Sistema nervoso enterico e scrapie sperimentale in ovini di razza sarda con diversa suscettibilità genetica nei confronti della malattia

Sebbene il sistema nervoso enterico (“enteric nervous system”, ENS) svolga un ruolo cruciale nella patogenesi della Scrapie ovina, non esistono tuttavia in letteratura dati sulle popolazioni cellulari progressivamente coinvolte nel corso dell’infezione, né sugli eventuali danni morfo-funzionali da esse subiti. Il presente studio è stato condotto sui plessi mienterici e sottomucosi dell’ileo di 46 pecore di razza Sarda, recanti diversi polimorfismi del gene Prnp (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARR, ARR/ARR). I suddetti animali, infettati per os all’età di 8 mesi con un ceppo di Scrapie precedentemente caratterizzato nel topo, sono stati sacrificati mediante eutanasia a determinati intervalli di tempo post-infezione (p.i.). E’ stata quindi valutata, tramite immunoistochimica ed immunofluorescenza indiretta su sezioni tissutali e su preparati “wholemount”, l’immunoreattività (IR) nei confronti della PrPSc, del “marker” panneuronale Hu C/D, dell’ossido-nitrico sintetasi (nNOS), della calbindina (CALB) e della proteina fibrillare acida gliale (GFAP). In 8 pecore con genotipo ARQ/ARQ, clinicamente sane e sacrificate a 12-24 mesi p.i., nonché in 5 ovini clinicamente affetti (2 con genotipo ARQ/ARQ, 3 con genotipo ARQ/AHQ), questi ultimi sacrificati rispettivamente a 24, 36 e 40 mesi p.i., le indagini immunoistochimiche hanno consentito di dimostrare la presenza di PrPSc a livello sia dell’encefalo (obex), sia dell’ENS, in particolar modo nei plessi mienterici. In tali distretti il deposito della PrPSc risultava pienamente compatibile con un interessamento delle cellule enterogliali (“enteroglial cells”, EGCs), mentre occasionalmente si notava un contestuale coinvolgimento della componente neuronale ivi residente. In conclusione, i dati della presente indagine consentono di ipotizzare un verosimile coinvolgimento delle EGCs e dei neuroni residenti a livello dei plessi dell’ENS nella patogenesi della Scrapie sperimentale realizzata per os in ovini di razza Sarda.

Molecular markers for the assessment of genetic variability in threatened plant species

La variabilità genetica è un importante strumento per lo studio e la conservazione della biodiversità in specie rare e minacciate di estinzione. Durante il mio dottorato mi sono quindi occupata di mettere a punto diverse metodologie molecolari al fine di valutare la diversità genetica in due specie rare della flora italiana che presentano problematiche diverse e specifiche. I marcatori arbitrari RAPD e i marcatori semi-arbitrari ISSR sono stati utilizzati per valutare la diversità genetica in Quercus crenata Lam. e per confermare l’ipotesi della sua origine ibridogena dalle due specie presunte parentali Quercus cerris L. e Quercus suber L., essendo Q. crenata presente in Italia settentrionale dove Q. suber è attualmente assente. I marcatori SSR o microsatelliti sono invece stati messi a punto su una specie a rischio di estinzione, endemica dell’Appennino Tosco-Emiliano, Primula apennina Widmer, applicando una metodologia specifica, basata sulla costruzione di una libreria genomica arricchita per l’isolamento di primer specifici. I marcatori RAPD e ISSR, utilizzati su un totale di 85 campioni, hanno mostrato alti livelli di diversità molecolare entro le specie studiate, eccetto per Q. suber le cui popolazioni rappresentano il margine orientale di distribuzione della specie, per questo più sottoposte ad impoverimento genetico. Oltre alla cluster analysis (UPGMA) e alla Analisi delle Componenti Principali effettuate per entrambi i marcatori, che confermano l’ipotesi dell’origine ibrida degli individui di Q. crenata diffusi in Italia Settentrionale, sono stati calcolati l’indice di ibridità basato sul maximum likelihood, che dimostra una introgressione asimmetrica di Q. crenata verso il parentale caratterizzato da superiorità demografica (Q. cerris) e il test di Mantel. Quest’ultimo ha permesso di confrontare i due marcatori RAPD e ISSR utilizzati ottenendo una bassa correlazione, a conferma del fatto che, amplificando tratti differenti del DNA nucleare, i dati non sono sovrapponibili, sebbene forniscano risultati analoghi. Per l’isolamento di loci microsatelliti ipervariabili ho utilizzato il protocolllo FIASCO (Fast isolation by AFLP of sequences containing repeats- Zane et al. 2002) che permette di costruire una libreria genomica arricchita partendo dal DNA estratto da P. apennina. Tale procedura ha previsto la digestione del DNA genomico per la produzione di una miscela di frammenti di DNA. Tramite ibridazione con opportune sonde sono stati isolati i frammenti contenenti i microsatelliti. Sequenziando i cloni ricombinanti, ho ottenuto sequenze contenenti repeats sulle cui regioni fiancheggianti sono stati costruiti 15 coppie di primer che potranno, in seguito, essere utilizzate per definire la quota di riproduzione clonale in P. apennina e per valutare la diversità genetica delle popolazioni che coprono l’areale di distribuzione della specie. Data la loro natura altamente variabile e la loro abbondanza nel DNA, gli SSR saranno, come i marcatori RAPD e gli ISSR, ugualmente validi per lo studio della variabilità genetica e per l’analisi di problematiche specifiche legate alle specie rare.

La salute come promessa. Ingegneria genetica e biotecnologie fra biopolitica, diritto e criminalità

La tesi di dottorato di Carlo Antonio Gobbato prende in considerazione e sviluppa, secondo una prospettiva rigorosamente sociologica, i temi e i problemi che discendono dai progressi delle bioscienze e delle biotecnologie con particolare riferimento alla programmazione degli esseri umani con precise caratteristiche. Muovendo dalla riflessione di Jurgen Habermas sui caratteri della genetica liberale, sono stati, innanzi tutto, ripresi alcuni temi fondamentali della storia del pensiero politico e giuridico sviluppatisi in età moderna, considerando con particolare attenzione la ricostruzione epistemologica operata da Michel Foucault in merito alla nozione di biopolitica, ovvero sia al modo con cui si è cercato, a partire dal XVIII secolo, di razionalizzare i problemi posti dalla pratica governamentale nei confronti delle persone (pratiche concernenti la salute, il controllo sociale, l’igiene, la mortalità, le razze, ecc.). La biopolitica è una categoria gnoseologica di spiegazione dell’idea di sviluppo presente nell’età moderna, dove sono iscritti vari saperi e pratiche governamentali, risultando così un concetto storicamente determinato da costruzioni produttive e tecnologiche che consentono, oppure obbligano, la vita ad entrare nella storia. D’altra parte, la biopolitica non produce letteralmente la vita, ma interviene direttamente sulla vita consentendone le condizioni di mantenimento e sviluppo. Se la biopolitica ha determinato l’instaurazione del dominio della specie umana sulla materia inerte, la rivoluzione scientifica in atto, anche in ragione dell’intensità con cui procede lo sviluppo delle bioscienze e delle biotecnologie, sta determinando l’affermazione del dominio sulla materia vivente Il progressivo affrancamento delle bioscienze e delle biotecnologie dal sistema sociale e dal sotto sistema sanitario sta comportando un’intensa proliferazione legislativa e normativa di cui la bioetica è parte, assieme alla costituzione ed allo sviluppo di un polo di apparati tendenzialmente autonomo, anche in ragione delle grandi quantità di trasferimenti finanziari, pubblici e privati, specificatamente dedicati e del nuovo mercato dei brevetti sulla vita. Sono evidenti le preoccupazioni degli organismi internazionali e nazionali, ai loro massimi livelli, per un fenomeno emergente, reso possibile dai rapidi progressi delle bioscienze, che consente la messa a disposizione sul mercato globale di “prodotti” ricavati dal corpo umano impossibili da reperire se tali progressi non si fossero verificati. Si tratta di situazioni che formano una realtà giuridica, sociale e mercantile che sempre più le bioscienze contribuiscono, con i loro successi, a rappresentare e costruire, anche se una parte fondamentale nell’edificazione, cognitiva ed emozionale, di tali situazioni, che interagiscono direttamente con l’immaginario soggettivo e sociale, è costituita dal sistema dell’informazione, specializzata e non, che sta con intensità crescente offrendo notizie e riproduzioni, vere o verosimili, scientificamente fondate oppure solo al momento ipotizzate, ma poste e dibattute, che stanno oggettivamente alimentando nuove attese individuali e sociali in grado di generare propensioni e comportamenti verso “oggetti di consumo” non conosciuti solo fino a pochi anni fa. Propensioni e comportamenti che possono assumere, in ragione della velocità con cui si succedono le scoperte delle bioscienze e la frequenza con cui sono immessi nel mercato i prodotti biotecnologici (indipendentemente dalla loro vera o presunta efficacia), anche caratteri di effervescenza anomica, fino alla consumazione di atti gravemente delittuosi di cui la stessa cronaca e le inchieste giudiziarie che si stanno aprendo iniziano a dare conto. La tesi considera criticamente la nuova realtà che emerge dai progressi delle bioscienze e, dopo aver identificato nella semantica dell’immunità e nel dominio sul movimento del corpo gli orientamenti concettuali che forniscono il significato essenziale alla biopolitica di Foucault, cerca di definire secondo una prospettiva propriamente sociologica la linea di separazione fra le pratiche immunitarie ed altre pratiche che non possono essere fatte rientrare nelle prime o, anche, il limite del discorso di Foucault davanti alle questioni poste da Habermas ed inerenti la programmazione genetica degli esseri viventi. Le pratiche genetiche, infatti, non sono propriamente immunitarie e, anzi, la stessa logica discorsiva intorno al gene non ha carattere immunitario, anche se può apportare benefici immunitari. La logica del gene modifica la forma del corpo, è generativa e rigenerativa, può ammettere ed includere, ma anche negare, la semantica biopolitica, i suoi oggetti e i suoi nessi. Gli oggetti della biopolitica sono ogni giorno di più affiancati dagli oggetti di questa dimensione radicalmente originale, per significati e significanti, dimensione che, con un neologismo, si può definire polisgenetica, ovvero sia una pratica governamentale sui generis, con importanti riflessi sul piano socio – criminologico. L’ultima parte della tesi riporta i risultati di recenti ricerche sociologiche sulla percezione sociale dell’ingegneria genetica e delle biotecnologie, nonché presenta i risultati dell’elaborazione delle interviste effettuate per la tesi di ricerca.

Metodi molecolari nello studio della variabilità genetica di Tuber borchii

Tuber borchii (Ascomycota, order Pezizales) is highly valued truffle sold in local markets in Italy. Despite its economic importance, knowledge on its distribution and population variation is scarce. The objective of this work was to investigate the evolutionary forces shaping the genetic structure of this fungus using coalescent and phylogenetic methods to reconstruct the evolutionary history of populations in Italy. To assess population structure, 61 specimens were collected from 11 different Provinces of Italy. Sampling was stratified across hosts and habitats to maximize coverage in native oak and pine stands and both mychorrizae and fruiting bodies were collected. Samples were identified considering anatomo-morphological characters. DNA was extracted and both multilocus (AFLP) and single-locus (18 loci from rDNA, nDNA, and mtDNA) approaches were used to look for polymorphisms. Screening AFLP profiles, both Jaccard and Dice coefficients of similarity were utilized to transform binary matrix into a distance matrix and then to desume Neighbour-Joining trees. Though these are only preliminary examinations, phylogenetic trees were totally concordant with those deriving from single locus analyses. Phylogenetic analyses of the nuclear loci were performed using maximum likelihood with PAUP and a combined phylogenetic inference, using Bayesian estimation with all nuclear gene regions, was carried out. To reconstruct the evolutionary history, we estimated recurrent migration, migration across the history of the sample, and estimated the mutation and approximate age of mutations in each tree using SNAP Workbench. The combined phylogenetic tree using Bayesian estimation suggests that there are two main haplotypes that are difficult to be differentiated on the basis of morphology, of ecological parameters and symbiontic tree. Between these two lineages, that occur in sympatry within T. borchii populations, there is no evidence of recurrent migration. However, migration over the history of the sample was asymmetrical suggesting that isolation was a result of interrupted gene flow followed by range expansion. Low levels of divergence between the haplotypes indicate that there are likely to be two cryptic species within the T. borchii population sampled. Our results suggest that isolation between populations of T. borchii could have led to reproductive isolation between two lineages. This isolation is likely due to sympatric speciation caused by a multiple colonization from different refugia or a recent isolation. In attempting to determinate whether these haplotypes represent separate species or a partition of the same species we applied Biological and Mechanistic species Concepts. Notwithstanding, further analyses are necessary to evaluate if selection favoured premating or post-mating isolation.

Il genere Rhododendron L.: diversità genetica e fenomeni di ibridazione.

La terra, nel corso della sua storia, ha subito molteplici cambiamenti con la comparsa e scomparsa di numerose specie animali e vegetali. Attualmente, l’estinzioni delle specie, la riduzione degli areali e il depauperamento degli ecosistemi è da ricollegare alle attività dell’uomo. Per tali motivi, in questi ultimi decenni si è iniziato a dare importanza alla conservazione della biodiversità, alla creazione di zone protette e a sviluppare interventi di reintroduzione e rafforzamento di specie rare e a rischio di estinzione. Questo lavoro di tesi si propone di analizzare la variabilità genetica delle popolazioni di Rhododendron ferrugineum L. lungo il suo areale, con particolare attenzione alle aree marginali dell’Appennino, dove la specie rappresenta un caso di pseudo rarità, al fine di valutare lo stato di salute della specie al limite del suo areale e valutare appropriati interventi di conservazione o reintroduzione. Per effettuare le analisi sono stati messi a punto dei marcatori molecolari discontinui, i microsatelliti, che, essendo dei marcatori co-dominati, permettono di valutare differenti parametri legati alla diversità genetica delle popolazioni inclusi i livelli di eterozigotà ed il flusso genico tra popolazioni limitrofe. I campionamenti sono stati effettuati nelle uniche 3 stazioni presenti sugli Appennini. Al fine di confrontare la struttura genetica di queste popolazioni sono state considerate anche popolazioni delle Alpi Marittime, delle Alpi centro-orientali e dei Pirenei. L’analisi della diversità genetica effettuata su questo pool di popolazioni analizzate con 7 marcatori microsatelliti, ha messo in evidenza che le popolazioni relitte dell’Appennino Tosco-Emiliano presentano un ridotto livello di eterozigosità che suggerisce quindi un elevato livello di inbreeding. Si ritiene che ciò sia dovuto alla loro dislocazione sul territorio, che le rende isolate sia tra di loro che dalle popolazioni delle vicine Alpi Marittime. La stima delle relazioni genetiche tra le popolazioni appenniniche e le vicine piante alpine evidenzia come non vi sia scambio genetico tra le popolazioni. Le analisi dei cluster suggeriscono che due delle popolazioni Appenniniche siano più simili alle popolazioni della Alpi Marittime, mentre la terza ha più affinità con le popolazioni delle Alpi centro-orientali. Le popolazioni dei Pirenei risultano essere geneticamente più simili alle popolazioni delle Alpi Marittime, in particolare alle tre popolazioni del versante francese. In questo lavoro abbiamo affrontato anche il problema delle specie ibride. Rhododendron x intermedium Tausch è un ibrido frutto dell’incrocio tra Rhododendron ferrugineum L. e Rhododendron hirsutum L., in grado di incrociarsi sia con altri ibridi, sia con i parentali (fenomeno dell’introgressione). L’origine di questo ibrido risiede nella simpatria delle due specie parentali, che tuttavia, presentano esigenze ecologiche differenti. Ad oggi la presenza di Rhododendron x intermedium è stata accertata in almeno tre stazioni sulle Alpi Italiane, ma la letteratura documenta la sua presenza anche in altre zone dell’Arco Alpino. L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di verificare la reale natura ibrida di Rhododendron x intermedium in queste stazioni utilizzando un approccio integrato ossia sia attraverso un’analisi di tipo morfologico sia attraverso un analisi di tipo molecolare. In particolare l’approccio molecolare ha previsto prima un’analisi filogenetica attraverso l’utilizzo di marcatori molecolari filogenetici nucleari e plastidiali (ITS, At103, psbA-trnH e matK) e quindi un’analisi della struttura delle popolazioni della specie ibrida attraverso l’utilizzo di marcatori molecolari microsatelliti. Da un’analisi morfologica, risulta che gli esemplari ibridi possono essere molto differenti tra loro e ciò supporta la formazione di sciami ibridi. Al fine di verificare la natura di questa specie e la struttura delle popolazioni ibride e dei rispettivi parentali, sono state campionate differenti popolazioni in tutta l’area di interesse. I campioni ottenuti sono stati quindi analizzati geneticamente mediante marcatori molecolari del DNA. I risultati ottenuti hanno permesso innanzitutto di confermare l’origine ibrida degli individui di prima generazione della specie Rhododendron x intermedium e quindi di distinguere i parentali dagli ibridi ed evidenziare la struttura genetica delle popolazioni ibride.

La diagnosi genetica preimpianto: argomenti favorevoli e contrari alla sua legittimità

Questa tesi ricostruisce la storia della giurisprudenza italiana che ha riguardato la legittimità o meno dell’impiego della diagnosi genetica preimpianto nell’ambito della procreazione medicalmente assistita, dall’emanazione della legge 40 del 2004 a tutt’oggi. Ed in particolare questa tesi si prefigge due obiettivi: uno, individuare ed illustrare le tipologie di argomenti utilizzati dal giurista-interprete per giudicare della legittimità o meno della pratica della diagnosi preimpianto degli embrioni prodotti, mediante le tecniche relative alla procreazione assistita; l’altro obiettivo, mostrare sia lo scontro fra i differenti argomenti, sia le ragioni per le quali prevalgono gli argomenti usati per legittimare la pratica della diagnosi preimpianto. Per raggiungere questi obiettivi, e per mostrare in maniera fenomenologica come avviene l’interpretazione giuridica in materia di diagnosi preimpianto, si è fatto principalmente riferimento alla visione che ha della detta interpretazione la prospettiva ermeneutica (concepita originariamente sul piano teoretico, quale ermeneutica filosofica, da H.G. Gadamer; divulgata ed approfondita sul piano giusfilosofico e della teoria dell’interpretazione giudica in Italia, fra gli altri, da F. Viola e G. Zaccaria). Così, in considerazione dei vari argomenti utilizzati per valutare la legittimità o meno della pratica della diagnosi preimpianto, i motivi per i quali in ultimo il giurista-interprete per giudicare ragionevolmente, deve ritenere legittima la pratica della diagnosi preimpianto sono i seguenti. I principi superiori dell’ordinamento e talune direttive giuridiche fondamentali dell’ordinamento, elaborate della giurisprudenza, le quali costituiscono la concretizzazione di detti principi e di una serie di disposizioni normative fondamentali per disciplinare il fenomeno procreativo, depongono per la legittimità della diagnosi preimpianto. Le tipologie degli argomenti impiegati per avallare la legittimità della diagnosi preimpianto attengono al tradizionale repertorio argomentativo a cui attinge il giurista, mentre la stessa cosa non si può dire per gli argomenti usati per negare la legittimità della diagnosi. Talune tipologie di argomenti utilizzate per negare la legittimità della diagnosi preimpianto costituiscono delle fallacie logiche, per esempio l’argomento del pendio scivoloso, e soprattutto le tipologie degli argomenti utilizzati per sostenere la legittimità della diagnosi preimpianto sono per lo più caratterizzate dalla ragionevolezza ed applicate per lo più opportunamente. Poi, si può osservare che: determinati argomenti, associati dal giurista-interprete ai principi i quali depongono per l’illegittimità della diagnosi preimpianto, facendo leva sulla categoria della possibilità, ed equiparando attualità e possibilità, privilegiano l’immaginazione alla realtà e portano a risultati interpretativi non razionalmente fondati; mentre gli argomenti associati dal giurista-interprete ai principi i quali depongono per la legittimità della diagnosi preimpianto, facendo leva sulla categoria della attualità, e tenendo ben distinte attualità e possibilità, privilegiano l’osservazione della realtà e portano a risultati razionalmente fondati.