Bioprospecting for culturable actinobacteria with antimicrobial properties isolated from rivers in Colombian Orinoquia

Purpose: To Isolate and characterize Actinobacteria with antimicrobial activity from Guaviare River (Colombia). Methods: Water and sediment samples were collected from Guaviare River. Direct plating, heat and CaCO3 methods were used to isolate Actinobacteria. Six bacterial strains were tested using T-Streak method: Escherichia coli ATCC 23724, Staphylococus aureus ATCC 25923, Acinetobacter baumannii ATCC 19606, Bacillus subtilis ATCC 21556, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Chromobacterium violaceum ATCC 31532. Strains of Fusarium sp. H24, Trichoderma harzianum H5 and Colletotrichum gloeosporioides were tested using Kirby-Bauer method. Isolates with high antimicrobial activity were selected for further taxonomic identification. Results: A total of 374 actinobacteria isolates were obtained. Seven isolates exhibited high antimicrobial activity (p < 0.05) and were confirmed as members of Streptomycetaceae family. Of these, three isolates showed differential phenotypic and genotypic profiles, indicating that they may represent new species. Conclusions: To date, this is the first study of this type in Colombian Orinoquia and indicates that this promising source of Actinobacteria from aquatic sediments with the ability to produce antimicrobial secondary metabolites.

DETECTION OF SPORES AND HYPHAE OF ARTWORKS’ BIODETERIOGENIC FILAMENTOUS FUNGI BY RNA-FISH

Filamentous fungi are a threat to the conservation of Cultural Heritage. Thus, detection and identification of viable filamentous fungi are crucial for applying adequate Safeguard measures. RNA-FISH protocols have been previously applied with this aim in Cultural Heritage samples. However, only hyphae detection was reported in the literature, even if spores and conidia are not only a potential risk to Cultural Heritage but can also be harmful for the health of visitors, curators and restorers. Thus, the aim of this work was to evaluate various permeabilizing strategies for their application in the detection of spores/conidia and hyphae of artworks’ biodeteriogenic filamentous fungi by RNA-FISH. Besides of this, the influence of cell aging on the success of the technique and on the development of fungal autofluorescence (that could hamper the RNA-FISH signal detection) were also investigated. Five common biodeteriogenic filamentous fungi species isolated from biodegradated artworks were used as biological model: Aspergillus niger, Cladosporium sp, Fusarium sp, Penicillium sp. and Exophialia sp. Fungal autofluorescence was only detected in cells harvested from Fusarium sp, and Exophialia sp. old cultures, being aging-dependent. However, it was weak enough to allow autofluorescence/RNA-FISH signals distinction. Thus, autofluorescence was not a limitation for the application of RNA-FISH for detection of the taxa investigated. All the permeabilization strategies tested allowed to detect fungal cells from young cultures by RNA-FISH. However, only the combination of paraformaldehyde with Triton X-100 allowed the detection of conidia/spores and hyphae of old filamentous fungi. All the permeabilization strategies failed in the Aspergillus niger conidia/spores staining, which are known to be particularly difficult to permeabilize. But, even in spite of this, the application of this permeabilization method increased the analytical potential of RNA FISH in Cultural Heritage biodeterioration. Whereas much work is required to validate this RNA-FISH approach for its application in real samples from Cultural Heritage it could represent an important advance for the detection, not only of hyphae but also of spores and conidia of various filamentous fungi taxa by RNA-FISH.

Fungos associados ao escurecimento da madeira em paricá.

O paricá (Schizolobium parahyba var. amazonicum (Huber ex Ducke) Barneby) é uma espécie de potencial madeireiro e alternativa para reflorestamento de recuperação de áreas degradadas. Sua ocorrência é restrita à Bacia Amazônica, no Brasil, Bolívia e Venezuela. No Brasil, ocorre em mata primária e secundária de terra-firme e várzea alta. Muitos fungos têm sido relatados causando doenças nesta cultura. Em amostras de madeira provenientes de plantios do município de Vigia-PA observou-se a presença de manchas escurecidas associadas à fungos. Assim, o trabalho teve como objetivo identificar os fungos associados ao escurecimento da madeira de paricá por meio de PCR, seguido do sequenciamento do DNA. Para isso, amostras de tecido doente de paricá foram plaqueados em ágar-água. Posteriormente, os fungos foram repicados para meio BDA e mantidos a temperatura ambiente. Foi realizada a extração de DNA para a realização do PCR utilizando os primers ITS4 e ITS5 e posteriormente o sequenciamento nucleotídico. Os produtos do PCR foram avaliados utilizando o programa Blastn, onde foi permitido apenas a identificação dos gêneros dos fungos Lasiodiplodia sp., Fusarium sp., Trichoderma sp. e Rhizoctonia sp. Outros dois fungos não foram identificados.

Characterisation of Australian isolates of Fusarium oxysporum f. sp cubense by DNA fingerprinting analysis

Genetic variation among Australian isolates of the fungus Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), which causes Fusarium wilt in banana, was examined using DNA amplification fingerprinting (DAF). Ninety-four isolates which represented Races 1, 2, 3, and 4, and vegetative compatibility groups (VCGs) 0120, 0124, 0125, 0128, 0129, 01211, 01213/16, and 01220 were analysed. The genetic relatedness among isolates within each VCG, and between the 8 different VCGs of Foc present in Australia was determined. The DNA fingerprint patterns were VCG-specific, with each VCG representing a unique genotype. The genetic similarity among isolates within each VCG ranged from 97% to 100%. Among the different VCGs of Foc, 3 major clusters were distinguished which corresponded with race. All Race 1 and 2 isolates (VCGs 0124, 0125, 0128, and 01220) were closely related and clustered together, the Race 3 isolates from Heliconia clustered separately, and all Race 4 isolates (VCGs 0120, 0129, 01211, and 01213/16) clustered together. Fifteen isolates from Alstonville, NSW, were characterised because although they were classified as Race 2 based on their recovery from cooking banana cultivars, they belonged in VCG 0124, which had previously contained only Race 1 isolates. The occurrence of more than one race within a VCG means that vegetative compatibility grouping cannot be used to assign pathotype to pathogenic race as previously thought. It was possible to distinguish the Race 1 and Race 2 isolates within VCG 0124 using DNA fingerprinting, as each race produced a unique DNA fingerprint pattern. Among the Australian isolates, DNA fingerprinting analysis identified 9 different VCGs and genotypes of Foc.

Revisão da classificação da raça 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Os autores procuraram, face às evidências acumuladas, determinar: 1) a que raça fisiológica pertence o isolado T-18-1, descrito como raça 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici; 2) qual o tipo de resistência que apresenta a linhagem CAST-M-Wd, usada como diferencial na determinação da raça 3. Para alcançar os objetivos almejados, instalaram-se 2 ensaios em casa de vegetação com controle parcial de temperatura. No ensaio I estudou-se a reação de 27 progênies de Cast-M-Wd ao isolado T-18-1, usando-se como diferenciais, a variedade Walter e a linhagem S-34, que possuem resistência monogênica às raças 1 e 2 e à raça 1, respectivamente. No ensaio II comparou-se a patogenicidade entre o isolado T-18-1 e a raça 2 do patógeno. Neste ensaio foram incluídas 6 progênies de CAST-M-Wd, considerando-se o comportamento destas no ensaio I. Usou-se, também, como diferenciais, a variedade Walter e a linhagem S-34. Os resultados obtidos permitiram tirar as seguintes conclusões: 1) o isolado T-18-1 pertence à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici; 2) a linhagem de tomateiro CAST-M-Wd, usada como diferencial na determinação da raça 3 do patógeno, não possui resistência monogênica e sim, resistência poligênica à raça 2; 3) o gene, 1-2 encontrado na variedade Walter, mostra-se eficiente no controle da raça 2 (isolado T-18-1) assinalada no Brasil.

Biocontrol by phenazine-1-carboxamide-producing Pseudomonas chlororaphis PCL1391of tomato root rot caused by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici

Seventy bacterial isolates from the rhizosphere of tomato were screened for antagonistic activity against the tomato foot and root rot-causing fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. One isolate, strain PCL1391, appeared to be an efficient colonizer of tomato roots and an excellent biocontrol strain in an F. oxysporum/tomato test system. Strain PCL1391 was identified as Pseudomonas chlororaphis and further characterization showed that it produces a broad spectrum of antifungal factors (AFFs), including a hydrophobic compound, hydrogen cyanide, chitinase(s), and protease(s). Through mass spectrometry and nuclear magnetic resonance, the hydrophobic compound was identified as phenazine-1-carboxamide (PCN). We have studied the production and action of this AFF both in vitro and in vivo. Using a PCL1391 transposon mutant, with a lux reporter gene inserted in the phenazine biosynthetic operon (phz), we showed that this phenazine biosynthetic mutant was substantially decreased in both in vitro antifungal activity and biocontrol activity. Moreover, with the same mutant it was shown that the phz biosynthetic operon is expressed in the tomato rhizosphere. Comparison of the biocontrol activity of the PCN-producing strain PCL1391 with those of phenazine-1-carboxylic acid (PCA)-producing strains P. fluorescens 2-79 and P. aureofaciens 30-84 showed that the PCN-producing strain is able to suppress disease in the tomato/F. oxysporum system, whereas the PCA-producing strains are not. Comparison of in vitro antifungal activity of PCN and PCA showed that the antifungal activity of PCN was at least 10 times higher at neutral pH, suggesting that this may contribute to the superior biocontrol performance of strain PCL1391 in the tomato/F. oxysporum system.

Reação de genótipos de feijoeiro comum a Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina e Xanthomonas campestris pv. phaseoli

Foi avaliado no presente trabalho o comportamento dos genótipos de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) PI 150414, PI 163117, PI 175829 branco, PI 175829 roxo, PI 175858, PI 197687, A 417, A 420, A 429, Xan 160, Xan 161, WISHBR 40 e IAC Carioca inoculados com Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina e Xanthomonas campestris pv. phaseoli, sob condições de telado/casa de vegetação. Verificou-se que os genótipos Xan 160, PI 150414, A 417, PI 175829 roxo, Xan 161, A 420, PI 163117 e PI 175829 branco foram resistentes a F. oxysporum f. sp. phaseoli e somente o PI 175829 branco apresentou bom nível de resistência a M. phaseolina. Com relação ao comportamento desses genótipos a X. campestris pv. phaseoli, eles foram altamente suscetíveis ao isolado Feij-4 e apenas o genótipo Xan 161 apresentou nível moderado de resistência foliar ao isolado Feij-41.

Differential gene expression, induced by salicylic acid and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici infection, in tomato

The objective of this work was to determine the transcript profile of tomato plants (Lycopersicon esculentum Mill.), during Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici infection and after foliar application of salicylic acid. The suppression subtractive hybridization (SSH) technique was used to generate a cDNA library enriched for transcripts differentially expressed. A total of 307 clones was identified in two subtractive libraries, which allowed the isolation of several defense-related genes that play roles in different mechanisms of plant resistance to phytopathogens. Genes with unknown roles were also isolated from the two libraries, which indicates the possibility of identifying new genes not yet reported in studies of stress/defense response. The SSH technique is effective for identification of resistance genes activated by salicylic acid and F. oxysporum f. sp. lycopersici infection. Not only the application of this technique enables a cost effective isolation of differentially expressed sequences, but also it allows the identification of novel sequences in tomato from a relative small number of sequences.

Variabilidade genética de isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense obtidos de bananais do norte de Minas Gerais

A banana é uma das frutas tropicais mais consumidas no mundo, respondendo por, aproximadamente, 10% do comércio mundial de frutas. O mal-do-panamá, causado por Fusariumoxysporum f. sp. cubense (E.F. Smith), é uma das principais doenças da bananeira. Os marcadores moleculares RAPD têm sido extremamente úteis para estudos de identificação taxonômica, análise de variabilidade da virulência em fungos fitopatogênicos, caracterização de raças e variabilidade inter e intraespecifica de populações de diferentes regiões. O objetivo do trabalho foi avaliar a variabilidade genética de 36 culturas monospóricas de isolados de F. oxysporum f. sp. cubense por meio de marcadores moleculares do tipo RAPD. Foram selecionados 13 primers RAPD, e a análise de dados foi realizada utilizando-se do coeficiente de similaridade de Nei e Li. A partir da amplificação dos primers, foram obtidas 178 bandas, sendo que 167 (93,82%) apresentaram polimorfismo entre, pelo menos, dois isolados e apenas 11 (6,18%) apresentaram monomorfismo, demonstrando alta variabilidade entre os isolados. As distâncias genéticas variaram de 5,7 a 54,6%, sendo a distância média de 30,2%, e a distância média relativa, de 55,3%. De acordo com a análise de agrupamento (UPGMA), não foram observadas correlações entre os isolados estudados. Os resultados sugerem alta variabilidade genética entre os isolados avaliados, não ocorrendo agrupamento de acordo com a origem geográfica de coleta.

VARIABILIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE Fusarium solani e Fusarium oxysporum f. sp.passiflorae ASSOCIADOS AO MARACUJAZEIRO

Determinou-se a variabilidade genética de 37 isolados de Fusarium solani e 13 isolados de Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae patogênicos ao maracujazeiro por meio do uso de marcadores ISSR e RAPD. Os isolados foram obtidos de maracujazeiros com sintomas de murcha, encontrados nas principais regiões produtoras do Norte Mineiro e no município de Sebastião Laranjeira – BA. Após obtenção de culturas monospóricas, os isolados tiveram seus DNAs extraídos e submetidos à reação de PCR. Foram selecionados nove primers ISSR e nove primersRAPD, e a análise de dados foi realizada, utilizando-se do coeficiente de similaridade de Jaccard. A partir da amplificação com os primers ISSR e RAPD, foram obtidos 121 e 126 locos, respectivamente, sendo quetodos apresentaram polimorfismo entre, pelo menos, dois isolados. Demonstraram-se, por meio das análises ISSR, índice de similaridade genética interespecífica de 0,15 e índices de variabilidade intraespecífica de 0,27 a 0,92 para F. solani e de 0,30 a 0,89 para F. oxysporum. f. sp. passiflorae. Já, por meio das análises RAPD, foram gerados índice de similaridade genética interespecífica de 0,11 e índices de variabilidade intraespecífica de 0,17 a 0,79 para F. solani e de 0,21 a 0,73 para F. oxysporum f. sp. passiflorae. Os isolados de F. oxysporum f. sp. passiflorae e F. solani agruparam-se em dois clustersdistintos, e observou-se uma alta variabilidade intraespecífica nas duas espécies.

Severidade de isolados de Fusarium subglutinans f. sp. ananas sensíveis e resistentes ao benomyl, em abacaxizeiro

Mudas das cultivares de abacaxi (Ananas comosus) 'Pérola' (suscetível) e 'Primavera' (resistente) foram inoculadas em casa de vegetação com isolados de Fusarium subglutinans f. sp ananas, resistentes e sensíveis ao benomyl, de diferentes áreas produtoras de abacaxi do Espírito Santo, visando estudar a virulência do patógeno. Foi utilizada suspensão de conídios obtidos pela raspagem da superfície das colônias desenvolvidas em meio BDA, cuja concentração final foi 10(5) conídios/ml. A inoculação de F. subglutinans f. sp ananas foi efetuada pela imersão de mudas injuriadas mecanicamente na base, com três meses de idade, na suspensão de inóculo. Dos 22 isolados testados preliminarmente, selecionou-se oito de F. subglutinans f. sp ananas, sendo quatro representativos do grupo dos sensíveis ao benomyl (E285, E277, E278 e E290) e quatro representativos do grupo dos resistentes ao benomyl (E272, E274, E279 e E283) para realização do teste final. Os resultados comprovaram a resistência da cv. Primavera a todos os isolados testados. Plantas da cv. Pérola apresentaram sintomas da doença aos 15 dias após a inoculação com isolados resistentes ao benomyl; os isolados sensíveis ao benomyl só foram capazes de causar sintomas severos da doença aos 45 e 60 dias após a inoculação. O isolado E272, resistente ao benomyl, foi o mais virulento, tendo causado a maior lesão e a morte das plantas aos 30 dias após a inoculação; os isolados E277 e E278 foram os mais virulentos. Houve diferenças em virulência de isolados de F. subglutinans f. sp. ananas resistentes e sensíveis ao benomyl ao abacaxizeiro.

Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f. sp. phaseoli de F. solani f. sp. glycines

Métodos moleculares têm sido utilizados para caracterizar a diversidade entre isolados de Fusarium spp. patogênicos e não patogênicos a uma cultura e, para determinar relações genéticas entre formae speciales. Testes de patogenicidade realizados em soja (Glycine max) e feijoeiro (Phaseolus vulgaris) com 17 isolados de Fusarium solani não demonstraram especificidade de hospedeiros. Utilizou-se a técnica ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) para analisar a região ITS1 - 5,8S rDNA - ITS2, amplificada com os primers ITS5 e ITS4. Os produtos amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição Hae III e Msp I. Os padrões de bandas gerados pela digestão com a enzima Hae III permitiram diferenciar três grupos entre os isolados de F. solani, sendo um grupo específico para isolados de F. solani f. sp. phaseoli com 100% de similaridade entre os 11 isolados. Entre os isolados de F. solani f. sp glycines foram observados dois padrões distintos de restrição. A técnica de ARDRA utilizando a enzima Hae III apresenta, portanto, potencial para utilização como um marcador para diferenciação entre as formae specialesphaseoli e glycines, dentro do complexo F. solani.

In vitro toxin production by Fusarium solani f. sp. piperis

Fusarium solani f. sp. piperis (teleomorph: Nectria haematococca f. sp. piperis), causal agent of root rot and stem blight on black pepper (Piper nigrum), produces secondary metabolites with toxigenic properties, capable of inducing vein discoloration in detached leaves and wilting in transpiring microcuttings. Production of F. solani f. sp. piperis (Fsp) toxic metabolites reached a peak after 25 days of static incubation on potato sucrose broth at 25 ºC under illumination. Changes in the pH of the culture filtrate did not alter the effect of toxic metabolites. However, when the pH was changed before the medium had been autoclaved, a more intense biological response was observed, with an optimum at pH 6.0. Isolates that produced red pigments in liquid cultures were more efficient in producing biologically active culture filtrates than those which produced pink coloured or clear filtrates suggesting that these pigments could be related to toxigenic activity. Detached leaves of seven black pepper cultivars and Piper betle showed symptoms of vein discoloration after immersion in autoclaved and non-autoclaved Fsp culture filtrates indicating the thermostable nature of these toxic metabolites.

Reação de cultivares de soja à podridão vermelha da raiz causada por Fusarium solani f. sp. glycines

A podridão vermelha da raiz, causada por Fusarium solani f. sp. glycines, é considerada uma das doenças mais severas de soja (Glycine max) no Sul do Brasil. Este trabalho avaliou a reação de 30 genótipos de soja em experimentos conduzidos em câmara de crescimento, na Embrapa Trigo, Passo Fundo, RS. Inoculou-se o fungo nos genótipos pelo método "palito-de-dente", através da introdução de uma ponta de palito colonizada pelo fungo no hipocótilo de cada plântula e pelo método "grão de sorgo", em que o inóculo, constituído de grãos de sorgo (Sorghum bicolor) colonizados, foi colocado ao redor do colo da planta. Avaliaram-se os sintomas na parte aérea e no sistema radicular. Para ambos métodos de inoculação, houve diferenças entre genótipos e a amplitude de reação variou de resistência moderada à alta suscetibilidade. Os genótipos BRS 66, BRS 137 e BRS 138, pelo método "palito-de-dente", e IAS 5 e BRS 137, pelo método "grão de sorgo", foram considerados moderadamente resistentes. Os genótipos Embrapa 59, CEP 12-Cambará, Ipagro 21, FT-Guaíra, FT-Abyara, BR-4 e FT-2003 foram moderadamente suscetíveis (MS) pelo método "palito-de-dente", enquanto Ivorá, RS 7-Jacuí, Fepagro RS-10, BR-16, CD 203, BR-4, CEP 20-Guajuvira, BRS 154, BRS 138 e Cobb foram MS pelo método "grão de sorgo". Por outro lado, Bragg, CD 205, RS 5-Esmeralda, RS 9- Itaúba, IAS 4, Ocepar 14, CD 201, FT 2011, FT-Saray, BRS 153 e FT-2004 foram suscetíveis em ambos os métodos usados.

Colonização de raízes de tomateiro por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici em solução nutritiva com três fontes de nitrogênio

Os objetivos do presente trabalho foram os de avaliar o efeito do pH sobre a germinação de conídios e o crescimento miceliano de F. oxysporum f. sp. lycopersici e o efeito da fonte de nitrogênio sobre o início do processo de infecção de raízes de mudas de tomateiro (Lycopersicon esculentum). Inicialmente quantificou-se a porcentagem de germinação dos conídios e o crescimento miceliano em meio Caldo Nutritivo com pH variando de 2,0 a 11,0. O pH do meio foi também medido ao final de 14 dias de crescimento do fungo. Avaliou-se, ainda, por meio de isolamentos e observações ao microscópio óptico, o efeito das fontes de nitrogênio sobre o processo de infecção e colonização das raízes. Utilizou-se a cultivar Kada Gigante e solução nutritiva contendo como fontes de nitrogênio N-NH4+, N-NO3- e N-NH4NO3, seguido da adição ou não de conídios do patógeno. As avaliações de pH da solução, das alterações morfológicas da raiz e da colonização pelo patógeno foram feitas até 240 h após a infestação. O N-NO3- proporcionou maiores valores de pH e favoreceu o desenvolvimento radicular, com aumento do tamanho e número de pêlos radiculares, e redução da taxa de adesão de conídios e da colonização por F. oxysporum f. sp. lycopersici comparado a N-NH4NO3 e, principalmente, N-NH4+. Estes resultados, porém, devem-se, mais provavelmente, ao desbalanço iônico nas plantas supridas com N-NH4+, do que ao efeito simples da variação de pH da rizosfera. O patógeno mostrou-se hábil em se desenvolver em faixa ampla de pH, 3 a 9, em meio de cultura.