal microbial community in guts and food-soil of the soil-feeding termite Cubitermes fungifaber across different soil types

Termites are an important component of tropical soil communities and have a significant affect on the structure and nutrient content of soil. Digestion in termites is related to gut structure, gut physico-chemical conditions and gut symbiotic microbiota. Here we describe the use of 16S rRNA gene sequencing and Terminal-restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) analysis to examine methanogenic Archaea (MA) in the guts and food-soil of the soil-feeder Cubitermes fungifaber Sjostedt across a range of soil types. If they are strictly vertically inherited, then MA in guts should be the same in all individuals even if the soils differ across sites. In contrast, gut MA should reflect what is present in soil if populations are merely a reflection of what is ingested as the insects forage. We show clear differences between the euryarchaeal communities in termite guts and in food-soils from five different sites. Analysis of 16S rRNA gene clones indicated little overlap between the gut and soil communities. Gut clones were related to a termite-derived Methanomicrobiales cluster, to Methanobrevibacter and, surprisingly, to the haloalkaliphile Natronococcus. Soil clones clustered with Methanosarcina, Methanomicrococcus or Rice Cluster I. T-RFLP analysis indicated that the archaeal communities in the soil samples differed from site to site, whereas those in termite guts were similar between sites. There was some overlap between the gut and soil communities but these may represent transient populations in either guts or soil. Our data does not support the hypothesis that termite gut MA are derived from their food soil but also does not support a purely vertical transmission of gut microflora.

Comparison of Euryarchaea strains in the guts and food-soil of the soil-feeding termite Cubitermes fungifaber across different soil types

Termites are an important component of tropical soil communities and have a significant effect on the structure and nutrient content of soil. Digestion in termites is related to gut structure, gut physicochemical conditions, and gut symbiotic microbiota. Here we describe the use of 16S rRNA gene sequencing and terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis to examine methanogenic archaea (MA) in the guts and food-soil of the soil-feeder Cubitermes fungifaber Sjostedt across a range of soil types. If these MA are strictly vertically inherited, then the MA in guts should be the same in all individuals even if the soils differ across sites. In contrast, gut MA should reflect what is present in soil if populations are merely a reflection of what is ingested as the insects forage. We show clear differences between the euryarchaeal communities in termite guts and in food-soils from five different sites. Analysis of 16S rRNA gene clones indicated little overlap between the gut and soil communities. Gut clones were related to a termite-derived Methanomicrobiales cluster, to Methanobrevibacter and, surprisingly, to the haloalkaliphile Natronococcus. Soil clones clustered with Methanosarcina, Methanomicrococcus, or rice cluster I. T-RFLP analysis indicated that the archaeal communities in the soil samples differed from site to site, whereas those in termite guts were similar between sites. There was some overlap between the gut and soil communities, but these may represent transient populations in either guts or soil. Our data do not support the hypothesis that termite gut MA are derived from their food-soil but also do not support a purely vertical transmission of gut microflora.

Isolation of haloarchaea that grow at low salinities

Archaea, the third domain of life, were long thought to be limited to environmental extremes. However, the discovery of archaeal 16S rRNA gene sequences in water, sediment and soil samples has called into question the notion of Archaea as obligate extremophiles. Until now none of these novel Archaea has been brought into culture, a critical step for discovering their ecological roles. We have cultivated three novel halophilic Archaea (haloarchaea) genotypes from sediments in which the pore-water salinity was close to that of seawater. All previously reported haloarchaeal isolates are obligate extreme halophiles requiring at least 9% w/v NaCl for growth and are typically the dominant heterotrophic organisms in salt and soda lakes, salt deposits and salterns. Two of these three newly isolated genotypes have lower requirements for salt than previously cultured haloarchaea and are capable of slow growth at seawater salinity (2.5% w/v NaCl). Our data reveal the existence of Archaea that can grow in non-extreme conditions and of a diverse community of haloarchaea existing in coastal salt marsh sediments. Our findings suggest that the ecological range of these physiologically versatile prokaryotes is much wider than previously supposed.

Analysis of the sulfate-reducing bacterial and methanogenic archaeal populations in contrasting Antarctic sediments

The distribution and activity of communities of sulfate-reducing bacteria (SRB) and methanogenic archaea in two contrasting Antarctic sediments were investigated. Methanogenesis dominated in freshwater Lake Heywood, while sulfate reduction dominated in marine Shallow Bay. Slurry experiments indicated that 90% of the methanogenesis in Lake Heywood was acetoclastic. This finding was supported by the limited diversity of clones detected in a Lake Heywood archaeal clone library, in which most clones were closely related to the obligate acetate-utilizing Methanosaeta concilii. The Shallow Bay archaeal clone library contained clones related to the C-1-utilizing Methanolobus and Methanococcoides and the H-2-utilizing Methanogenium. Oligonucleotide probing of RNA extracted directly from sediment indicated that archaea represented 34% of the total prokaryotic signal in Lake Heywood and that Methanosaeta was a major component (13.2%) of this signal. Archaea represented only 0.2% of the total prokaryotic signal in RNA extracted from Shallow Bay sediments. In the Shallow Bay bacterial clone library, 10.3% of the clones were SRB-like, related to Desulfotalea/Desulforhopalus, Desulfofaba, Desulfosarcina, and Desulfobacter as well as to the sulfur and metal oxidizers comprising the Desulfuromonas cluster. Oligonucleotide probes for specific SRB clusters indicated that SRB represented 14.7% of the total prokaryotic signal, with Desulfotalea/Desulforhopalus being the dominant SRB group (10.7% of the total prokaryotic signal) in the Shallow Bay sediments; these results support previous results obtained for Arctic sediments. Methanosaeta and Desulfotalea/Desulforhopalus appear to be important in Lake Heywood and Shallow Bay, respectively, and may be globally important in permanently low-temperature sediments.