Tyrphostin-A47 inhibitable tyrosine phosphorylation of flagellar proteins is associated with distinct alteration of motility pattern in hamster spermatozoa

To acquire fertilizing potential, mammalian spermatozoa must undergo capacitation and acrosome reaction. Our earlier work showed that pentoxifylline (0.45 mM), a sperm motility stimulant, induced an early onset of hamster sperm capacitation associated with tyrosine phosphorylation of 45-80 kDa proteins, localized to the mid-piece of the sperm tail. To assess the role of protein tyrosine phosphorylation in sperm capacitation, we used tyrphostin-A47 (TP-47), a specific protein tyrosine kinase inhibitor. The dose-dependent (0.1-0.5 mM) inhibition of tyrosine phosphorylation by TP-47 was associated with inhibition of hyperactivated motility and 0.5 mM TP-47-treated spermatozoa exhibited a distinct circular motility pattern. This was accompanied by hypo-tyrosine phosphorylation of 45-60 kDa proteins, localized to the principal piece of the intact-sperm and the outer dense fiber-like structures in detergent treated-sperm. Sperm kinematic analysis (by CASA) of spermatozoa, exhibiting circular motility (at 1st hr), showed lower values of straight line velocity, curvilinear velocity and average path velocity, compared to untreated controls. Other TP-47 analogues, tyrphostin-AG1478 and -AG1296, had no effect either on kinematic parameters or sperm protein tyrosine phosphorylation. These studies indicate that TP-47-induced circular motility of spermatozoa is compound-specific and that the tyrosine phosphorylation status of 45-60 kDa flagellum-localized proteins could be key regulators of sperm flagellar bending pattern, associated with the hyperactivation of hamster spermatozoa.

Sequential Assembly of an Active RNA Polymerase Molecule at the Air-Water Interface

At the heart of understanding cellular processes lies our ability to explore the specific nature of communication between sequential information carrying biopolymers. However, the data extracted from conventional solution phase studies may not reflect the dynamics of communication between recognized partners as they occur in the crowded cellular milieu. We use the principle of immobilization of histidine-tagged biopolymers at a Ni(II)-encoded Langmuir monolayer to study sequence-specific protein-protein interactions in an artificially crowded environment The advantage of this technique lies in increasing the surface density of one of the interacting partners that allows us to study macromolecular interactions in a controlled crowded environment, but without compromising the speed of the reactions. We have taken advantage of this technique to follow the sequential assembly process of the multiprotein complex Escherichia coil RNA polymerase at the interface and also deciphered the role of one of the proteins, omega (omega), in the assembly pathway. Our reconstitution studies indicate that in the absence of molecular chaperones or other cofactors, omega (omega) plays a decisive role in refolding the largest protein beta prime (beta') and its recruitment into the multimeric assembly to reconstitute an active RNA polymerase. It was also observed that the monolayer had the ability to distinguish between sequence-specific and -nonspecific interactions despite the immobilization of one of the biomacromolecules. The technique provides a universal two-dimensional template for studying protein-ligand interactions while mimicking molecular crowding.

A Transcript Cleavage Factor of Mycobacterium tuberculosis Important for Its Survival

After initiation of transcription, a number of proteins participate during elongation and termination modifying the properties of the RNA polymerase (RNAP). Gre factors are one such group conserved across bacteria. They regulate transcription by projecting their N-terminal coiled-coil domain into the active center of RNAP through the secondary channel and stimulating hydrolysis of the newly synthesized RNA in backtracked elongation complexes. Rv1080c is a putative gre factor (MtbGre) in the genome of Mycobacterium tuberculosis. The protein enhanced the efficiency of promoter clearance by lowering abortive transcription and also rescued arrested and paused elongation complexes on the GC rich mycobacterial template. Although MtbGre is similar in domain organization and shares key residues for catalysis and RNAP interaction with the Gre factors of Escherichia coli, it could not complement an E. coli gre deficient strain. Moreover, MtbGre failed to rescue E. coli RNAP stalled elongation complexes, indicating the importance of specific protein-protein interactions for transcript cleavage. Decrease in the level of MtbGre reduced the bacterial survival by several fold indicating its essential role in mycobacteria. Another Gre homolog, Rv3788 was not functional in transcript cleavage activity indicating that a single Gre is sufficient for efficient transcription of the M. tuberculosis genome.

Molecular mechanisms of interleukin-2 gene inducibility: developmental control and combinatorial action of transcription factors

Interleukin-2 is one of the lymphokines secreted by T helper type 1 cells upon activation mediated by T-cell receptor (TCR) and accessory molecules. The ability to express IL-2 is correlated with T-lineage commitment and is regulated during T cell development and differentiation. Understanding the molecular mechanism of how IL-2 gene inducibility is controlled at each transition and each differentiation process of T-cell development is to understand one aspect of T-cell development. In the present study, we first attempted to elucidate the molecular basis for the developmental changes of IL-2 gene inducibility. We showed that IL-2 gene inducibility is acquired early in immature CD4- CD8-TCR- thymocytes prior to TCR gene rearrangement. Similar to mature T cells, a complete set of transcription factors can be induced at this early stage to activate IL-2 gene expression. The progression of these cells to cortical CD4^+CD8^+TCR^(1o) cells is accompanied by the loss of IL-2 gene inducibility. We demonstrated that DNA binding activities of two transcription factors AP-1 and NF-AT are reduced in cells at this stage. Further, the loss of factor binding, especially AP-1, is attributable to the reduced ability to activate expression of three potential components of AP-1 and NF-AT, including c-Fos, FosB, and Fra-2. We next examined the interaction of transcription factors and the IL-2 promoter in vivo by using the EL4 T cell line and two non-T cell lines. We showed an all-or-none phenomenon regarding the factor-DNA interaction, i.e., in activated T cells, the IL-2 promoter is occupied by sequence-specific transcription factors when all the transcription factors are available; in resting T cells or non-T cells, no specific protein-DNA interaction is observed when only a subset of factors are present in the nuclei. Purposefully reducing a particular set of factor binding activities in stimulated T cells using pharmacological agents cyclosporin A or forskolin also abolished all interactions. The results suggest that a combinatorial and coordinated protein-DNA interaction is required for IL-2 gene activation. The thymocyte experiments clearly illustrated that multiple transcription factors are regulated during intrathymic T-cell development, and this regulation in tum controls the inducibility of the lineage-specific IL-2 gene. The in vivo study of protein-DNA interaction stressed the combinatorial action of transcription factors to stably occupy the IL-2 promoter and to initiate its transcription, and provided a molecular mechanism for changes in IL-2 gene inducibility in T cells undergoing integration of multiple environmental signals.

Identification and characterization of the egg-laying hormone from the neurosecretary bag cells of Aplysia

This investigation has resulted in the chemical identification and isolation of the egg-laying hormone from Aplysia californica, Aplysia vaccaria, and Aplysia dactylomela. The hormone, which was originally identified as the Bag Cell-Specific protein (BCS protein) on polyacrylamide gels, is a polypeptide of molecular weight ≈ 6000, which is localized in the neurosecretory bag cells of the parietovisceral ganglion and the surrounding connective tissue sheath which contains the bag cell axons. All three species produce a hormone of similar molecular weight, but varying electrophoretic mobility as determined on polyacrylamide gels. As tested, the hormone is completely cross-reactive among the three species.

Although the bag cells of sexually immature animals contain the active hormone, sexual maturation of the animal results in a 10-fold increase in the BCS protein content of these neurons.

A seasonal variation in the BCS protein content was also observed, with 150 times more hormone contained in the bag cells of Aplysia californica in August than in January. This correlates well with the variation in the animals' ability to lay eggs throughout the year (Strumwasser et al., 1969). There are some indications that the receptivity of the animal to the available hormone also fluctuates during the year, being lower in winter than in swmner. The seasonal rhythm of the other species, Aplysia vaccaria and Aplysia dactylomela, has not been investigated.

A polyacrylamide gel electrophoresis analysis of water-soluble proteins in Aplysia californica revealed several other nerve-specific proteins. One of these is also located in the bag cell somas and stains turquoise with Amido Schwarz. The function of this protein has not been investigated.

Investigations of nonhistone chromosomal proteins

The major nonhistone chromosomal proteins (NHC proteins) are a group of 14-20 acidic proteins associated with DNA in eukaryotic chromatin. In comparisons by SDS gel electrophoresis (molecular weight sieving) one observes a high degree of homology among the NHC protein fractions of different tissues from a given species. Tissue-specific protein bands are also observed. The appearance of a new NHC protein, A, in the NHC proteins of rat liver stimulated to divide by partial hepatectomy and of rat ascites cells suggests that this protein may play a role in preparing the cell for division. The NHC proteins of the same tissue from different species are also very similar. Quantitative but not qualitative changes in the NHC proteins of rat uterus are observed on stimulation (in vivo) with estrogen. These observations suggest that the major NHC proteins play a general role in chromatin structure and the regulation of genome expression; several may be enzymes of nucleic acid and histone metabolism and/or structural proteins analogous to histones. One such enzyme, a protease which readily and preferentially degrades histones, can be extracted from chromatin with 0.7 N NaCl.

Although the NHC proteins readily aggregate, they can be separated from histone and fractionated by ion exchange chromatography on Sephadex SE C-25 resin in 10 M urea-25% formic acid (pH 2.5). Following further purification, four fractions of NHC protein are obtained; two of these are single purified proteins, and the other two contain 4-6 and 4-7 different proteins. These NHC proteins show a ratio of acidic to basic amino acids from 2.7 to 1.2 and isoelectric points from apparently less than 3.7 to 8.0. These isolated fractions appear more soluble and easier to work with than any whole NHC protein preparation.

光敏核不育水稻叶片蛋白质的双向电泳分析及苗期的光周期反应

光敏核不育水稻农垦58S由晚粳农垦58突变形成。具有在适宜温度条件下，长日照诱导雄性不育、短日照诱导雄性可育的基本特性。光敏核不育水稻育性转换机理的阐明是两系法杂交稻技术的关键。 1.克隆光敏不育基因是研究光敏核不育水稻育性转换机理的一个重要方面，本文对通过反映农垦58S和农垦58遗传背景差异的蛋白质或受光周期调节的蛋白质实现克隆光敏不育基因的策略进行了可行性研究，得到以下结果： (1).利用双向电泳技术在光敏核不育水稻是58S叶片中发现一个不存在于农垦58的蛋白质，其分子量为59.8kDa，等电点pH为5.9（称为Pa），该蛋白的存在不受光照条件、发育时期的影响，反映出农垦58S与农垦58遗传背景的差异。 (2).Pa蛋白与农垦58S叶绿体P61蛋白具有相同的分子量、等电点和N－端氨基酸顺序，在不同品种水稻中具有相同的分布，因此它们很可能是同一个蛋白质分子。 (3).利用双向电泳技术发现P61(Pa)和P41蛋白不仅存在于光敏不育系中，也存在于常规可育粳稻中，与光敏不育性状没有平行关系。 (4).利用双向电脉技术发现10天14小时长日照能在农垦58S和农垦58中诱导一个分子量为36kDa、等电点pH为5.2的蛋白质（称为P_b)，该蛋白的表达受光敏色素的调控。因此P61（Pa）、P41及P_b蛋白均与光敏不育性状无直接关系，推测克隆这些蛋白的基因无法直接获得光敏不育基因。 2.在育性转换光周期敏感期已经发现长日照使农垦58S叶绿体发育不良，但在苗期光周期敏感期内，目前尚不知长日照是否会有同样的效应。本文以光周期对农垦58S苗期叶绿体发育的影响为主要内容，研究了农垦58S苗期的光周期反应，得到以下结果： (1).农垦58S从5叶龄期至6叶龄期开始对光周期敏感，短日照开始能诱导茎尖分化幼穗。 (2).不同的光周期对农垦58S 4叶龄期新展叶片叶绿体发育的影响无明显差异，叶结体结构与功能均表现正常。 (3).不同的光周期对农垦58S 6叶龄期新展叶片叶绿体发育的影响有明显差异。与短日照相比，长日照引起农垦58S部分叶绿体发育不良，导致光化学活性减弱、超分子结构异常。长日光周期对农垦58S叶绿体发育的不良效应可能是光周期敏感期内存在的一种特殊现象。

Expression of syncytin in leukemia and lymphoma cells

Syncytin is a placenta-specific protein and generally believed to play a pivotal role in syncytiotrophoblast morphogenesis. In this study, transcripts of this gene were quantified by real-time RT-PCR and the translated products were measured by an indirect immunofluorescence assay. Results showed that syncytin was found to be expressed in all nine leukemia and lymphoma cell lines studied albeit at different levels and in 43 peripheral blood samples of 57 leukemia or lymphoma patients. Neither the transcripts nor the translated syncytin was detected in blood samples of normal individuals. In conclusion, peripheral blood syncytin may serve as a marker for leukemia and lymphoma. ©

The receptor kinase family: primary structure of rhodopsin kinase reveals similarities to the beta-adrenergic receptor kinase.

Light-dependent deactivation of rhodopsin as well as homologous desensitization of beta-adrenergic receptors involves receptor phosphorylation that is mediated by the highly specific protein kinases rhodopsin kinase (RK) and beta-adrenergic receptor kinase (beta ARK), respectively. We report here the cloning of a complementary DNA for RK. The deduced amino acid sequence shows a high degree of homology to beta ARK. In a phylogenetic tree constructed by comparing the catalytic domains of several protein kinases, RK and beta ARK are located on a branch close to, but separate from the cyclic nucleotide-dependent protein kinase and protein kinase C subfamilies. From the common structural features we conclude that both RK and beta ARK are members of a newly delineated gene family of guanine nucleotide-binding protein (G protein)-coupled receptor kinases that may function in diverse pathways to regulate the function of such receptors.

Inhibition of the anaphase-promoting complex by the Xnf7 ubiquitin ligase.

Degradation of specific protein substrates by the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC) is critical for mitotic exit. We have identified the protein Xenopus nuclear factor 7 (Xnf7) as a novel APC inhibitor able to regulate the timing of exit from mitosis. Immunodepletion of Xnf7 from Xenopus laevis egg extracts accelerated the degradation of APC substrates cyclin B1, cyclin B2, and securin upon release from cytostatic factor arrest, whereas excess Xnf7 inhibited APC activity. Interestingly, Xnf7 exhibited intrinsic ubiquitin ligase activity, and this activity was required for APC inhibition. Unlike other reported APC inhibitors, Xnf7 did not associate with Cdc20, but rather bound directly to core subunits of the APC. Furthermore, Xnf7 was required for spindle assembly checkpoint function in egg extracts. These data suggest that Xnf7 is an APC inhibitor able to link spindle status to the APC through direct association with APC core components.

StaRProtein: a web server for prediction of stability of repeat proteins

Repeat proteins have become increasingly important due to their capability to bind to almost any proteins and the potential as alternative therapy to monoclonal antibodies. In the past decade repeat proteins have been designed to mediate specific protein-protein interactions. The tetratricopeptide and ankyrin repeat proteins are two classes of helical repeat proteins that form different binding pockets to accommodate various partners. It is important to understand the factors that define folding and stability of repeat proteins in order to prioritize the most stable designed repeat proteins to further explore their potential binding affinities. Here we developed distance-dependant statistical potentials using two classes of alpha-helical repeat proteins, tetratricopeptide and ankyrin repeat proteins respectively, and evaluated their efficiency in predicting the stability of repeat proteins. We demonstrated that the repeat-specific statistical potentials based on these two classes of repeat proteins showed paramount accuracy compared with non-specific statistical potentials in: 1) discriminate correct vs. incorrect models 2) rank the stability of designed repeat proteins. In particular, the statistical scores correlate closely with the equilibrium unfolding free energies of repeat proteins and therefore would serve as a novel tool in quickly prioritizing the designed repeat proteins with high stability. StaRProtein web server was developed for predicting the stability of repeat proteins.

Structure quaternaire des récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 et interaction avec leurs effecteurs

Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

Morphological and functional characterization of placenta during gestation in bovine clones derived by somatic nuclear transfer

La technique de clonage par transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) présente une page importante dans les annales scientifiques, mais son application pratique demeure incertaine dû à son faible taux de succès. Les anomalies placentaires et de développement fœtal se traduisent par des pertes importantes de gestation et des mortalités néonatales. Dans un premier temps, la présente étude a caractérisé les changements morphologiques des membranes fœtales durant la gestation clonée en les comparant à des gestations contrôles obtenues à partir de l’insémination artificielle. Les différentes anomalies morphologiques des placentomes telles que l’œdème chorioallantoique, la présence de zones hyperéchoiques et irrégulières dans la membrane amniotique et la présence de cellules inflammatoires dégénérées compromettent le développement fœtal normal de la gestation clonée. L’examen ultrasonographique représente une technique diagnostique importante pour faire le suivi d’une gestation et de caractériser les changements placentaires dans le cadre d’évaluation globale du bien-être fœtal. Le profil hormonal de trois stéroïdes (progestérone (P4), estrone sulfate (E1S), et œstradiol (E2)) et de la protéine B spécifique de gestation (PSPB) dans le sérum des vaches porteuses de clones SCNT a été déterminé et associé aux anomalies de gestations clonées. Une diminution de la P4 sérique au jour 80, une élévation du niveau de la concentration de la PSPB au jour 150, et une augmentation de la concentration d’E2 sérique durant le deuxième et troisième tiers de la gestation clonée coïncident avec les anomalies de gestation déjà reportées. Ces changements du profil hormonal associés aux anomalies phénotypiques du placenta compromettent le déroulement normal de la gestation clonée et gênent le développement et le bien-être fœtal. Sur la base des observations faites sur le placenta de gestation clonée, le mécanisme moléculaire pouvant expliquer la disparition de l’épithélium du placenta (l’interface entre le tissue maternel et le placenta) a été étudié. L’étude a identifié des changements dans l’expression de deux protéines d’adhérence (E-cadhérin et β-catenin) de cellules épithéliales pouvant être associées aux anomalies du placenta chez les gestations clonées. Le tissu de cotylédons provenant de gestations clonées et contrôles a été analysé par Western blot, RT-PCR quantitatif, et par immunohistochimie. Les résultats présentaient une diminution significative (p<0.05) de l’expression des dites protéines dans les cellules trophoblastiques chez les gestations clonées. Le RT-PCR quantitatif démontrait que les gènes CCND1, CLDN1 et MSX1 ciblés par la voie de signalisation de la Wnt/β-catenin étaient significativement sous exprimés. La diminution de l’expression des protéines E-cadherin et β-catenin avec une réduction de l’activation de la protéine β-catenin durant le période d’attachement de l’embryon peut potentiellement expliquer l’absence totale ou partielle de l’attachement des membranes fœtales au tissu maternel et éventuellement, l’insuffisance placentaire caractéristique des gestations clonées chez la vache. La caractérisation morphologique et fonctionnelle du placenta durant les gestations clonées à haut risque est essentielle pour évaluer le statut de la gestation. Les résultats de la présente étude permettront de prédire le développement et le bien-être fœtal de façon critique à travers un protocole standardisé et permettre des interventions médicales pour améliorer le taux de succès des gestations clonées chez les bovins.

Développement d’outils analytiques pour la détection de biomolécules directement dans des fluides sanguins

Cette thèse porte sur le développement de biocapteurs basés sur la technique de résonance des plasmons de surface (SPR) pour effectuer des analyses directement dans un fluide sanguin n’ayant subi aucune purification ou dilution. L’ensemble des biocapteurs discutés exploiteront un instrument SPR portable développé dans le groupe du professeur Masson. Le premier volet de la thèse portera sur le processus d’interférence lié à l’adsorption non spécifique du sérum à la surface du capteur. L’analyse des biomolécules adsorbées sera effectuée en combinant la SPR à la spectrométrie de masse. Les informations obtenues seront exploitées pour la construction de biocapteurs adaptés à l’analyse en milieu sanguin. Un premier biocapteur développé ciblera la protéine antigène prostatique spécifique (APS) contenue dans le sérum servant de biomarqueur pour dépister le cancer de la prostate. Pour détecter les faibles concentrations de cette protéine directement dans le sérum, un matériel plasmonique microstructuré sera utilisé pour amplifier les signaux obtenus et sera recouvert d’une monocouche peptidique minimisant l’adsorption non spécifique du sérum. L’instrument SPR aura été adapté pour permettre également la détection simultanée de fluorescence. Un test ELISA sera ainsi effectué en parallèle du test SPR. Chacune des techniques fournira un contrôle pour la deuxième, tout en permettant de détecter le biomarqueur au niveau requis pour dépister la maladie. La combinaison des deux méthodes permettra aussi d’élargir la gamme dynamique du test de dépistage. Pour terminer, l’instrument SPR portable sera utilisé dans le cadre de détection de petites biomolécules ayant un potentiel thérapeutique directement dans un échantillon de sang. Des peptides ayant une activité anti-athérosclérotique pourront ainsi être détectés à même un échantillon de sang ni purifié ni dilué, et ce à des concentrations de l’ordre du micromolaire. Une modification de la microfluidique via l’introduction d’une membrane poreuse au cœur de celle-ci sera la clé permettant d’effectuer de telles analyses. La présente thèse met de l’avant de nouvelles stratégies et des modifications instrumentales permettant d’analyser des protéines et des petites molécules directement dans un échantillon non purifié de sérum ou de sang. Les modifications apportées au système fluidique, à l’instrument SPR et au niveau du biocapteur employé permettront d’effectuer des biodétections dans des matrices aussi complexes que les fluides sanguins. Les présents travaux mettent en lumière la capacité d’un instrument SPR/fluorescence portable à faire en 12 minutes la biodétection d’un marqueur du cancer de la prostate directement dans un échantillon de sérum. Finalement, on rapporte ici un des premiers articles où un biocapteur SPR est utilisé à même un échantillon de sang non-purifié pour faire des biodétections.

L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.