Caracterização bioquímica de metaloproteinases de parasitas tripanosomatídeos

A identificação e caracterização de processos mediados por metaloproteinases de uma grande variedade de eucariotas está a avançar rapidamente, tanto a nível molecular como celular – e os muitos papéis que as proteases desempenham nestes organismos estão a ser trazidas para o foco. As metaloproteinases de matriz executam tarefas de ―housekeeping” comuns a muitos organismos, bem como funcionam a um nível muito mais específico no ciclo de vida dos parasitas, por exemplo. Papéis pivotais foram propostos em diferentes processos, como invasão e egressão de células, enquistação e desenquistação, catabolismo de proteínas, diferenciação, progressão do ciclo celular, citoaderência, e ainda estimulação e evasão ao sistema imune. No presente estudo, é feito o reconhecimento e a caracterização de metaloproteinases de dois diferentes extractos de parasitas protozoários: Trypanosoma brucei brucei e Leishmania infantum. A classificação de metaloproteases foi obtida a partir da inibição diferencial da actividade destas proteases sobre diferentes substratos (gelatina e caseína), tendo sido efectuada uma prospecção de inibidores selectivos com potencial para serem empregues em novas estratégias de quimioterâpeutica contra estes agentes. Adicionalmente, é feito um estudo bioinformático sobre uma metaloproteinase comum aos parasitas aqui abordados, alargando o estudo a outros organismos relacionados. Os resultados obtidos demonstram a presença de metaloproteinases capazes de degradar proteínas de matriz em ambos os extractos estudados, sendo possível inibir a sua actividade com concentrações relativamente moderadas de inibidores. Além disso, sugerem que em todos os eventos patológicos abordados neste estudo, a presença de metaloproteinases activas é estável no seu ciclo de vida e provavelmente na progressão da patologia provocada pelos diferentes agentes em estudo. A análise de todos os resultados e observações poderá possivelmente levar à identificação e integração de elementos comuns nos processos de invasão celular e progressão parasitária aqui abordados. Por essa razão, a compreensão destas interacções permanece um desafio importante.

Comportamento biológico "in vitro" de "novas espécies" de Leishmania no Velho Mundo

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas pelo parasita protozoário Leishmania sp. Na Bacia mediterrânica, Leishmania infantum, é a principal espécie causadora de leishmaniose visceral, a forma mais severa da doença, sendo L. major um dos agentes etiológicos da leishmaniose cutânea. Apesar de se considerar que estes parasitas têm uma reprodução essencialmente clonal, nos últimos 20 anos tem vindo a ser descrita a recombinação genética entre diferentes estirpes e espécies, com ocorrência de híbridos naturais, quer no Velho quer no Novo Mundo. Recentemente, em Portugal, foram isoladas e identificadas pela primeira vez, estirpes híbridas de L. infantum/L. major. O presente estudo teve como principais objetivos, a pesquisa de “novas espécies” de Leishmania e a análise do comportamento “in vitro” de estirpes parentais e híbridas de L. infantum e L. major. Numa primeira parte do trabalho efetuou-se a cultura e pesquisa de DNA de Leishmania sp., em amostras de sangue medular de 229 cães provenientes de uma região endémica de Portugal, utilizando diferentes marcadores moleculares (kDNA, ITS1 e SSU rRNA) e protocolos de PCR. Não foi encontrado DNA de espécies híbridas, tendo-se no entanto, identificado DNA de Leishmania sp. em 45,85% (105/229) das amostras, incluindo cães sem sinais clínicos. Na segunda parte do trabalho, realizaram-se diversos ensaios “in vitro” com estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major e parentais L. infantum e L. major. Em condições normais de crescimento, observou-se um padrão de crescimento distinto para cada estirpe estudada. Em condições de “stress” oxidativo, destacou-se uma diferença significativa entre as duas estirpes híbridas estudadas. Em condições de “stress” nutricional, as estirpes não apresentaram diferenças entre si. Após avaliação da suscetibilidade das estirpes na presença de Anfotericina B, todas se mostraram suscetíveis, com concentrações inibitórias (CI50) entre 0.21 e 1.15 μg/mL. Após infeção em linhas celulares monocíticas, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas na taxa e intensidade de infeção das estirpes híbridas em comparação às putativas parentais. Os resultados obtidos, contribuíram para um melhor conhecimento sobre o comportamento biológico destas estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major. Estas demonstraram um comportamento “in vitro” intermédio, relativamente às estirpes parentais. Estes resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de outros estudos com estas “novas espécies”, nomeadamente estudos de patogenicidade “in vivo” e o papel de biomarcadores de virulência, que permitam um potencial prognóstico da infeção e avaliação do seu risco epidemiológico.

Identificação de motivos relevantes para a função do fator de iniciação da tradução EIF4E3 de Leishmania sp

Os tripanossomatídeos são organismos caracterizados pelo controle póstranscricional da expressão gênica, principalmente em nível de tradução. Na tradução em eucariotos, tem grande destaque o complexo eIF4F, sendo um de seus principais componentes o fator de iniciação da tradução eIF4E. Já foram descritos em tripanossomatídeos seis homólogos para o eIF4E, nomeados EIF4E1 a 6. Em um estudo com Leishmania amazonensis, focado no EIF4E3, percebeu-se que seu perfil de expressão se alterava rapidamente numa curva de crescimento, com este apresentando ao menos duas bandas. As mudanças observadas sugeriam modificações pós-traducionais do tipo fosforilação, algo posteriormente confirmado. Analisando-se a sequência do EIF4E3 de Leishmania, foi possível identificar a presença de possíveis sítios de fosforilação e de ligação a parceiros funcionais como homólogos do eIF4G, outro componente do complexo eIF4F, e da proteína de ligação á cauda poli-A (PABP). No presente estudo foi analisado o perfil de expressão e a capacidade de ligação a parceiros funcionais do EIF4E3 de Leishmania superexpresso em células transfectadas e no qual foram introduzidas mutações em motivos específicos. Os resultados mostraram um perfil de expressão de ao menos três bandas para o EIF4E3 de L. amazonensis e duas para L. infantum, com o sítio S75, presente apenas na primeira, sendo o responsável por esta diferença. Em ensaios de imunoprecipitação, foi identificado um motivo que, quando mutado, aboliu a ligação do EIF4E3 com a PABP3, sugerindo este como o sítio de interação entre os fatores. Com a análise do efeito de mutações no EIF4E3 de L. amazonensis, foi percebido que ao se mutar três motivos implicados na à PABP e o possível sítio de ligação ao EIF4G, sua fosforilação diminuiu drasticamente, sugerindo a necessidade destas interações para que a fosforilação ocorra. Estes resultados indicam um complexo mecanismo de modificações pós-traducionais responsáveis pela regulação do EIF4E3 e contribuem a para a caracterização da sua função em Leishmania

Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Genetic and Functional Evidence Implicating DLL1 as the Gene That Influences Susceptibility to Visceral Leishmaniasis at Chromosome 6q27

Background. Visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania donovani and Leishmania infantum chagasi. Genome-wide linkage studies from Sudan and Brazil identified a putative susceptibility locus on chromosome 6q27. Methods. Twenty-two single-nucleotide polymorphisms (SNPs) at genes PHF10, C6orf70, DLL1, FAM120B, PSMB1, and TBP were genotyped in 193 VL cases from 85 Sudanese families, and 8 SNPs at genes PHF10, C6orf70, DLL1, PSMB1, and TBP were genotyped in 194 VL cases from 80 Brazilian families. Family-based association, haplotype, and linkage disequilibrium analyses were performed. Multispecies comparative sequence analysis was used to identify conserved noncoding sequences carrying putative regulatory elements. Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction measured expression of candidate genes in splenic aspirates from Indian patients with VL compared with that in the control spleen sample. Results. Positive associations were observed at PHF10, C6orf70, DLL1, PSMB1, and TBP in Sudan, but only at DLL1 in Brazil (combined P = 3 x 10(-4) at DLL1 across Sudan and Brazil). No functional coding region variants were observed in resequencing of 22 Sudanese VL cases. DLL1 expression was significantly (P = 2 x 10(-7)) reduced (mean fold change, 3.5 [SEM, 0.7]) in splenic aspirates from patients with VL, whereas other 6q27 genes showed higher levels (1.27 x 10(-6) < P < .01) than did the control spleen sample. A cluster of conserved noncoding sequences with putative regulatory variants was identified in the distal promoter of DLL1. Conclusions. DLL1, which encodes Delta-like 1, the ligand for Notch3, is strongly implicated as the chromosome 6q27 VL susceptibility gene.

Perfil de memória e ativação de linfócitos T na leishmaniose visceral

Visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is a disease caused by Leishmania infantum chagasi (L.i.chagasi). The clinical evolution post-infection depends on the vertebrate host immune response, which is genetically mediated. This study aimed to evaluate the immune response of individuals living in endemic area for VL in the state of the Rio Grande do Norte, considering individuals with VL under treatment (n = 9), recovered VL <1 year post treatment (n = 10), > 10 years posttreatment (n = 9), uninfected individuals living in endemic areas (n = 7), individuals that lost DTH response (n=6) and asymptomatic individuals for VL (n=9). Peripheral blood cells were evaluated in the presence and absence of soluble Leishmania antigens (SLA) and ex vivo, to determine activation, presence of regulatory cells and memory cells. The Leishmania parasitemia and anti-Leishmania antibodies were determined respectively by qPCR and ELISA. Cells from individuals with VL under treatment showed less cell activation after stimulation with SLA for the markers CD4/CD69, CD8/CD69 and CD8/CD25 compared with VL post treatment treatment (p <0.001). Apparently uninfected individuals have a higher cell activation than symptomatic VL (p <0.001), with the exception of CD8/CD25 marker (p = 0.6662). On the other hand, in the ex-vivo group, significant differences were observed for CD4/CD69, CD8/CD69 and CD8/CD25 between the 4 groups due to increased cell activation present in cells of individuals symptomatic LV (p <0.001). VL cells under treatment, ex vivo, have a lower percentage of memory cells (CD4/CD45RO and CD8/CD45RO) than individuals VL post-treatment or control group (p = <0.01). Likewise, individuals with symptomatic VL have fewer regulatory cells when stimulated by SLA [CD4/CD25 (p = 0.0022) and CD4/FOXP3 (p = 0.0016)] and in the ex-vivo group (p = 0.0017). Finally, DNA isolated from recovered VL contained Leishmania DNA, supporting the hypothesis of non-sterile clinical cure for Leishmania infection. Recovered VL, even 10 years after treatment have high levels of memory cells, which may be due to the presence of stimulation, either by reexposure to Leishmania or non-sterile cure

O papel modulatório do ferro sobre a resposta imune na Leishmaniose Visceral

Iron is an essential element for many cellular functions, including the immune response against intracellular pathogens. In this study, we aimed evaluate the effect of iron on IRP2, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10, MIG and IP10 expression in PBMC and assess the effect of the spleen parasite load on the expression of these genes in the spleen of L. infantum naturally infected dogs. Blood sample from 7 DTH+ donor was collected and PBMC was obtained. The cells were cultivated in absence (iron chelator desferroximane, DFO 10 μM supplemented media) or in presence of iron (hemin 6 mM) for 1 h, followed by stimulation with Leishmania infatum antigen for 4 h. 44 dog spleen samples were obtained and parasite load in this organ was determinate by qPCR. Gene expression was analyzed by qPCR and cytokine production quantified by flow cytometry. In antigen stimulated cells, genes involved in immune response are significantly more expressed in presence of iron. T CD4+ and TCD8+ lymphocytes produces IFN-γ, TNF-α and IL-10 possibly in iron dependent pathway. Monocytes antigen stimulated reduced TNF-α, IL-6 and IL-10 production in presence of iron. We found spleen of infected dogs IRP2 expression increases according to parasite load in that organ, while an inverse profile was found for IFN-γ, TNF-α e IL-10 expression. These results suggest that T lymphocytes depends on iron to produce IFN-γ, TNF-α and IL-10, while iron seems to inhibit cytokine production in monocytes. So, we propose an immunoregulatory mechanism carried out by iron during L. infantum infection in humans and dogs

Periurbanização da leishmaniose visceral e emergência da coinfecção HIV/leishimania, no Rio Grande do Norte

Visceral leishmaniasis (VL) has undergone changes in terms of clinical and epidemiological presentation worldwide. Urbanization has been described in different regions of Brazil and the world, as well as in the state of Rio Grande do Norte. These changes have impacted in the clinical outcome of Leishmania infection. A new clinical entity called co-infection of HIV/Leishmania has been described as a consequence of overlapping areas of occurrence of VL and HIV / AIDS in different countries including Brazil. The aim of this study was to define the process of periurbanization of the LV and describe a case series of co-infection HIV / Leishmania in Rio Grande do Norte. A new demographic pattern of VL was detected, with an increase in the number VL adult male subjects. Analysis of spatial distribution of VL in the state of Rio Grande do Norte showed that in the past 20 years VL tends to occur in larger cities and therefore the highest risk disease is greater in the eastern and western regions. The first region included Natal, the state capital, where the process of suburbanization began in 1990, and more recently the city of Mossoró, the second largest state, where periurbanization began in the last five years. In 1990, the emergence of co-infection HIV/Leishmania in the state was observed. Case-control study revealed that the new clinical entity affects adult males, who acquired HIV through sexual intercourse, 40% of those with a preivous history of leishmania infection Relapse and death from LV is increased in HIV positive compared with HIV-negative patients matched by sex and age. This pattern is similar to the observed in Europe, except of the route of transmission, where in Europe occured concomitantly, by parenteral route in drug users. Analysis of spatial distribution identified overlapping new areas of occurrence of HIV / AIDS and LV potentially signaling to increased risk of this new clinical entity as described above. Therefore, epidemiological surveillance for co-infection HIV / Leishmania should be adopted in all areas of risk of VL. At the same time, it is necessary to evaluate drug resistance currently used in the treatment of VL, as well as parenteral transmission of L infantum/ chagasi in areas where drug dependence is a risk factor for HIV acquisition

Molecular and serological detection of Leishmania spp. in captive wild animals from Ilha Solteira, SP, Brazil

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

VISCERAL LEISHMANIASIS IN A CAPTIVE CRAB-EATING FOX CERDOCYON THOUS

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Impact of leishmaniasis on public health

Leishmaniasis is a parasitic zoonosis caused by protozoans of the genus Leishmania transmitted by insects known as phlebotomines, which are found in wild or urban environments. It affects domestic and wild animals and transmission to man happens by accident. The disease occurs in tropical and sub-tropical areas, mainly in Asia, Europe, Africa, and the Americas. There are two forms that affect man: American cutaneous leishmaniasis (ACL) and American visceral leishmaniasis (AVL). The latter is caused by three species of Leishmania: Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (Leishmania) infantum, and Leishmania (Leishmania) chagasi, which are grouped in the Leishmania (Leishmania) donovani complex. Wild reservoir hosts of L. chagasi known so far are foxes and marsupials. In domestic environment, dogs are the most important reservoir hosts and sources of infection to the vectors Lutzomyia longipalpis. Leishmaniasis is difficult to control, causing epidemic outbreaks, thus being an important public health problem. Due to lesions caused by the mucocutaneous type and the severity of those caused by the visceral type in humans, visceral leishmaniasis is one of the main public health concerns. This paper is part of the monograph presented at the end of the residency program in the field of Zoonosis and Public Health at the School of Veterinary Sciences and Animal Husbandry, São Paulo State University, UNESP, Botucatu, São Paulo State, Brazil, in 2005.

Coinfection of Leishmania chagasi with Toxoplasma gondii, Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and Feline Leukemia Virus (FeLV) in cats from an endemic area of zoonotic visceral leishmaniasis

The aim of the present study was to determine the coinfection of Leishmania sp. with Toxoplasma gondii, Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and Feline Leukemia Virus (FeLV) in a population of cats from an endemic area for zoonotic visceral leishmaniasis. An overall 66/302 (21.85%) cats were found positive for Leishmania sp., with infection determined by direct parasitological examination in 30/302(9.93%), by serology in 46/302(15.23%) and by both in 10/302 (3.31%) cats. Real time PCR followed by amplicon sequencing successfully confirmed Leishmania infantum (syn Leishmania chagasi) infection. Out of the Leishmania infected cats, coinfection with FIV was observed in 12/66(18.18%), with T. gondii in 17/66 (25.75%) and with both agents in 5/66(7.58%) cats. FeLV was found only in a single adult cat with no Leishmania infection. A positive association was observed in coinfection of Leishmania and FIV (p < 0.0001), but not with T. gondii (p > 0.05). In conclusion, cats living in endemic areas of visceral leishmaniasis are significantly more likely to be coinfected with Fly, which may present confounding clinical signs and therefore cats in such areas should be always carefully screened for coinfections. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Evaluation of renal and hepatic functions in dogs naturally infected by visceral leishmaniasis submitted to treatment with meglumine antimoniate

The present study aimed to evaluate the renal and hepatic responses in eight dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment with meglumine antimoniate and to verify the occurrence of possible side effects. Urinalysis, hepatic and renal function tests were carried out in all animals at up to seven moments. After the end of a six-month observation period, all dogs were euthanized. Before the beginning of the experiment urinary and biochemical alterations were observed in four dogs due to the changes caused by the parasite itself. These alterations included the presence of renal cells, cylindruria, proteinuria, azotemia, hyperproteinemia, and hypoalbuminemia. One dog died on the third day after treatment because an aggravation of the clinical picture, probably due to the medication. During the course of the study, an increase in hepatic enzymes was verified in two animals. Sixty days after the beginning of the treatment four dogs showed remission of clinical signs. The other three were asymptomatic with persistent biochemical alterations. From these, two presented recurrence of clinical signs about 150 days after the beginning of the treatment while in the other, hyperproteinemia persisted. Meglumine antimoniate was not efficient to treat dogs with severe renal dysfunction and the side effects observed were pain at the site of injection and the probable transient hepatotoxicity, evidenced by biochemical examinations, but without the presence of clinical signs. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Comparison of parasitological, immunological and molecular methods for the diagnosis of leishmaniasis in dogs with different clinical signs

Aiming to improve the diagnosis of canine leishmaniasis (CanL) in an endemic area of the Northwest region of São Paulo State, Brazil, the efficacy of parasitological, immunological and molecular diagnostic methods were studied. Dogs with and without clinical sips of the disease and positive for Leishmania, by direct parasite identification on lymph node smears and/or specific antibody detection by ELISA, were selected for the study. According to the clinical signs, 89 dogs attending the Veterinary Hospital of UNESP in Aracatuba (SP, Brazil) were divided into three groups: symptomatic (36%), oligosymptomatic (22%) and asymptomatic (22%). Twenty-six dogs from an area non-endemic for CanL were used as negative controls (20%). Fine-needle aspiration biopsies (FNA) of popliteal lymph nodes were collected and Diff-Quick (R)-stained for optical microscopy. Direct immumofluorescence, immunocytochemistry and parasite DNA amplification by PCR were also performed. After euthanasia, fragments of popliteal lymph nodes, spleen, bone marrow and liver were collected and processed for HE and immunohistochemistry. Parasite detection by both HE and immunohistochemistry was specifically more effective in lymph nodes, when compared with the other organs. Immunolabeling provided higher sensitivity for parasite detection in the tissues. In the symptomatic group, assay sensitivity was 75.61% for direct parasite search on Diff-Quick (R)-stained FNAs, 92.68% for direct immunofluorescence, 92.68% for immunocytochemistry and 100% for PCR; the corresponding values in the other clinical groups were: 32, 60, 76 and 96% (oligosymptomatic), and 39.13, 73.91, 100 and 95.65% (asymptomatic). Results of the control animals from the CanL non-endemic area were all negative, indicating that the methods used were 100% specific. (C) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

Distinct mitochondrial HSP70 homologues conserved in various Leishmania species suggest novel biological functions

We report the identification of two distinct homologues of the 70-kDa mitochondrial heat shock protein (mtHSP70) from Leishmania chagasi/Leishmania infantum (Lc2.1 and Lc2.2). in Leishmania species, multiple genes encoding Lc2.2 are present whilst single genes encode Lc2.1. Strikingly, genes encoding Lc2.1-like proteins are absent from Trypanosoma species. Lc2.2 is characterized by a poly-glutamine rich C-terminus, absent from Lc2.1 or mtHSP70 homologues outside the trypanosomatids. Lc2.1 displays unique substitutions within its peptide-binding domain which modify amino acids strictly conserved in cytoplasmic and mitochondrial HSP70 proteins alike. Affinity purified antibodies recognize mainly a single protein in extracts from promastigotes/epimastigotes of various Leishmania/Trypanosoma species. Upon differentiation of Leishmania amazonensis into amastigotes a second protein (presumably Lc2.1) is induced and becomes the predominant mtHSP70 homologue expressed. Subcellular localization of these proteins was investigated and ratified a distribution throughout the mitochondrial matrix. Our results imply novel mtHSP70 functions which evolved within the genus Leishmania. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.