油菜内源和外源蛋白的表达及环境因素的影响

植物与昆虫的互作关系是个长期进化的过程，虫害给农业生产带来巨大损失。本研究以甘蓝型油菜（Brassica napus）为例，研究了不同环境条件和遗传背景下外源基因的表达与效用，同时利用蛋白质组技术，研究了虫害损伤模拟条件下植物可能存在的内源抗性机制。甘蓝型油菜中转入了人工合成的Bt（Bacillus thuringiensis）杀虫基因，能使植物产生抗虫蛋白抵御虫害。我们在湖北湖南两个实验点进行了大田实验，按植株生长发育的4个不同时期从转基因植株的叶片上采样，研究抗虫蛋白在植物体内的表达动态。植株顶部第三片展开叶的Bt毒蛋白浓度在结荚期前随植物生长而不断增加，而在结荚期出现或增或减的现象。采样叶片的可溶性总蛋白浓度含量一直呈增加的趋势，直到结荚以后出现含量的明显降低。同时，收集了转基因油菜与湘油15号在田间自然杂交形成的杂交后代种子用于栽培，用GFP仪检测杂交后代的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein），并用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测并确认带有转基因的杂交植株。为了检测带有转基因的杂交后代油菜中Bt毒蛋白的杀虫效率，用对Bt毒蛋白敏感的试虫品系——初孵棉铃虫幼虫（Helicoverpa armigera）进行杀虫活性检测实验。结果表明，携带Bt基因的杂交湘油及其转基因亲本对试虫的体重增长量均产生了负面影响，可以推断在调查取样的植株生长发育阶段，转基因杂交后代与其转基因亲本植株的杀虫效率没有显著差异。转基因植物及其杂交后代中抗虫蛋白的持续表达及田间带有转基因的自播植物的出现会使害虫产生耐受抗性的潜在可能性增加。 相对于人为增加的抗虫基因，植物在长期对抗昆虫的过程中也进化形成了自我防御机制，能够产生特异的抗性蛋白来应对昆虫的取食。本研究用机械损伤模拟害虫取食，对比了油菜受到物理损伤前后可溶性总蛋白的含量变化并试图通过蛋白质组学技术来检测可能发生变化的蛋白质。Bradford定量测定发现，同一植株同一叶片损伤前后可溶性总蛋白含量差异显著，损伤后蛋白表达量显著增高。蛋白质组双向凝胶电泳及其差异分析显示，损伤前后有8个蛋白质点发生明显的上调或下调。选择其中2个差异蛋白点经过MALDI-TOF质谱鉴定，它们分别是Rubisco小亚基前体以及果糖－1，6－二磷酸醛缩酶和粪卟啉－3－氧化酶的混合物，这些蛋白质在其他植物的抗逆研究中也有报道，它们可能在油菜叶片应答机械损伤过程中对维持植物的生理功能也有重要作用。

水稻幼苗脱黄化过程以及灌浆期茎的蛋白质组学研究

水稻既是我国三大粮食作物之一，又是基因组学研究的模式材料，在生产实践和科学研究中都占有极其重要的地位。基因组学研究取得的巨大成就以前所未有的深度和广度推动了生命科学各个研究领域的飞速发展。水稻基因组的破译是水稻科学研究的重要里程碑，同时也宣告了功能基因组学时代的到来。蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的动态表达及其相互关系的新兴学科，是功能基因组学研究的重要组成部分和战略制高点。 本论文采用高分辨率的蛋白质双向电泳分离技术和高通量的蛋白质质谱分析技术以及生物信息学等手段，开展水稻灌浆期茎蛋白质组表达模式和水稻幼苗脱黄化过程的比较蛋白质组学研究，探讨茎生长发育规律和水稻应答光信号相关蛋白质及其网络调控机制，是学科前沿与实际应用的有机结合，在科研和生产实践中都具有重要的意义。 首先，分别构建了灌浆期水稻顶端茎段和水稻黄化幼苗的蛋白质组表达谱。并对其中185个目的蛋白点进行了MALDI-TOF/MS分析和数据库检索鉴定。共有149个蛋白质得到了鉴定，蛋白质鉴定的成功率为80.5％。这些被鉴定的蛋白质分属118个基因的表达产物，根据它们功能可以分为13种不同的类别，其中绝大多数为能量产生和代谢以及抗性相关的蛋白质。 在水稻灌浆期顶端茎段表达的蛋白质中，与能量和物质代谢相关的蛋白质例如ATPase、磷酸丙糖异构酶，6－磷酸葡萄糖异构酶等占有很高比例，说明茎段组织中具有很强的代谢活动。与生长发育相关的蛋白质包括beta-tubulins、无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase）、液泡质子ATP酶（vacuolar proton-ATPase）以及UDP葡萄糖焦磷酸酶等的大量累积，显示出顶端茎段细胞分裂和生长迅速;同时，贮存多糖和结构多糖也在旺盛合成。G蛋白、GDP释放抑制因子等信号传导蛋白以及苯丙氨酸氨解酶、谷胱苷肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）、抗坏血酸过氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗性相关蛋白质在该时期丰度表达，表明在灌浆期水稻顶端茎段能够迅速感受并传递外界信号，从而使得其在遭受胁迫时能够立刻启动抗逆防御系统，最大限度地降低不利环境对种子发育的影响。 在黑暗中萌发和生长的水稻黄化幼苗随着光照时间（0~24小时）的延长，能通过双向电泳后检测到的蛋白质逐渐变少，24小时后趋于稳定，相当于正常光照条件下生长的水稻幼苗蛋白质组表达谱。进一步分析表明，在黄化苗中，分解代谢及能量产生相关的蛋白如丙糖磷酸异构酶、琥珀酰辅酶A连接酶、异戊酰辅酶A脱氢酶与ATPase等的表达量比较丰富;另外，还可能启动了脂肪酸的α氧化分解途径，以供黑暗中生长所需的物质和能量。当黄化幼苗光照后，与光合作用及物质合成相关的一些蛋白质表达量增加，而那些分解代谢相关酶类则有所下降。同时，鸟核苷酸结合蛋白β亚基类似蛋白、20S proteasome以及Bowman Birk trypsin inhibitor等信号传递及抗性相关蛋白随着光照时间的延长而减少，说明黑暗胁迫条件下水稻幼苗启动了相关的抗逆途径。叶绿素合成途径中的蛋白酶胆色素原脱氨基酶和金属鳌合酶在脱黄化过程中表达量有所下降，可能是因为叶绿素合成产物具有反馈抑制作用。 本研究首次利用蛋白质组学方法来解析水稻灌浆期茎蛋白质组表达模式和水稻黄化幼苗响应光因子的蛋白质组变化情况，鉴定了一些有价值的蛋白质，并得到了它们的表达特点和相关数据，为更好地理解水稻顶端茎秆的生长特点和功效、水稻应答黑暗胁迫和光形态建成以及光合作用机理等提供了分子证据。

Comparative study of three short-chain neurotoxins from the venom of Naja kaouthia (Yunnan, China)

Three short-chain neurotoxins named NT-I, NT-II, and NT-III were purified from the venom of Naja kaouthia, a snake distributed throughout the south of Yunnan province, China, by a series of chromatographic steps, including an FPLC Resource S column. Their molecular weights, determined by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) MS, were 6952.19 Da, 6854.92 Da, and 6828.80 Da, respectively. NT-I consisted of 62 amino acid residues, and the other two consisted of 61 amino acid residues, including 8 cysteines. After hydrolysis by endoproteinase Glu-C, their primary sequences were determined. A test of their activities demonstrated that they effectively inhibited muscle contractions induced by electric stimulation. Furthermore, the extent of inhibition caused by NT-II and NT-III was less than that of NT-I. The IC(50)s were 0.04 mug/ml, 0.20 mug/ml, and 0.23 mug/ml for NT-I, NT-II, and NT-III, respectively. Compared with NT-II and NT-III, the higher activity of NT-I may be a result of the amino acid residue substitution Ile36 to Arg36.

A novel disintegrin, jerdonatin, inhibits platelet aggregation and sperm-egg binding

A novel disintegrin, jerdonatin, was purified to homogeneity from Trimeresurus jerdonii venom by gel filtration and reversed-phase high-pressure liquid chromatography. We isolated the cDNA encoding jerdonatin from the snake venom gland. Jerdonatin cDNA precursor,;encoded pre-peptide, metalloprotease and disintegrin domain. Jerdonatin is composed of 72 amino acid residues including 12 cysteines and the tripeptide sequence Arg-Gly-Asp (RGD), a well-known characteristic of the disintegrin family. Molecular mass of jerdonatin was determined to be 8011 Da by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Jerdonatin inhibited ADP- and collagen-induced human platelet aggregation with IC50 of 123 and 135 nM, respectively. We also investigated the effect of jerdonatin on the binding of B6D2F1 hybrid mice spermatozoa to mice zona-free eggs and their subsequent fusion. Jerdonatin significantly inhibited sperm-egg binding in a concentration-dependent manner, but had no effect on the fusion of sperm-egg. These results indicate that integrins on the egg play a role in mammalian fertilization. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

鱼腥藻PCC7120受缺铁诱导的外膜蛋白

利用双相法结合蔗糖密度梯度超离心制备获得高纯度的鱼腥藻PCC7120(Anabaena sp.PCC7120)外膜,以双向凝胶电泳分析受缺铁诱导的外膜蛋白。发现缺铁导致5种外膜蛋白水平显著上调,经MALDI-TOF-MS鉴定都是类似siderophore受体的蛋白。通过细菌荧光素酶报告基因luxAB研究相应基因的转录调控,发现它们在转录水平受缺铁诱导,并且响应缺铁诱导的表达模式存在差异。利用luxAB检测其中一些启动子的表达有可能用于水体中可利用铁离子的生物监测。

Outer membrane proteins induced by iron deficiency in Anabaena sp PCC 7120

Iron deficiency can induce cyanobacteria to synthesize siderophore receptor proteins on the outer membrane to enhance the uptake of iron. In this study, an outer membrane of high purity was prepared from Anabaena sp. PCC 7120 based on aqueous polymer two-phase partitioning and discontinuous sucrose density ultra-centrifugation, and the induction of outer membrane proteins by iron deficiency was investigated using 2-D gel electrophoresis. At least. five outer membrane proteins were newly synthesized or significantly up-regulated in cells transferred to iron-deficient conditions, which were all identified to be siderophore receptor proteins according to MALDI-TOF-MS analyses. Bacterial luciferase reporter genes luxAB were employed to monitor the transcription of the encoding genes. The genes were induced by iron deficiency at the transcriptional level in different responsive modes. Luciferase activity expressed from an iron-regulated promoter may be used as a bioreporter for utilizable iron in natural water samples. (C) 2009 National Natural Science Foundation of China and Chinese Academy of Sciences. Published by Elsevier Limited and Science in China Press. All rights reserved.

Purification and characterization of hydrosoluble components from the sap of Chinese lacquer tree Rhus vernicifera

Continuous gradient elution chromatography (CGEC) was employed to purify and separate enzymes and polysaccharides from the sap of Rhus vernicifera Chinese lacquer tree. There are three different molecules with laccase enzyme activity. Two are enzymes of each other (L1, and L2), whereas the third (RL) is an entirely separate entity. Two polysaccharides (GP1 and GP2) were also found. The Rhus laccase (RL), and isoenzymes L1 and L2, have peak molecular masses of 109,100, 120,000, 103,000 respectively; each has four copper atoms per molecule, and the pI values were 8.2, 8.6, and 9.1, respectively. The structure of the laccases was studied by Fourier-transform infrared (FT-IR) and Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The typical amide I (1646 cm(-1)) and amide II (1545 cm(-1)) bands were observed. The results from MALDI-TOF were similar to those from CGEC, but the molecular mass from the MALDI-TOF was significantly different from that obtained from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

二萜类生物碱和环糊精复合物的“软电离”质谱研究

随着基质辅助激光解吸／离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)技术的发展，“软电离”质谱在一些新领域正在发挥着越来越大的作用。本论文运用这些新技术对二萜类生物碱、环糊精与氨基酸复合物和环糊精与肽复合物进行了系统地研究。具体研究结果如下：一、附子中二萜类生物碱的质谱研究使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS)研究了附子提取物中C-19二萜类生物碱。实验结果表明：MALDI适合同时检测粗提物中多种生物碱，并且在分析速度和灵敏度方面明显优于其它方法。在附子甲醇提取物中检测到三类14种已知生物碱（单双酯型生物碱、阿替生型生物碱和脂类生物碱）和三种未知生物碱。同时还进行了生物碱萃取方法优化实验研究，并探讨了复方煎煮过程中成分-成分之间的相互作用。研究发现：生物碱的极性、碱性和毒性与生物碱C-8取代基相关，而且该基团在电离过程中容易形成中性碎片；在煎煮过程中甘草促进附子中剧毒的双酯型生物碱水解为低毒性的单酯型生物碱，从而证实了复方解毒机理。把电喷雾质谱(ESI-MS)和多级串联质谱（MS~n，n = 2-10）结合用以分析附子中脂类生物碱的成分。ESI-MS能够依据分子量的不同实现脂类生物碱的有效分离，并且Ms~n可以提供有关分子结构的信息。这样，就在附子乙醚提取物中确认出了12种已知脂类生物碱，并发现四种新的脂类生物碱。二、环糊精／氨基酸和环糊精／肽两种复合物的气相行为在10mM醋酸铵缓冲的环糊精(CD)／氨基酸(AAs)溶液的ESI-MS谱中，分别观察到α、β-CD与9种氨基酸复合物的正负离子；结合碰撞诱导解离(CID)技术确定了气相复合物的价键性质和结构。溶液中CD和AAs之间的疏才斜目互作用由于ESI过程中溶剂化作用的减弱而减弱，甚至完全消失，而分子之间的静电作用和氢键可能因此被加强。去质子化复合物的CID实验显示：当CD复合物从溶液相转入气相时，分子之间的主要作用力发生变化，静电相互作用成为主要作用力。研究还发现：β-CD／芳香氨基酸复合物的稳定性与氨基酸侧链和cD空腔之间的尺寸适合有关。因为CD／芳香氨基酸复合物与CD／其它氨基酸复合物的解离途径是不同的。由于芳香侧链被包结在CD空腔内，当CD／芳香氨 基酸复合物解离时，CD发生“爆裂”。为了进一步解释气相中CD和氨基酸的复合形式，引入氨基酸侧链极性表面积以评价氨基酸侧链对复合物稳定性的贡献。结果显示：氨基酸侧链羟基对复合物稳定性没有明显影响，这更加证明了在气-液两相中CD／芳香氨基酸复合物的结构是一致的。用ESI-MS和MS~n对α、β-CD与谷胱甘肽(GSH)及其修饰物进行研究，实验结果表明：两种环糊精均能催化GSH氧化反应。1:1和1:2CD/GSH复合物的CID揭示了分子之间具有较强的氢键作用。与GSH二聚体相比，1:2复合物作为催化氧化反应的中间体能够提供双分子GSH氧化反应的空间条件。此外，在1:1CD/GSH复合物的CID谱中观察到了GSH的氧化产物，说明在cID的离子富集和活化过程中会发生复合物离子-复合物离子之间的相互作用。这一结果不仅解释了CD催化反应的机理，同时揭示了气相复合物的化学性质。

高性能树脂环状预聚体和含官能团芳香环状低聚物的合成与表征

芳香环状低聚物的合成是应现代航天、航空、电子、机械等高技术领域对先进复合材料的需求而在八十年代末期发展起来的研究领域，其特有的结构和性能决定了芳香环状低聚物的广泛应用前景。芳香环状低聚物不仅在开环聚合制备先进树脂基复合材料方面具有重要的应用价值，而且在其侧链上引入各种官能团，开展其在功能材料方面的研究也具有十分重要的意义。本文以开拓这类新型芳香大环化合物的应用为目的，“假高稀”条件下，合成了22种新型结构的芳香大环化合物，并对它们进行了精确的结构表征。本文从开环聚合制备高性能树脂的思想出发，以6氟双酚A为单体合成了一系列的含氟聚芳醚环状预聚体，环状低聚物的产率达到74%，并在1 wt%的联苯二酚钾的引发下，进行快速地熔融开环聚合，得到了重均分子量约为6万，分子量分布约为2.6的线性含氟聚芳醚；本文设计了酮亚胺路线合成得到了聚醚醚酮(PEEK)环状预聚体。开创了由AA，BB型单体一步法合成PEEK环状中间体的新方法，这种合成方法具有反应时间短，所得环状低聚物的环尺寸较小，环张力较大，易于进行开环聚合的特点。PEEK环状预聚体成功地进行了阴离子开环聚合得到高分子量的线性聚合物，这一新方法的开拓将把PEEK在先进复合材料领域的实际应用向前推进一步。建立了一套先进的分析芳香环状低聚物的方法，结合质谱、核磁、GPC、单晶X．射线衍射和DSC等手段表征了各种环状低聚物并揭示了环状低聚物的组成。本文着重研究了激光质谱(MALDI-TOF MS)和电喷雾质谱(ESI MS)在芳香环状低聚物分析中的应用，特别在基质的选择上，经对比研究表明1,8,9-葸三酚是分析芳香环状低聚物的最为有效的基质，并已广泛地应用在我们的研究工作中，同时还发现了一种适用于芳香环状聚酯分析的新型基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸。用软硬酸碱理论解释了芳香环状低聚物与不同阳离子的亲合选择性。本文首次运用电喷雾质谱来分析芳香环状低聚物，证明电喷雾质谱与激光质谱有明显的互补性，是继激光质谱之后新发现的表征芳香大环化合物的有效手段，特别适用于含极性基团的芳香大环化合物的表征，进一步完善了芳香大环化合物的表征体系。自从美国G.E.公司利用环状聚碳酸酯的开环聚合制备线性聚碳酸酯以来，大多数芳香环状低聚物的开环聚合是经阴离子途径进行的，聚合后部分引发剂的端基残存于聚合产物中，常用的阴离子引发剂含有无机盐和酚氧碱金属离子，这些基团的存在将对聚合物的加工和性能带来一定的影响，因而探索其它的开环聚合途径具有重要意义。本文在“假高稀”条件下，高选择性地合成CSA、CSK和CSS三种含硫醚键的芳香环状低聚物，通过四圆衍射首次对含硫醚键芳香环状二聚体的晶体结构进行了研究，结果表明这些含硫醚键的芳香环状低聚物为缺乏环张力的大环。自由基聚合反应是重要的聚合方法之一，本文通过CSA和CSK环状低聚物的开环聚合深入、细致地研究了通过硫醚交换反应进行的自由基开环聚合，并利用顺磁共振波谱证实了其自由基开环聚合的性质。本文合成了一系列含溴、硝基、羧基及磺酸钠基团的芳香环状低聚物，以期开拓非开环聚合用的芳香大环化合物的研究领域。另外在芳香环状聚醚的合成新方法上做出了创新性的工作，首次通过界面缩聚方法高产率地合成了含硝基的芳香环状聚醚砜，并对芳香大环化合物的化学反应，修饰改性及功能化研究进行了探索。

芳香环状聚膦酸酯齐聚物的合成以及开环聚合

芳香环状低聚物的合成是二十世纪八十年代末发展起来的，其特有的环状结构和性能决定了芳香环状低聚物具有广阔的应用前景。本文以开拓这类新型芳香大环化合物的种类及其应用为目的，“拟高稀”条件下，界面缩聚法首次合成了多种不同链结构的环状聚膦酸酯芳香齐聚物，并对它们结构进行了精确的表征。对其开环聚合反应得到的聚合产物用GPC进行了分析。成环缩聚反应是以苯基膦酰二氯为单体与不同结构的双酚合成一系列的芳香环状聚膦酸酯齐聚物，探讨了其成环反应条件，研究了影响环化反应的因素，比较了不同环化反应温度以及相转移催化剂条件下得到的芳香环状聚膦酸酯齐聚物的产率，找到了合成这类大环齐聚物的适宜反应条件为：反应温度为0 ℃以及有效的相转移催化剂十六-烷基-三甲基溴化铵，依此得到了环状低聚物的产率达80%以上的优异结果。比较不同结构的双酚与苯基膦酰二氯反应合成的聚膦酸酯环状齐聚物的环化产率，发现了单体结构对芳香环状聚膦酸酯齐聚物的合成有一定的影响。研究了激光质谱（MALDI-TOF-MS）在表征芳香环状聚膦酸酯低聚物中的特点及规律。首先，在基质的选择上，经过比较不同基质所得到的结果表明：在芳香环状聚膦酸酯环状齐聚物分析中，1，8，9-蒽三酚仅对含有羰基基团结构的有效，同时，发现了一种适用于这类芳香环状聚膦酸酯分析的新型基质-视黄酸，这种基质对所合成的几种芳香环状聚膦酸酯齐聚物具有普适性，这与视黄酸基质的极性有关。其次，在阳离子添加剂的选择上，比较了不同阳离子剂对激光质谱图的影响，发现了一种适用于分析芳香环状聚膦酸酯齐聚物的阳离子剂氯化锂。用软硬酸碱理论结合气相金属离子形成机理解释了芳香环状聚膦酸酯环状低聚物与阳离子的亲核选择性。合成的不同结构的芳香环状聚膦酸酯齐聚物进行了阴离子开环聚合，含有硫醚键特殊结构的环状齐聚物进行了自由基开环聚合。双酚A芳香环状聚膦酸酯齐聚物（CPBA）在4，4'-联苯双酚钾引发，280 ℃条件下成功地进行了阴离子开环聚合，获得了线性聚膦酸酯产物（Mw = 4.7 * 10~3, Mn = 1.3 * 10~3, Mw/Mn = 3.72）。硫醚双酚芳香环状聚膦酸酯齐聚物（CPE）在270 ℃，引发剂2,2'-过硫双苯并噻唑（DTB）引发下，得到了Mw = 7.8 * 10~3, Mn = 1.7 * 10~3以及Mw/Mn = 4.51的线性聚膦酸酯聚合物。芳香环状聚膦酸酯开环过程类似与其它芳香环状预聚体的开环过程，CPBA环状齐聚物与芳香环状聚膦酸酯可以进行开环聚合，得到无规共聚物。共聚物的平均分子量高于相应的均聚物，热稳定性好于相应的均聚物。芳香环状聚膦酸脂齐聚物有望作为芳香环状预聚体的开环聚合中的添加剂。

由二酐的异构体合成的聚酰亚胺

聚酰亚胺是一类综合性能优异的重要耐热高分子材料，它在航空，航天工业，微电子工业等诸多领域获得了广泛的应用。异构的聚酰亚胺是近几年新兴起的结构材料之一，与传统结构的聚酰亚胺比较，具有更高的玻璃化温度，良好的溶解性能，低的熔融粘度，宽的加工窗口，和相当的机械性能和热稳定性，是一种较有发展前景的结构材料；同时异构的二酐单体又可以用来合成芳香环状聚酰亚胺，对这些十分稳定又具有很好溶解性能的环状齐聚体的研究还刚刚开始。为此，本论文主要就以下方面开展研究工作：1，以环己烯为原料，经六步，高收率地合成了PMDA的异构体，MPDA。发现MPDA在室温下同甲醇和苯胺的开环选择反应分别得到了不对称的酷化产物和对称的酞化产物，这种开环选择的差别可归结于在酞化反应过程中形成了环状氢键中间体。通过MPDA和苯胺的亚胺化反应研究，发现在DMAc中热环化得到单亚胺化合物和双亚胺化合物的混合物，而在对氯酚中热环化或者在DMAc中化学环化均只得到唯一双亚胺化合物。单晶X-Ray衍射证实了单亚胺化合物的结构。发现在DMAc中热环化时单亚胺化合物和双亚胺化合物可以相互转化，而在氮气或者真空高温条件下单亚胺化合物不能转化成双亚胺化合物，从而提出了反应机制，即少量DMAc中的水分可以影响生成单亚胺化合物。发现MPDA和ODA或者MDA聚合时有很大的生成环状聚酰亚胺的倾向，它们的环状性质由IR，MALDI-TOF-MS，和NMR所证实。发现环状聚酰胺酸放置时，不同的环之间可以发生转换，从而可以提高受热力学控制的环的收率。用溶剂萃取和重结晶的方法分离得到了环状聚酰亚胺二聚体，用单晶X-Ray衍射的方法表征了二聚体包容不同溶剂时的分子结构，从分子水平的角度研究了环状聚酞亚胺的结构和性能的关系。除了MPDA得到的聚酞亚胺有较高的g值外，异构体聚酰亚胺的其它性能如力学性能、热稳定性能、溶解度性能、形态结构性能等差别不大。2．以2，3-二甲基苯胺为原料，经四步，高收率地得到了3,3'-BTDA。发现螺双内酚在乙酸配中回流可以直接有效地转化成二配3,3'-BTDA，并提出了转化机制。单晶X-Ray衍射表明3,3'-BTDA和3,4'-BTDA都有非共平面的分子结构。通过研究异构的BTDA得到的聚酞亚胺，发现并表征了3,3'-BTDA和ODA聚合时有很大的生成环状聚酞亚胺的倾向。异构化BTDA得到的聚酞亚胺的Tg值规律：3,3'-BTDA＞3,4'-BTDA＞4,4'-BTDA；溶解性能规律：3,3'-BTDA＞3,4'-BTDA＞4,4'-BTDAA；融体粘度规律：3,3'-BTDA＞4,4'-BTDAA3,4'-BTDA；热机械性能规律：4,4'-BTDA澎3,4'-BTDA＞3,3'-BTDA。可以看出3,4'-BTDAA得到的聚酰亚胺既有良好的加工性能，又能保持材料的热机械性能。由DSC测得的异构模型化合物的Tm，△Hm，和△Sm数据可以有效地解释异构聚酰亚胺的Tg规律。3．合成了cis-1,2,3,4-CHDA，发现在一定条件下可以转化成它的异构体trans-1,2,3,4-CHDA，1HNMR直接跟踪热异构化反应的进程，并提出了转化机制。单晶X-Ray衍射确定了两个二配异构体的绝对构型。发现在用trans-1,2,3,4-CHDA制备聚酞亚胺时无论用两步法或者一步法，均能很容易地得到高分子量的聚合物。而它的异构体cig-1,2,3,4-CHDA在制备聚酞亚胺时，由于形成环状聚酞亚胺，用传统的方法得不到高分子量的聚合物，增加单体的浓度可以有效制得高分子量的聚合物。发现顺式聚合物的溶解性能比反式异构体的好，Tg值比相应反式异构体的高，其它如热氧化稳定性，机械性能，光学性能，异构体间没有明显的差别。但是，两个异构体都可以制得坚韧的透明薄膜。

Friedel-crafts反应合成芳香环状齐聚物与开环聚合

芳香环状低聚物的合成是二十世纪八十年代末发展起来的研究领域，其特有的环状结构和可进行可控的开环聚合决定了芳香环状低聚物具有广阔的应用前景。本文从研究单体结构与成环反应的关系出发，开拓了一种合成芳香环状聚醚酮的新方法—改进的Friedel-Crafte反应法，采用该方法成功地合成了一系列新型结构的大环化合物，并首次利用流变仪对开环聚合过程中的流变行为进行了较为系统的观测。根据acoson-Stockmayer环化理论，应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MAIDL-TOF MS），对一系列芳香环状低聚物组分分布进行分析，研究了芳香环状低聚物的产率、组分分布与单体结构的关系。结果表明：芳香聚醋、聚麟酸醋及芳香聚醚环状低聚物系列中，InCn与1nn呈良好的线性关系，符合J-S理论分布。环状齐聚物的产率与组分分布受单体的中心键角影响，单体的中心键角在100°～120°范围内，其中心键角愈小，γ值愈大。γ值愈大，反应产物中小环化合物的含量越高，而小环化合物的含量的增加是高产率地合成环状齐聚物的前提之一。在此理论的指导下，通过对单体结构的模拟，高选择性地合成了一种新型结构的芳香环状聚硫醋二聚体，对其结构进行了精确的表征，在不同溶剂中得到了该环状二聚体的单晶，单晶X闪ray衍射表明该二聚体为环张力极小的大环化合物。基于上述理论，以有利于成环的邻苯二酞氯为酞基化试剂，对Friedel-Crafts酞基化反应在合成芳香环状齐聚物中的应用进行了系统研究，开拓了一种合成芳香环状预聚体的新方法—改进的Friedel-Crafts酞基化反应法。发现反应体系中Lewis碱的存在有利于选择性地形成环状产物。并进一步确定反应最佳条件为： Lewis碱和催化剂Alcl3与富电单体的摩尔比分别为1.2和3.4; 1,2-二氯乙烷为本反应的最佳溶剂；等当量的反应单体要求缓慢滴加到形成“假高稀”的溶剂体系中；Lewis碱NMP，DMF等都适用于本反应体系。在此优化条件下，以邻苯二酞氯和间苯二酞氯为酞基化试剂，室温下，合成了一系列芳香环状聚醚酮酮、聚醚酮、聚醚矾酮等新型结构的环状齐聚物，利用MALDI-TOF-MS，NMR，GPC，FTIR，DSC，元素分析等手段对环状结构进行了精确的表征；DSC分析表明含邻苯二拨基结构的环状齐聚物为无定型材料；部分产物的产率高达90％。在阴离子引发剂联苯双酚钾存在下，制备的环状齐聚物成功进行了熔融开环聚合，得到了相应结构的高分子量的线性开环聚合产物。其中，含邻苯二拨基结构的环状聚醚酮酮、环状聚醚酮矾的开环聚合产物的比浓粘度分别达到0.42dL／g，0.36 dL／g（0.5％的DMF溶液，25士0.1℃）；四种含间苯二锁基结构的环状齐聚物的开环聚合产物的Tg与常规亲电沉淀反应合成的线性高聚物的Tg相同。含侧甲基的开环聚合产物的Tg比对应的开环聚合的产物的Tg高约5℃。研究结果表明用亲电缩聚方法制备芳香环状聚醚酮与亲核缩聚法相比较，具有成本低廉、反应条件温和丫产率高、易于大规模制备等优势，开拓了一种制备环状化合物的方法。自从美国G.E.公司利用环状聚碳酸酷的开环聚合制备线性聚碳酸醋以来，对芳香环状低聚物的开环聚合过程的研究仅局限在由GPC监测反应某一时刻的产物的分子量，而缺乏对与应用更为接近的开环聚合中的粘度的变化的研究。本文以界面缩聚反应高产率地合成芳香环状双酚A聚酷二聚体为对象，研究了流变仪在开环聚合中的应用。利用流变仪对环状二聚体开环聚合过程进行了较为系统的观测，研究了不同条件下的开环聚合中的流变行为，结果表明，开环聚合存在引发期，而且在引发期，熔融体的粘度低于10Pa·S，超过引发期，粘度呈指数级增长。引发期的长短可以通过引发剂的种类、浓度、开环聚合的温度等条件进行有效地控制。芳香环状聚酷二聚体与环状聚碳酸醋的开环共聚合的流变行为的研究结果表明：开环共聚合可以降低开环聚合的温度，调整引发期，是提高聚合产物的分子量的有效途径。用流变仪对以改进的Friedel-Crafts反应合成的芳香环酮齐聚物的开环聚合中的流变行为进行了监控。在330℃，剪切速率为0.05S-l下，熔融的环状齐聚物的粘度为2.0Pa·S。通过对开环聚合的反应条件的控制，同样实现了开环聚合的可控，通过改变其开环聚合的引发期的长短及粘度的变化规律，可、适应不。条一定为加工设计与成型加工提供理论指导和模型设计，必将进一步推进开环聚合工 艺向应用方向的发展。

新型超支化聚合物的合成和表征

超支化聚合物是一类高度支化的具有三维椭球状立体构造的大分子。由于具有传统线形聚合物所没有的低粘度、高流变、良好的溶解性及大量末端官能团等物理化学特性，近年来已成为高分子科学界研究的一个热点。十多年来，人们在合成方法、表征手段、应用及理论研究等方面取得了可喜的成就。但是，目前超支化聚合物的发展还存在着合成方法和所合成的聚合物种类有限，成本较高及结构可控性差等问题。设计合成了五个系列的新型ABx单体，二经基苯氯代苯酞亚胺、二乙酞氧基苯甲酸苯酞亚胺、三乙酞氧基苯酞胺酸，二经基苯基联苯酰胺酸和多轻基烷基联苯酞胺酸，再分别通过缩聚反应一步成功制备了新型芳香超支化聚醚酞亚胺、芳香超支化聚酷酰亚胺，可降解的超支化聚酷酞胺、芳香和半芳香超支化聚酯酞胺。通过傅立叶红外光谱（FT）、核磁共振波谱（NMR）凝胶渗透色谱（GPC）、热差（DSC）和热重（TGA）等分析手段，详细研究了它们的结构和性质，这些聚合物都具有较低的粘度、良好的溶解性和热稳定性。末端基团的种类和性质在很大程度上影响聚合物的性质。通过小角X一射线散射仪和紫外一可见光谱研究了由天然原料制备的超支化聚酷酞胺的降解行为。设计了由商品化原料，二梭酸酐（AAA，型）与二乙醇胺归32型）、脂肪二梭酸配与多经基伯胺（CBx型）和二酸（Az型）与多轻基伯胺一步合成超支化聚合物的新方法，成功地合成了二十四种不同结构的新型超支化聚酷酰胺。通过FTIR、NMR和DEPT NMR、GPC、基质辅助激光解析时间飞行质谱（MALDI-TOF-MS）、DSC和TGA等分析手段，详细研究了它们的结构和性质。这些聚合物都具有较低的粘度、良好的溶解性。

菜花烙铁头蛇毒去整合素的纯化、克隆及活性研究

蛇毒去整合素蛋白（disintegrin）家族一般具有分子量低、富含半胧氨酸和含有RGD三肽等结构特点，因其能与配基竞争结合细胞表面的整合素受体，干扰整合素的正常功能而呈现出多方面的生物学活性，如抑制血小板聚集、抑制肿瘤转移和诱导细胞凋亡等。本论文用凝胶过滤、反向高压液相等层析技术从我国云南产菜花烙铁头（Trimeresurusjerdonii）蛇毒中分离纯化到两个新的去整合素蛋白，分别命名为jerdonin和Jerdonatin。MALDI-TOF-MS测定jerdonin分子量为7483Da，jerdonatin分子量为80llDa，二者均属第二类去整合素。分别测定了其N末端25个氨基酸序列，发现与其它蛇毒来源的去整合素具有很高的相似性。提取菜花烙铁头毒腺总mRNA，通过反转录PCR（RT-PCR）扩增到两个去整合素cDNA序列，分别命名为TJDIS-1和TJDIS-2。TJDIS-1全长1528bp，TJDIS-2全长16O3bp，二者均包含编码信号肚区、前肤区、金属蛋白酶区、间隔肤区和去整合素区一属于P一H型金属蛋白酶家族。经推导的氨基酸序列和MALDI一TOF一MS分析，可确定TJDIS-1去整合素区编码jerdonin，TJDIS-2去整合素区编码jerdonotin。jerdonin全长71个氨基酸，jerdonatin全长72个氨基酸，二者均含12个半眺氨酸，且在C末端附近均含有去整合素家族的典型特征三肤序列一RGD。氨基酸序列比较分析显示，jerdon加与来源于侏响尾蛇（Sistrurusm.tergeminus）的去整合素tergeminin序列相似性最高，为82.2％。而jertionatin与来源于黄绿烙铁头（Trimeresurusflavoviridis）的去整合素CTF-I序列相似性最高，为97.2％，仅在RGD附近有两个氨基酸不同。jerdonin与jerdonatin序列相似性为67.6％。本论文还研究了jedonin和jerdonatin的生物学活性。二者均能强烈抑制ADP、胶原、凝血酶诱导的人血小板的聚集，IC50为100-300nM。jerdonin和jerdonatin还能够抑制B16肿瘤细胞增生，研究表明，jerdonin不仅能显著抑制肿块的生长，还能延长荷瘤小鼠的寿命。平均肿块体积由对照的5260．33枷，降低至2086.65mm3，小鼠平均寿命由对照的24.8天延长至30.5天，提高了22.98％。本论文也研究了jerdonin和jedonatin对小鼠精卵受精过程的影响，结果表明jordonotin能够呈剂量关系抑制精卵结合，但对精卵融合无影响。当jerdonatin用量为10.0μg／毗时，单个卵子的精子结合数由对照的95.31降为21.83。菜花烙铁头蛇毒去整合素蛋白的结构和活性鉴定，为去整合素家族的生物多样性研究提供了丰富的素材，同时也为血栓、肿瘤、生殖等生理或病理过程的研究提供了一个有力的工具。

Immobilized metal-ion chelating capillary microreactor for peptide mapping analysis of proteins by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry

Peptide mass mapping analysis, utilizing a regenerable enzyme microreactor with metal-ion chelated adsorption of enzyme, combined with matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was developed. Different procedures from the conventional approaches were adopted to immobilize the chelator onto the silica supports, that is, the metal chelating agent of iminodiacetic acid (IDA) was reacted with glycidoxypropyltrimethoxysilane (GLYMO) before its immobilization onto the inner wall of the fused-silica capillary pretreated with NH4HF2. The metal ion of copper and subsequently enzyme was specifically adsorbed onto the surface to form the immobilized enzyme capillary microreactor, which was combined with MALDI-TOF-MS to apply for the mass mapping analysis of nL amounts of protein samples. The results revealed that the peptide mapping could routinely be generated from 0.5 pmol protein sample in 15 min at 50degreesC, even 20 fmol cytochrome c could be well digested and detected.