Development of multifunctional coatings deposited on polymers based sensors for biomedical applications

Tese de Doutoramento (Programa Doutoral em Engenharia de Materiais)

Formas de ocorrência do fósforo no solo latosólico roxo

O presente trabalho apresenta os resultados obtidos sôbre um estudo de fracionamento do fósforo em oito amostras constituidas do horizonte Ap de solo latosólico roxo do Estado de São Paulo e do Paraná. Nessas amostras procederam-se as determinações do fósforo solúvel em água e fração fracamente ligada aos colóides, extraídos com solução de cloreto de amônio 0,5 N; fósforo ligado ao alumínio, extraido com solução 0,5 N de fluoreto de amônio com pH = 8,5; fósforo ligado ao ferro, extraído com solução 0,1 N de NaOH; fósforo ligado ao cálcio, extraido com solução 0,5 N de ácido sulfúrico; fósforo ocluido nas formas de fosfatos de ferro e de alumínio. Além disso foram determinados o fósforo orgânico e o fósforo total. Os dados obtidos evidenciaram que os solos estudados apresentaram uma quantidade razoável, 45,3 a 162,5 ppra, de fósforo ligado ao cálcio, o que é explicável tendo em vista o teor de cálcio trocável nas amostras, que variou de 7,71 a 19,40 e.mg por 100 g de solo, e o pH que variou de 6,30 a 7,50. 0 teor de fósforo ligado ao alumínio variou de 35,0 a 265,7 ppm de P; o de fósforo ligado ao ferro, de 74,2 a 144,9 ppm de P; e o de fósforo ocluido de 470,8 a 850,8 ppm de P. O teor de fósforo orgânico e o total variaram, respectivamente, de 347,2 a 511,0 e de 741,0 a 1493,0 ppm de P.

Extração do fósforo nativo e do adicionado ao solo com várias soluções

A extração do fósforo nativo e do adicionado a amostras de solos (horizonte Ap) Latosol Roxo (LR), Latosol Vermelho Amarelo, fase arenosa (LVa), Podzolizado Vermelho Amarelo-orto (PV) e Podzolizado Lins-Marília, variação Marília (Pml), com diversas soluções (H2S0(4) 0,05N; HCl 0,05N +H2SO4 0,025N; H2SO4 0,05N + NH4F 0,025N; e CH3C00H 0,10N), decresceu pronunciadamente (50% ou mais), em muitos casos, quando a relação peso da amostra (em gramas) para volume (em ml) da solução extratora variou de 5:100 para 20:100. A solução de H2SO4 0,05N + NH4F 0,025N extraiu mais fósforo nativo e adicionado ao solo do que as demais soluções nos solos LR, LVa e PV, isto é, solos com um certo teor de sesquióxidos, de pH baixo, indicando a ação solubilizante do ânion fluoreto, quer pela ação complexante frente ao ferro e alumínio, libertando o fosfato, quer pela troca aniônica ou, ainda, evitando a refixação ou readsorção do fósforo extraido. A solução de ácido acético 0,10N extraiu fósforo nativo e adicionado em quantidade relativamente elevada apenas do solo Pml, isto é, com pH = 7,1, baixo teor em sesquióxidos e teor razoável em Ca + Mg, onde o fósforo provavelmente tende a integrar sistemas cálcicos. Nos demais solos, com pH baixo e teor de sesquióxidos mais elevado, a solução de CH3COOH 0,10N praticamente não extraiu o fósforo nativo e o adicionado. Os dados obtidos apresentam importância no estabelecimento de técnicas utilizadas em análises de solos para fins de fertilidade.

Protease activity in Giardia duodenalis trophozoites of axenic strains isolated from symptomatic and asymptomatic patients

We have examined by gelatin-SDS-PAGE the protease activity in cell lysates of Giardia duodenalis trophozoites of two axenic strains isolated in Brazil from a symptomatic patient (BTU-11) and an asymptomatic carrier (BTU-10), and the reference strain Portland 1 (P1). The proteolysis band patterns showed differences among strains isolated from asymptomatic and symptomatic individuals. The lysate of the strain BTU-10, showed only five hydrolysis bands, while a greater number of bands (10-11 bands) was seen in strains BTU-11 and P1. The protease activity in all lysates was inhibited by cysteine (E-64 and iodoacetamide) and serine proteases (TPCK and TLCK) inhibitors, but not by PMSF and EDTA. In general, the results revealed protease activities in G. duodenalis trophozoites of Brazilian axenic strains and the predominance of cysteine proteinases. It should be stressed the inter-strain difference in hydrolysis band patterns observed between strains isolated from symptomatic patients and the strain obtained from an asymptomatic carrier.

Subcellular localization of an intracellular serine protease of 68 kDa in Leishmania (Leishmania) amazonensis promastigotes

Here we report the subcellular localization of an intracellular serine protease of 68 kDa in axenic promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonensis, using subcellular fractionation, enzymatic assays, immunoblotting, and immunocytochemistry. All fractions were evaluated by transmission electron microscopy and the serine protease activity was measured during the cell fractionation procedure using a-N-r-tosyl-L-arginine methyl ester (L-TAME) as substrate, phenylmethylsulphone fluoride (PMSF) and L-1-tosylamino-2-phenylethylchloromethylketone (TPCK) as specific inhibitors. The enzymatic activity was detected mainly in a membranous vesicular fraction (6.5-fold enrichment relative to the whole homogenate), but also in a crude plasma membrane fraction (2.0-fold). Analysis by SDS-PAGE gelatin under reducing conditions demonstrated that the major proteolytic activity was found in a 68 kDa protein in all fractions studied. A protein with identical molecular weight was also recognized in immunoblots by a polyclonal antibody against serine protease (anti-SP), with higher immunoreactivity in the vesicular fraction. Electron microscopic immunolocalization using the same polyclonal antibody showed the enzyme present at the cell surface, as well as in cytoplasmic membranous compartments of the parasite. Our findings indicate that the internal location of this serine protease in L. amazonensis is mainly restricted to the membranes of intracellular compartments resembling endocytic/exocytic elements.

Secretion of an endogenous subtilisin by Pichia pastoris strains GS115 and KM71.

The methylotrophic yeast Pichia pastoris is widely used for the expression of heterologous enzymes. While the purity of the desired expression product is of major importance for many applications, we found that recombinant enzymes produced in methanol medium were contaminated by a 37-kDa endogenous yeast protease. This enzyme was completely inhibited by phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) but not by 1,10-phenanthroline, EDTA, and pepstatin A, suggesting the nature of a serine protease. Its secretion was abolished in P. pastoris strains GS115 and KM71 by specific mutagenesis of a subtilisin gene (SUB2) but not by inactivation of the gene encoding vacuolar proteinase B (PRB). Bioinformatic comparisons of Sub2 protein with subtilisins from other fungal genomes and phylogenetic analyses indicated that this enzyme is not an orthologue of the vacuolar protease cerevisin generally present in yeasts but is more closely related to another putative subtilisin found in a small number of yeast genomes. During growth of P. pastoris, Sub2 was produced as a secreted enzyme at a concentration of 10 microg/ml of culture supernatant after overexpression of the full-length SUB2 gene. During fermentative production of recombinant enzymes in methanol medium, 1 ml of P. pastoris culture supernatant was found to contain approximately 3 ng of Sub2, while the enzyme was not detected during growth in a medium containing glycerol as a carbon source. The mutant strain GS115-sub2 was subsequently used as a host for the production of recombinant proteases without endogenous subtilisin contamination.

Monitorização e gestão dos Recursos Geológicos e seus impactes ambientais no concelho de São Domingos, ilha de Santiago - Cabo Verde, com ênfase na qualidade da Água

A água é um recurso natural essencial à vida fortemente suscetível de degradação, pelo que é fundamental a sua gestão e o controlo da sua qualidade. Os usos da água dependem das suas propriedades e composição. Estas, por sua vez, resultam de processos de interação água-rocha e da introdução antrópica de substâncias que podem afetar a sua qualidade e, assim, condicionar os usos. A presente investigação tem como objetivo a avaliação do estado de qualidade da água e potencialidades de uso no concelho de S. Domingos, Ilha de Santiago, Cabo Verde. Foram colhidas 22 amostras de água, sujeitas as medições in situ de parâmetros expeditos: pH, condutividade elétrica (CE), sólidos dissolvidos totais (TDS) e temperatura. A caracterização foi completada com a análise da componente aniónica (cloreto, brometo, fluoreto, nitrato, nitrito, fosfato e sulfato), de alcalinidade, oxidabilidade, sólidos suspensos totais e metais. Os resultados obtidos mostram, de uma maneira geral, o carácter mineralizado destas águas, com valor médio de condutividade de 1361µS/cm. A classificação hidroquímica, de acordo com diagrama de Piper, conduziu à discriminação dos seguintes tipos: águas mistas bicarbonatadas, equivalendo a 50% das amostras, mistas cloretadas (22,7%) e mistas sódicas (cloretadas e bicarbonatadas), correspondendo a 27% das amostras. Considerando o que está estabelecido no Decreto-Lei n.º 236/98, de 1 de agosto de Portugal e no Decreto-Lei nº8/2004 de Cabo Verde, que definem os valores paramétricos de qualidade da água, verificou-se que apenas 36% das amostras têm qualidade suficiente para consumo humano, cumprindo na íntegra os padrões de potabilidade estabelecidos. No que respeita à utilização da água para rega, segundo o Diagrama U. S. Salinity Laboratory, 68% das amostras mostram evidências de perigo salinização alto a muito alto e 32% apresentam risco médio. Quanto à alcalinização apenas 9% das amostras apresentam perigo médio, enquanto as restantes não indicam qualquer restrição de uso na agricultura. A análise estatística dos resultados pôs em evidência processos naturais de evolução hidroquímica, particularmente a salinização de amostras situadas em aluviões e praias fósseis. De maneira similar, o estudo efetuado revelou a existência de processos de degradação desencadeados por contaminação fecal. Visando a proteção da saúde da população do concelho, recomenda-se a implementação de medidas que proporcionem o aproveitamento sustentado e seguro dos recursos hídricos que passam, desde logo, pela elaboração de um plano de monitorização da qualidade de água para todo o concelho.

Acúmulo e efeitos fitotóxicos do flúor em folhas de boldo-gambá e capim-cidreira utilizadas para chás

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de acúmulo de fluoreto em folhas de boldo-gambá (Plectranthus neochilus) e capim-cidreira (Cymbopogon citratus), determinar o percentual de liberação do poluente por meio da infusão e caracterizar, visual e microscopicamente, os danos foliares causados pelo poluente. Mudas das duas espécies foram submetidas a nevoeiro simulado com fluoreto de potássio. O acúmulo de fluoreto na matéria seca foi mensurado com eletrodo específico em folhas lavadas e não lavadas, infundidas e não infundidas. O percentual de flúor disponibilizado nos chás foi superior para capim-cidreira, embora essa espécie apresente acúmulo de flúor menor que o boldo-gambá. Não foram observados sintomas visuais nas folhas das espécies estudadas, mas ao microscópio eletrônico de varredura, constatou-se a alteração da turgidez das células epidérmicas, ruptura da cutícula e deformação de estômatos e tricomas. O elevado teor de fluoreto nas folhas de C. citratus e P. neochilus e a ausência de sintomas visuais evidenciam que as espécies são tolerantes ao poluente. A lavagem das folhas em água é ineficiente para a remoção do flúor. O acúmulo e a liberação diferenciais de flúor estão relacionados às características morfoanatômicas das espécies analisadas.

Análise dosimétrica de acompanhantes de pacientes de medicina nuclear internados em quarto terapêutico

OBJETIVO: Este trabalho avaliou doses recebidas por acompanhantes que compartilharam o mesmo quarto terapêutico com pacientes tratados com câncer de tireóide ingerindo iodo-131 (131I) e comparou os resultados obtidos aos limites determinados pelas normas brasileiras de radioproteção. MATERIAIS E MÉTODOS: Avaliaram-se seis grupos de pessoas. Cada grupo foi formado por um acompanhante e um paciente, que compartilharam o mesmo quarto terapêutico. Realizaram-se, também, 23 outros experimentos, sendo que nestes um simulador foi usado em substituição à segunda pessoa no quarto terapêutico. As atividades de 131I administradas aos pacientes foram de 3.700 MBq ou 5.550 MBq. Dosímetros termoluminescentes na forma de pó, fluoreto de lítio dopado com magnésio, titânio e sódio foram usados para a avaliação das doses. RESULTADOS: Os resultados mostraram que uma pessoa que compartilha o mesmo quarto terapêutico, durante dois dias, com um paciente tratado com 3.700 MBq ou 5.550 MBq de 131I, seguindo as orientações de radioproteção fornecidas pela equipe médica, é exposta a uma dose média de (0,51 ± 0,02) mSv, para um nível de confiança de 99%. CONCLUSÃO: De acordo com as normas brasileiras, do ponto de vista da radioproteção, não há impedimento acompanhar um paciente de medicina nuclear durante esse tratamento.

Redução de incertezas em radioterapia utilizando simulação Monte Carlo: análise espectral aplicada à correção de dose absorvida

OBJETIVO: Determinar, por simulação Monte Carlo, os espectros de feixes de cobaltoterapia em profundidade na água e fatores de correção para doses absorvidas em dosímetros termoluminescentes de fluoreto de lítio. MATERIAIS E MÉTODOS: As simulações dos espectros secundários da fonte clínica de cobalto-60 foram realizadas com o código Monte Carlo PENELOPE, em diversas profundidades na água. Medidas experimentais de dose profunda foram obtidas com dosímetros termoluminescentes e câmara de ionização em condições de referência em radioterapia. Os fatores de correção para os dosímetros termoluminescentes foram obtidos através da razão entre as absorções relativas ao espectro de baixa energia e ao espectro total. RESULTADOS: A análise espectral em profundidade revelou a existência de espectros secundários de baixa energia responsáveis por uma parcela significativa da deposição de dose. Foram observadas discrepâncias de 3,2% nas doses medidas experimentalmente com a câmara de ionização e com os dosímetros termoluminescentes. O uso dos fatores de correção nessas medidas permitiu diminuir a discrepância entre as doses absorvidas para, no máximo, 0,3%. CONCLUSÃO: Os espectros simulados permitem o cálculo de fatores de correção para as leituras de dosímetros termoluminescentes utilizados em medidas de dose profunda, contribuindo para a redução das incertezas associadas ao controle de qualidade de feixes clínicos em radioterapia.

Estudos histomorfométrico e histológico das lesões ósseas causadas por flúor em aves

Fluoreto de sódio foi administrado na água de 2 grupos de 25 aves, fêmeas, da raça Shaver. O grupo A recebeu flúor do 1 ao 120 dia de idade e o grupo B do 61 ao 120 dia de idade. Cada grupo foi dividido em 5 níveis de tratamento: 0, 25, 50, 200 e 400 ppm de flúor, com 5 animais por tratamento. Todos os animais foram sacrificados aos 120 dias de idade. Para o estudo histomorfométrico foram coletados o fêmur e a tíbia esquerdos, e para o estudo histológico foram coletados fêmur e tíbia direitos. No estudo histomorfométrico do osso compacto observou-se um discreto aumento da porosidade cortical, que não foi estatisticamente significativo. A espessura do osso cortical aumentou nos animais tratados com flúor (p<0,05, r2 = 0,59). No osso trabecular, do grupo A, houve um aumento da espessura trabecular (ET) (p<0,05, r2 = 0,63) e do volume trabecular ósseo (VTO) (p<0,05, r2 = 0,72) até a dose de 200 ppm; e, na dose de 400 ppm, ocorreu um decréscimo, demonstrado pela regressão quadrática obtida na análise de regressão. No grupo B houve um aumento progressivo da ET (p<0,05, r2 = 0,98) e do VTO (p<0,05, r2 = 0,77) diretamente relacionado com a dose de flúor. A superfície de osteóide (SO) apresentou, também, um aumento gradativo relacionado com a dose, nos animais tratados com flúor (p<0,001, r2 = 0,80). Esses resultados sugerem que o flúor estimula a função osteoblástica, resultando em aumento da SO, e consequentemente maior aposição óssea. No entanto, nos animais tratados com 400 ppm, durante 120 dias, esse estímulo sobre a aposição óssea não foi tão evidente, sugerindo que o flúor determina alguma alteração funcional sobre os osteoblastos ou um aumento da reabsorção óssea. Histologicamente, observou-se espessamento trabecular nos animais tratados com flúor, mais marcado nas doses de 200 e 400 ppm, em ambos os grupos. Sobre a superfície trabecular, dos animais tratados com 200 e 400 ppm, evidenciou-se, principalmente, osteoblastos ativos e osteoclastos, sugerindo um aumento da remodelação óssea. No osso cortical observou-se diminuição dos canais de Havers, próximos a superfície periosteal, e aumento das lacunas de reabsorção próximas a superfície endosteal.

Gramíneas bioindicadoras da presença de flúor em regiões tropicais

Dez espécies de gramíneas tropicais Andropogon gayanus Kunth cv. Planaltina, Panicum maximum Jacq. cv. Colonião, Panicum maximum Jacq. cv. Tobiatã, Chloris gayana Kunth, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, Paspalum notatum Flug. cv. Pensacola, Hiparrhenia rufa (Nees.) Stapf., Melinis minutiflora Pal. de Beauv., Brachiaria decumbens Stapf., Brachiaria humidicola (Rendle) Schw. e Lolium multiflorum ssp. italicum var. lema foram tratadas com chuva simulada, contendo 5, 10 e 15 g.m-3 de flúor, visando avaliar a sensibilidade relativa e o potencial bioindicador de cada espécie para regiões tropicais. As plantas foram cultivadas sob técnicas padronizadas para a bioindicação ativa. Os efeitos do flúor foram avaliados pelos danos visuais, acúmulo e distribuição do flúor nas plantas e produção de matéria seca. Todas as espécies mostraram padrões de acúmulo diferenciados, teores acima do nível considerado tóxico para plantas sensíveis (30 µg.g-1) e boa relação entre o teor de flúor na planta e os índices de fitotoxicidade, com exceção de Brachiaria humidicola. As espécies que melhor se adaptaram às técnicas de cultivo padronizado, por suas taxas de crescimento, homogeneidade das rebrotas e velocidade de resposta (necrose e clorose) foram Chloris gayana e Panicum maximum cv. Colonião. Nestas duas espécies com maior potencial de bioindicação, foram avaliados também os efeitos do flúor sobre a condutância estomática, a assimilação de CO2 e a produção de matéria seca. Os resultados obtidos caracterizam o Panicum maximum cv. Colonião como bioindicador de resposta e Chloris gayana como espécie tolerante, semelhante a L. multiflorum.

Detection of the basement membrane-degrading proteolytic activity of Paracoccidioides brasiliensis after SDS-PAGE using agarose overlays containing Abz-MKALTLQ-EDDnp

We have characterized, in the Paracoccidioides brasiliensis yeast phase, an exocellular SH-dependent serine proteinase activity against Abz-MKRLTL-EDDnp and analogous fluorescent-quenched peptides, and showed that it is also active against constituents of the basement membrane in vitro. In the present study, we separated the components of P. brasiliensis culture filtrates by electrophoresis and demonstrated that the serine-thiol exocellular proteinase has a diffuse and heterogeneous migration by SDS-PAGE, localizing in a region between 69 and 43 kDa. The hydrolytic activity was demonstrable after SDS-PAGE using buffered agarose overlays of Abz-MKALTLQ-EDDnp, following incubation at 37oC, and detection of fluorescent bands with a UV transilluminator. Hydrolysis was more intense when incubation was carried out at basic pH, and was completely inhibited with 2.5 mM PMSF and partially with sodium 7-hydroxymercuribenzoate (2.5 mM p-HMB), suggesting its serine-thiol nature. A proteolytic band with similar characteristics was observed in conventional gelatin zymograms, but could not be correlated with a silver-stained component. Detection of the serine-thiol proteinase in substrate gels after SDS-PAGE provides a useful way of monitoring purification of the basement membrane degrading enzyme.

Avaliação físico-química de águas minerais comercializadas na região de Campinas, SP

Com o objetivo de avaliar a qualidade de águas minerais, foram analisadas amostras, adquiridas em supermercados, de oito fontes localizadas no Estado de São Paulo entre agosto de 1999 e maio de 2000, com coletas trimestrais. Os resultados das análises físico-químicas mostraram que as amostras possuíam, em sua maioria, composição química dentro dos limites permitidos pela legislação brasileira, exceto quatro amostras, que apresentaram resultados na análise de cor acima de 5 unidades PtCo, uma amostra com pH fora da faixa recomendada de 4,0 a 9,0 e uma amostra com alcalinidade em hidróxidos em duas épocas de análise. Os resultados obtidos para as diferentes amostras variaram de acordo com as seguintes faixas: pH de 6,39 a 9,92, alcalinidade de 0,0 a 189,1mg L-1 de bicarbonato, dureza de 0,00 a 136,00mg L-1 de carbonato de cálcio, cor de 0,0 a 9,0 unidades de PtCo, turbidez de 0,00 a 2,00 FTU de turvação, sulfato de 0,00 a 55,67mg L-1, sulfeto de 0,00 a 0,002mg L-1, cloreto de 0,00 a 23,53mg L-1, fluoreto de 0,02 a 0,8mg L-1, alumínio de 0,01 a 0,09mg L-1, bário de 0,00 a 0,26mg L-1, cálcio de 0,53 a 28,35mg L-1, crômio de 0,00 a 0,01mg L-1, ferro de 0,00 a 0,03mg L-1, potássio de 0,39 a 3,27mg L-1, sódio de 0,53 a 97,29mg L-1, magnésio de 0,00 a 9,10mg L-1, manganês de 0,00 a 0,05mg L-1, zinco de 0,00 a 0,03mg L-1, chumbo de 0,00 a 0,01mg L-1 e lítio de 0,00 a 0,02mg L-1. Os elementos cádmio, cobre e cobalto apresentaram-se abaixo dos limites de detecção dos métodos.

Protease inhibitor from Moringa oleifera leaves: Isolation, purification, and characterization

Protease inhibitors have great demand in medicine and biotechnology. We report here the purification and characterization of a protease inhibitor isolated from mature leaf extract of Moringa oleifera that showed maximum inhibitor activity. The protease inhibitor was purified to 41.4-fold by Sephadex G75 and its molecular mass was calculated as 23,600 Da. Inhibitory activity was confirmed by dot-blot and reverse zymogram analyses. Glycine, glutamic acid, alanine, proline and aspartic acid were found as the major amino acids of the inhibitor protein. Maximal activity was recorded at pH 7 and at 40 ◦C. The inhibitor was stable over pH 5–10; and at 50 ◦C for 2 h. Thermostability was promoted by CaCl2, BSA and sucrose. Addition of Zn2+ and Mg2+, SDS, dithiothreitol and -mercaptoethanol enhanced inhibitory activity, while DMSO and H2O2 affected inhibitory activity. Modification of amino acids at the catalytic site by PMSF and DEPC led to an enhancement in the inhibitory activity. Stoichiometry of trypsin–protease inhibitor interaction was 1:1.5 and 0.6 nM of inhibitor effected 50% inhibition. The low Ki value (1.5 nM) obtained indicated scope for utilization of M. oliefera protease inhibitor against serine proteases