Clonagem molecular, expressão, purificação e caracterização estrutural da endoglucanase de Trichoderma harzianum visando o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para a produção de etanol lignocelulósico

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas.

Obtenção de organovermiculitas utilizando tensoativos e microemulsões e suas aplicações na separação de isômeros do Xileno

Surfactants are versatile organic compounds that have, in a single molecule, double chemical affinity. The surfactant molecule is composed by a hy drophobic tail group, a hydrocarbon chain (linear, branched, or mixed), and by a hydrophilic head group, which contains polar groups that makes it able to be applied in the organophilization process of natural clays. Microemulsions are microheterogeneous b lends composed by: a surfactant, an oily phase (non - polar solvent), an aqueous phase, and, sometimes, a co - surfactant (short - chain alcohol). They are systems with thermodynamic stability, transparent, and have high solubility power. Vermiculite is a clay m ineral with an expandable crystalline structure that has high cation exchange capacity. In this work vermiculite was used to obtain organoclays. The ionic surfactants dodecyl ammonium chlori de (DDAC) and cetyltrimethylammonium bromide (C 16 TAB) were used in the organophilization process. They were used as surfactant aqueous solutions and, for DDAC, as a microemulsion system. The organoclays were used to promote the separation of binary mixtures of xylene isomers (ortho - and meta - xylene). Dif ferent analytical techniques were used to characterize microemulsion systems and also the nanoclays. It was produced a water - rich microemulsion system with 0.92 nm droplet average diameter. The vermiculite used in this work has a cationic exchange capacity of 172 meq/100g and magnesium as main cation (24.25%). The basal spacing of natural vermiculite and organo - vermiculites were obtained by X - ray Diffraction technique. The basal spacing was 1.48nm for natural vermiculite, 4.01nm for CTAB - vermiculite (CTAB 4 ) , and 3.03nm for DDAC - vermiculite (DDAC M1A), that proves the intercalation process. Separation tests were carried out in glass columns using three binary mixtures of xylene (ortho - xylene and meta - xylene). The results showed that the organovermiculite pre sented an enhanced chemical affinity by the mixture of hydrocarbons, when compared with the natural vermiculite, and also its preference by ortho - xylene. A factorial experimental design 2 2 with triplicate at the central point was used to optimize the xylen e separation process. The experimental design revealed that the initial concentration of isomers in the mixture and the mass of organovermiculite were the significant factors for an improved separation of isomers. In the experiments carried out using a bin ary mixture of ortho - xylene and meta - xylene (2:1), after its percolating through the organovermiculite bed (DDAC M1), it was observed the preference of the organoclay by the ortho - xylene isomer, which was retained in greater quantity than the meta - xylene o ne. At the end of the treatment, it was obtained a final concentration in meta - xylene of 47.52%.

FTE-LEACH: um protocolo energeticamente eficiente e tolerante a falhas aplicado às redes industriais de sensores sem fio

A Wireless Sensor Network (WSN) consists of distributed devices in an area in order to monitor physical variables such as temperature, pressure, vibration, motion and environmental conditions in places where wired networks would be difficult or impractical to implement, for example, industrial applications of difficult access, monitoring and control of oil wells on-shore or off-shore, monitoring of large areas of agricultural and animal farming, among others. To be viable, a WSN should have important requirements such as low cost, low latency, and especially low power consumption. However, to ensure these requirements, these networks suffer from limited resources, and eventually being used in hostile environments, leading to high failure rates, such as segmented routing, mes sage loss, reducing efficiency, and compromising the entire network, inclusive. This work aims to present the FTE-LEACH, a fault tolerant and energy efficient routing protocol that maintains efficiency in communication and dissemination of data.This protocol was developed based on the IEEE 802.15.4 standard and suitable for industrial networks with limited energy resources

Estudo comparativo do comportamento mecânico de materiais compósitos à base de polímeros líquido-cristalinos

Os materiais compósitos à base de polímeros líquido-cristalinos sofreram um grande desenvolvimento nas três últimas décadas, com uma vasta utilização pela indústria, nomeadamente a aeronáutica e aeroespacial. Este trabalho, numa primeira fase desenvolveu-se com base numa pesquisa bibliográfica que tinha como principal objectivo conhecer o estado da arte dos polímeros líquido-cristalinos (PLC’s) e suas aplicações em materiais compósitos. Foi realizado um estudo bibliográfico das propriedades mecânicas dos principais sistemas de compósitos termoendurecíveis e termoplásticos de forma a criar um enquadramento do tema a desenvolver. Realizou-se também uma pesquisa sobre os mais recentes desenvolvimentos relativos às aplicações dos PLC’s na indústria aeronáutica e aeroespacial, com o estudo a incidir sobre as mais recentes aplicações em projectos desenvolvidos nomeadamente pela NASA. O trabalho foi direccionado para o estudo do Kevlar, desde a sua produção, à caracterização das suas principais propriedades mecânicas e aplicações industriais, com principal interesse nas aplicações em materiais compósitos. Particular atenção foi dada aos problemas que podem afectar o desempenho dos laminados produzidos com reforço de Kevlar. Neste trabalho os compósitos pré-impregnados foram estudados tendo em conta a sua caracterização em função das formas de empilhamento e das suas propriedades mecânicas. Foram consideradas neste estudo as normas ASTM (American Society for Testing and Materials) relativas aos ensaios a realizar, em particular o seu campo de aplicação e a metodologia dos ensaios para determinação das propriedades mecânicas dos compósitos. Neste trabalho é realizado um estudo comparativo sobre as propriedades mecânicas quando ocorrem, ou não, defeitos nos laminados. Foram realizados ensaios não destrutivos por ultra-sons de forma a garantir a qualidade do laminado para a produção dos provetes, assim como para a confirmação da correcta localização dos defeitos induzidos. No trabalho experimental, realizaram-se ensaios à tracção, à fadiga, à compressão e à flexão, com o fim de comparar grupos de provetes, com e sem defeitos, e caracterizar as variações das propriedades mecânicas. São abordados os factores que influenciam o desempenho de um laminado de Kevlar e os factores que desencadeiam a sua deterioração. A delaminação é um grave problema que afecta os laminados e que limita o seu desempenho. O estudo demonstrou que um dos principais problemas nos laminados de compósitos à base de polímeros líquido-cristalinos é a fadiga.

Contribuição da fluorescência de Raios–X na avaliação e modelação de georrecursos

O presente estudo diz respeito a um trabalho de pesquisa no âmbito de uma Tese de Mestrado compreendida no segundo ciclo de estudos do curso de Engenharia Geotécnica e Geoambiente, realizado sobre a contribuição da Fluorescência de Raios – X (FRX) no Zonamento de Georrecursos, com particular ênfase para a utilização do instrumento portátil e de ferramentas tecnológicas de vanguarda, indispensáveis à prospecção e exploração dos recursos minerais, designadamente na interpretação e integração de dados de natureza geológica e na modelação de métodos de exploração e processamento /tratamento de depósitos minerais, assim como do respectivo controlo. Esta dissertação discute os aspectos fundamentais da utilização da técnica de Fluorescência de Raios-X (portátil, FRXP), quanto à sua possibilidade de aplicação e metodologia exigida, com vista à definição de zonas com características químicas análogas do georrecurso e que preencham as exigências especificadas para a utilização da matéria-prima, nas indústrias consumidoras. Foi elaborada uma campanha de recolha de amostras de calcário proveniente da pedreira do Sangardão, em Condeixa–a–Nova, que numa primeira fase teve como objectivo principal a identificação da composição química da área em estudo e o grau de precisão do aparelho portátil de FRX. Para além desta análise foram, também, realizadas análises granulométricas por peneiração e sedimentação por Raios-X a amostras provenientes das bacias de sedimentação e do material passado no filtro prensa. Validado o método de análise por FRXP, realizou-se uma segunda fase deste trabalho, que consistiu na elaboração de uma amostragem bastante significativa de pontos, onde se realizaram análises por FRXP, de forma a obter uma maior cobertura química da área em estudo e localizar os locais chave de exploração da matéria-prima. Para uma correcta leitura dos dados analisados recorreu-se a ferramentas aliadas às novas tecnologias, as quais se mostraram um importante contributo para uma boa gestão do georrecurso em avaliação, nomeadamente o “XLSTAT” e o “Surfer” para tratamento estatístico dos dados e modelação, respectivamente.

Efeito de alterações geométricas na resistência de juntas de sobreposição

A utilização de juntas coladas em aplicações industriais tem vindo a aumentar nos últimos anos, em detrimento dos métodos tradicionais de ligação tais como a soldadura, brasagem, ligações aparafusadas e rebitadas. As juntas de sobreposição simples são o tipo de juntas mais frequentemente utilizadas em aplicações industriais, porque são as mais simples de fabricar. No entanto, a aplicação descentrada da carga neste tipo de junta provoca efeitos de flexão que originam o aparecimento de tensões normais na direção da espessura do adesivo (arrancamento), reduzindo assim a resistência da junta colada. De uma maneira geral, existem dois tipos de métodos para reduzir as concentrações de tensões. O primeiro é utilizar alterações no próprio material, otimizando as propriedades do adesivo e do substrato, enquanto o segundo método envolve alterar a geometria da junta, como por exemplo utilizando filetes de adesivo, chanfros nas extremidades dos substratos, aplicar uma geometria ondulada ou dobrar os substratos na zona de sobreposição, ou ainda utilizar rasgos nos substratos ao longo da sobreposição. Neste trabalho é realizado um estudo experimental e numérico por Elementos Finitos de duas alterações efetuadas à geometria de juntas de sobreposição simples, de modo a aumentar a sua resistência comparativamente às juntas sem alteração geométrica. A primeira condição efetuada foi a utilização de rasgos nas extremidades do comprimento de sobreposição e a segunda foi a utilização de rasgos a meio do comprimento de sobreposição. No final do estudo experimental, verificou-se que a resistência da ligação foi significativamente melhorada com algumas das configurações testadas para cada alteração, e foi possível estabelecer em ambos os casos a configuração ótima. Numa fase posterior, procedeu-se à simulação numérica, que incluiu uma análise de tensões e previsão do comportamento das juntas através de modelos de dano coesivo. A análise permitiu obter os modos de rotura, as curvas força-deslocamento e a resistência das juntas. Obteve-se uma concordância bastante boa com os resultados experimentais, o que mostrou a adequabilidade do método de previsão proposto para estimar o comportamento das juntas.

Controlo preditivo sobre redes de sensores e actuadores sem fios com tolerância a falhas de comunicação

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Influência do tipo de adesivo em juntas híbridas soldadas-adesivas

A necessidade de utilizar métodos de ligação entre componentes de forma mais rápida, eficaz e com melhores resultados, tem causado a crescente utilização das juntas adesivas, em detrimento dos métodos tradicionais de ligação tais como a soldadura, brasagem, ligações aparafusadas e rebitadas. A utilização das juntas adesivas tem vindo a aumentar em diversas aplicações industriais por estas apresentarem vantagens das quais se destacam a redução de peso, redução de concentrações de tensões e facilidade de fabrico. No entanto, também apresentam desvantagens, como a necessidade de preparação das juntas e o descentramento da carga aplicada que provoca efeitos de flexão, os quais dão origem a tensões normais na direcção da espessura do adesivo (tensões de arrancamento), afectando assim a resistência da junta. A combinação da ligação adesiva com a soldadura por pontos permite algumas vantagens em comparação com as juntas adesivas tradicionais como a maior resistência, aumento da rigidez, melhor resistência ao corte e arrancamento e também à fadiga. Neste trabalho é apresentado um estudo experimental e numérico de juntas de sobreposição simples adesivas e híbridas (adesivas-soldadas). Os adesivos utilizados são o Araldite AV138®, apresentado como sendo frágil, e os adesivos Araldite 2015® e Sikaforce® 7752, intitulados como adesivos dúcteis. Foram considerados substratos de aço (C45E) em juntas com diferentes comprimentos de sobreposição ( ), que foram sujeitas a esforços de tracção. Foi realizada uma análise dos valores experimentais e efectuada uma comparação destes valores com os resultados obtidos por Elementos Finitos (EF) no software ABAQUS®, que incluiu uma análise de tensões na camada de adesivo e previsão do comportamento das juntas por Modelos de Dano Coesivo (MDC). A análise por MDC permitiu obter os modos de rotura, as curvas força-deslocamento e a resistência das juntas com bastante precisão, com excepção das juntas coladas com o adesivo Sikaforce® 7752. Estes resultados permitiram validar a técnica de modelação proposta para as juntas coladas e híbridas, o que representa uma base para posterior aplicação desta técnica em projecto, com as vantagens decorrentes da redução do tempo de projecto e maior facilidade de optimização.

Estudo de reparações adesivas pela técnica de remendo embebido com reforços exteriores para aumento da resistência

As ligações adesivas têm sido utilizadas em áreas como a indústria aeroespacial, aeronáutica, de defesa, automóvel, da construção civil e das madeiras. As juntas adesivas têm vindo a substituir métodos como a soldadura, e ligações parafusadas e rebitadas, devido à facilidade de fabricação, maiores cadências de produção, menores custos, facilidade em unir materiais diferentes, melhor resistência à fadiga, entre outras razões. Como tal, também se utilizam reparações adesivas para restituição da resistência de estruturas danificadas, cujas técnicas mais comuns são a sobreposição simples, sobreposição dupla e remendo embebido. As reparações por remendo embebido, que são as mais eficientes, consistem na realização de um furo cónico na zona danificada e colagem de um remendo com a forma complementar do furo, de tal forma que não é alterada a forma inicial do componente. Neste trabalho pretende-se estudar experimental e numericamente reparações adesivas por remendo embebido, nomeadamente o efeito da utilização de reforços exteriores (em um ou nos dois lados da estrutura), para diferentes ângulos de inclinação. Foi considerado um adesivo dúctil (Araldite® 2015) e outro frágil (Araldite® AV138), o que permitiu abranger processos de rotura bastante distintos. O estudo experimental é acompanhado por outro numérico no software ABAQUS®, usando modelos coesivos para a previsão numérica da resistência das reparações. O trabalho numérico permitiu o estudo das distribuições de tensões, o que possibilitou a análise detalhada dos resultados obtidos. Foi também realizado um estudo numérico de otimização das reparações por alteração da espessura dos reforços e utilização de chanfro nas extremidades dos mesmos. Nos resultados obtidos, constatou-se a adequabilidade do método numérico na previsão fiável da resistência, e também que a utilização dos reforços aumenta consideravelmente o rendimento das reparações (até 530 % e 340 % para os adesivos Araldite® 2015 e AV138, respetivamente), o que poderá justificar a sua utilização em aplicações industriais em que a perturbação aerodinâmica causada por esta alteração não seja relevante.

Aplicação de métodos numéricos avançados para a previsão de resistência de ligações adesivas

Com a necessidade de encontrar uma forma de ligar componentes de forma mais vantajosa, surgiram as ligações adesivas. Nos últimos anos, a utilização de juntas adesivas em aplicações industriais tem vindo a aumentar, substituindo alguns métodos de ligação tradicionais, por apresentarem vantagens tais como, redução de concentração de tensões, reduzido peso e facilidade de processamento/fabrico. O seu estudo permite prever a sua resistência e durabilidade. Este trabalho refere-se ao estudo de juntas de sobreposição simples (JSS), nas quais são aplicados os adesivos comerciais que variam desde frágeis e rígidos, como o caso do Araldite® AV138, até adesivos mais dúcteis, como o Araldite® 2015 e o Sikaforce® 7888. Estes são aplicados em substratos de alumínio (AL6082-T651) em juntas com diferentes geometrias e diferentes comprimentos de sobreposição (L), sendo sujeitos a esforços de tracção. Foi feita uma análise dos valores experimentais fornecidos e uma posterior comparação destes com diferentes métodos numéricos baseados em Elementos Finitos (EF). A comparação foi feita por uma análise de Modelos de Dano Coesivo (MDC) e segundo os critérios baseados em tensões e deformações do Método de Elementos Finitos Extendido (MEFE). A utilização destes métodos numéricos capazes de simular o comportamento das juntas poderá levar a uma poupança de recursos e de tempo. A análise por MDC revelou que este método é bastante preciso, excepto para os adesivos que sejam bastante dúcteis. A aplicação de uma outra lei coesiva pode solucionar esse problema. Por sua vez a análise por MEFE demonstrou que esta técnica não é particularmente adequada para o crescimento de dano em modo misto e, comparativamente com o MDC, a sua precisão é bastante inferior.

Determinação da tenacidade à fratura de adesivos estruturais em modo misto pelo ensaio Single-Leg Bending

A utilização de juntas adesivas em aplicações industriais tem vindo a aumentar, em detrimento dos métodos tradicionais tais como a soldadura, brasagem e ligações aparafusadas e rebitadas. Este facto deve-se às vantagens que estas oferecem, como o facto de serem mais leves, comportarem-se bem sob cargas cíclicas ou de fadiga, a ligação de materiais diferentes e menores concentrações de tensões. Para aumentar a confiança no projeto de estruturas adesivas, é importante conseguir prever com precisão a sua resistência mecânica e respetivas propriedades de fratura (taxa crítica de libertação de energia de deformação à tração, GIC, e corte, GIIC). Estas propriedades estão diretamente relacionadas com a Mecânica da Fratura e são estimadas através de uma análise energética. Para este efeito, distinguem-se três tipos de modelos: modelos que necessitam da medição do comprimento de fenda durante a propagação do dano, modelos que utilizam um comprimento de fenda equivalente e métodos baseados no integral J. Como na maioria dos casos as solicitações ocorrem em modo misto (combinação de tração com corte), é de grande importância a perceção da fratura nesta condições, nomeadamente das taxas de libertação de energia relativamente a diferentes critérios ou envelopes de fratura. Esta comparação permite, por exemplo, averiguar qual o melhor critério energético de rotura a utilizar em modelos numéricos baseados em Modelos de Dano Coesivo. Neste trabalho é realizado um estudo experimental utilizando o ensaio Single-Leg Bending (SLB) em provetes colados com três tipos de adesivos, de forma a estudar e comparar as suas propriedades de fratura. Para tal, são aplicados alguns modelos de redução da taxa de libertação de energia de deformação à tração, GI, e corte, GII, enquadrados nos modelos que necessitam da medição do comprimento de fenda e nos modelos que utilizam um comprimento de fenda equivalente. Numa fase posterior, procedeu-se à análise e comparação dos resultados adquiridos durante a fase experimental de GI e GII de cada adesivo. A discussão de resultados foi também feita através da análise dos valores obtidos em diversos envelopes de fratura, no sentido de averiguar qual o critério de rotura mais adequado a considerar para cada adesivo. Foi obtida uma concordância bastante boa entre métodos de determinação de GI e GII, com exceção do adesivo mais dúctil, para o qual o método baseado no comprimento de fenda equivalente apresentou resultados ligeiramente superiores.

Estudo e otimização de juntas do tipo Tpeel soldadas, adesivas e híbridas

A necessidade de utilizar métodos de ligação que melhor satisfaçam as necessidades de projeto tem causado a crescente utilização das juntas adesivas, em detrimento dos métodos tradicionais tais como a soldadura, ligações aparafusadas e rebitadas. A sua utilização em diversas aplicações industriais justifica-se pela redução de peso, redução de concentrações de tensões, isolamento acústico e melhor resistência à corrosão. Contudo, também apresentam desvantagens, como a necessidade de preparação das juntas, a fraca resistência a esforços de arrancamento e a complexidade da previsão da sua resistência. As juntas híbridas são obtidas por combinação de uma técnica tradicional com uma ligação adesiva. As juntas híbridas adesivas-soldadas obtêm-se através da combinação da ligação adesiva com a ligação soldada, sendo a soldadura de resistência por pontos a técnica de soldadura mais usada no fabrico deste tipo de juntas. A sinergia entre ligação adesiva e soldadura por pontos oferece vantagens competitivas em relação às ligações adesivas, tais como superior resistência e rigidez, e maior resistência ao arrancamento e à fadiga. No presente trabalho é apresentado um estudo experimental e numérico de juntas T-peel soldadas, adesivas e híbridas (adesivas-soldadas) solicitadas ao arrancamento. Considerouse o adesivo frágil Araldite® AV138 e os adesivos dúcteis Araldite® 2015 e Sikaforce® 7752 e aderentes de aço (C45E). Foi realizada uma análise dos valores experimentais e efetuada uma comparação destes valores com os resultados obtidos pelo Método de Elementos Finitos (MEF) no software ABAQUS®, que incluiu uma análise de tensões na camada de adesivo e previsão do comportamento das juntas por MDC. Observou-se que, dos três adesivos em estudo, o adesivo Sikaforce® 7752 é o que apresenta o melhor desempenho na ligação de juntas T-peel. A boa concordância entre os resultados experimentais e numéricos permitiu validar a utilização de MDC para previsão da resistência de juntas T-peel adesivas e híbridas. Assim, o presente trabalho representa uma base para posterior aplicação no projeto deste tipo de ligação, com as vantagens decorrentes na redução do tempo de projeto e maior facilidade de otimização.

Estudo da resistência e mecanismos de dano em juntas adesivas entre materiais compósitos com defeitos de adesão

A necessidade de utilizar métodos de ligação entre componentes de forma mais rápida, eficaz e com melhores resultados tem causado a crescente utilização das juntas adesivas, em detrimento dos métodos tradicionais de ligação. A utilização das juntas adesivas tem vindo a aumentar em diversas aplicações industriais por estas apresentarem vantagens, das quais se destacam a redução de peso, redução de concentrações de tensões e facilidade de fabrico. No entanto, uma das limitações das juntas adesivas é a dificuldade em prever a resistência da junta após fabrico e durante a sua vida útil devido à presença de defeitos no adesivo. Os defeitos são normalmente gerados pela preparação inadequada das juntas ou degradação do adesivo devido ao ambiente (por exemplo, humidade), reduzindo a qualidade da ligação e influenciando a resistência da junta. Neste trabalho é apresentado um estudo experimental e numérico de juntas de sobreposição simples (JSS) com a inclusão de defeitos centrados na camada de adesivo para comprimentos de sobreposição (LO) diferentes. Os adesivos utilizados foram o Araldite® AV138, apresentado como sendo frágil, e o adesivo Sikaforce® 7752, intitulado como adesivo dúctil. A parte experimental consistiu no ensaio à tração das diferentes JSS permitindo a obtenção das curvas força-deslocamento (P-δ). A análise numérica por modelos de dano coesivo (MDC) foi realizada para analisar as tensões de arrancamento ((σy) e as tensões de corte (τxy) na camada adesiva, para estudar a variável de dano do MDC durante o processo de rotura e para avaliar a capacidade dos MDC na previsão da resistência da junta. Constatou-se um efeito significativo dos defeitos de diferentes dimensões na resistência das juntas, que também depende do tipo de adesivo utilizado e do valor de LO. Os modelos numéricos permitiram a descrição detalhada do comportamento das juntas e previsão de resistência, embora para o adesivo dúctil a utilização de uma lei coesiva triangular tenha provocado alguma discrepância relativamente aos resultados experimentais.

Compostos bioactivos provenientes de sedimentos marinhos: prodigiosinas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

DNA damage induced by acrylamide: roe of genetic polymorphisms in DNA damage levels

RESUMO:Em 1994 a acrilamida (AA) foi classificada pela IARC como um provável cancerígeno para o homem. Para além da utilização de AA em numerosas aplicações industriais, a AA está também presente numa grande variedade de alimentos ricos em amido e processados a temperaturas elevadas. Esta exposição através da ingestão de produtos alimentares despoletou elevadas preocupações ao nível do risco para a saúde pública e poderá implicar um risco adicional para o aparecimento de cancro. A glicidamida (GA), o metabolito epóxido formado a partir da oxidação da AA provavelmente através do citocromo P450 2E1, é considerada por vários estudos, o principal responsável pela carcinogenicidade da AA. Actualmente existe uma escassez de resultados relativamente aos mecanismos de genotoxicidade da AA e GA em células de mamífero. Por este motivo, o objectivo deste estudo centra-se na avaliação das consequências genéticas da exposição à AA e GA, recorrendo-se para tal ao uso de células de mamífero como modelo. Tendo como base este objectivo avaliou-se a citotoxicidade da AA e GA, através do ensaio do MTT, e realizaram-se dois testes citogenéticos, o teste das aberrações cromossómicas (CAs) e o teste da troca de cromátides irmãs (SCEs), de modo a avaliar as lesões de DNA induzidas por estes compostos em células de hamster Chinês V79. Os resultados globalmente mostraram que a GA é mais citotóxica e clastogénica do que a AA. No âmbito deste trabalho, foi também efectuada a quantificação de aductos específicos de DNA, nomeadamente N7-(2-carbamoil-2-hidroxietil)guanina (N7-GA-Gua) e N3-(2-carbamoil-2-hidroxietil)adenina (N3-GA-Ade). Os resultados obtidos permitem afirmar que os níveis de N7-GA-Gua e a concentração de GA apresentam uma relação linear dose-resposta. Foi também identificada uma óptima correlação entre os níveis de N7-GA-Gua e a frequência de troca de cromátides irmãs. Adicionalmente, e de forma a compreender os mecanismos de toxicidade da AA, estudaram-se os mecanismos dependentes da modulação do glutationo reduzido (GSH), nomeadamente da butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da síntese de GSH, do GSH-monoetil estér (GSH-EE), um composto permeável nas células e que é intra-celularmente hidrolisado a GSH e ainda do GSH adicionado exogenamente ao meio de cultura, em células V79. Os resultados obtidos reforçaram o papel da modulação do GSH nos efeitos de citotoxicidade e clastogenicidade da AA. Para além dos estudos efetuados com células V79, procedeu-se também à determinação da frequência de SCEs, à quantificação de aductos específicos de DNA, bem como ao ensaio do cometa alcalino em amostras de dadores saudáveis expostos à AA e GA. Tanto os resultados obtidos através do ensaio das SCE, como pela quantificação de aductos específicos de DNA, ambos efectuados em linfócitos estimulados, originaram resultados comparáveis aos obtidos anteriormente para as células V79, reforçando a ideia de que a GA é bastante mais genotóxica do que a AA. Por outro lado, os resultados obtidos pelo ensaio do cometa para exposição à AA e GA mostraram que apenas esta última aumenta o nível das lesões de DNA. Outro objectivo deste trabalho, foi a identificação de possíveis associações existentes entre as lesões de DNA, quantificadas através do ensaio das SCEs e do cometa, e biomarcadores de susceptibilidade, tendo em conta os polimorfismos genéticos individuais envolvidos na destoxificação e nas vias de reparação do DNA (BER, NER, HRR e NHEJ) em linfócitos expostos à GA. Tal permitiu identificar associações entre os níveis de lesão de DNA determinados através do ensaio das SCEs, e os polimorfismos genéticos estudados, apontando para uma possível associação entre o GSTP1 (Ile105Val) e GSTA2 (Glu210Ala) e a frequência de SCEs. Por outro lado, os resultados obtidos através do ensaio do cometa sugerem uma associação entre as lesões de DNA e polimorfismos da via BER (MUTYH Gln335His e XRCC1 Gln39Arg) e da via NER (XPC Ala499val e Lys939Gln), considerando os genes isoladamente ou combinados. Estes estudos contribuem para um melhor entendimento da genotoxicidade e carcinogenicidade da AA e GA em células de mamífero, bem como da variabilidade da susceptibilidade individual na destoxificação e reparação de lesões de DNA provocadas pela exposição a estes xenobióticos alimentares. ----------- ABSTRACT:Acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen by IARC. Besides being used in numerous industrial applications, AA is also present in a variety of starchy cooked foods. This AA exposure scenario raised concerns about risk in human health and suggests that the oral consumption of AA is an additional risk factor for cancer. A considerable number of findings strongly suggest that the reactive metabolite glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by cytochrome P450 2E1, plays a central role in AA carcinogenesis. Until now there are a scarcity of results concerning the mechanisms of genotoxicity of AA and GA in mammalian cells. In view of that, the study described in this thesis aims to unveil the genetic consequences of AA and GA exposure using mammalian cells as a model system. With this aim we evaluated the cytotoxicity of AA and GA using the MTT assay and subsequently performed two cytogenetic end-points: chromosomal aberrations (CAs) and sister chromatid exchanges (SCEs), in order to evaluate DNA damage induced by these compounds in V79 Chinese hamster cell line. The results showed that GA was more cytotoxic and clastogenic than AA. Within the scope of this thesis the quantification of specific DNA adducts were also performed, namely N7-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine (N7-GA-Gua) and N3-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenine (N3-GA-Ade). Interestingly, the GA concentration and the levels of N7-GA-Gua presented a linear dose-response relationship. Further, a very good correlation between the levels of N7-GA-Gua and the extent of SCEs were observed. In order to understand the mechanisms of AA-induced toxicity, the modulation of reduced glutathione (GSH)-dependent mechanisms were studied, namely the evaluation of the effect of buthionine sulfoximine (BSO), an effective inhibitor of GSH synthesis, of GSH-monoethyl ester (GSH-EE), a cell permeable compound that is intracellularly hydrolysed to GSH and also of GSH endogenously added to culture medium,z in V79 cell line. The overall results reinforced the role of GSH in the modulation of the cytotoxic and clastogenic effects induced by AA.Complementary to the studies performed in V79 cells, SCEs, specific DNA-adducts and alkaline comet assay in lymphocytes from healthy donors exposed to AA and GA were also evaluated. Both, the frequency of SCE and the quantification of specific GA DNA adducts, produced comparable results with those obtained in V79 cell line, reinforcing the idea that GA is far more genotoxic than AA. Further, the DNA damaging potential of AA and GA in whole blood leukocytes evaluated by the alkaline comet assay, showed that GA, but not AA, increases DNA damage. Additionally, this study aimed to identify associations between DNA damage and biomarkers of susceptibility, concerning individual genetic polymorphisms involved in detoxification and DNA repair pathways (BER, NER, HRR and NHEJ) on the GA-induced genotoxicity assessed by the SCE assay and by the alkaline comet assay. The extent of DNA damage determined by the levels of SCEs induced by GA seems to be modulated by GSTP1 (Ile105Val) and GSTA2 (Glu210Ala) genotypes. Moreover, the results obtained from the comet assay suggested associations between DNA damage and polymorphisms of BER (MUTYH Gln335His and XRCC1 Gln399Arg) and NER (XPC Ala499Val and Lys939Gln) genes, either alone or in combination. The overall results from this study contribute to a better understanding of the genotoxicity and carcinogenicity of AA and GA in mammalian cells, as well as the knowledge about the variability in individual susceptibility involved in detoxification and repair of DNA damage due to these dietary xenobiotics.